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文檔簡介
四
蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)(quaternarystructure)是指亞基間的空間排布、亞基間相互作用與接觸部位的布局,不包括亞基本身的空間結(jié)構(gòu)。亞基間以次級鍵相連,絕無共價鍵1.概念蛋白質(zhì)分子由兩條或兩條以上肽鏈組成,每條肽鏈各自形成了獨立的三級結(jié)構(gòu),分子中的每一個具有獨立三級結(jié)構(gòu)肽鏈,稱為亞基亞基(subunit)2.維持蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)的作用力主要是疏水作用次級鍵鹽鍵、氫鍵牛胰核糖核酸酶的變性與復性β-巰基乙醇尿素或鹽酸胍透析有活性無活性1.一級結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)功能相似一級結(jié)構(gòu)不同的蛋白質(zhì)功能不同胰島素的一級結(jié)構(gòu)及種屬差異(二)一級結(jié)構(gòu)與功能的關系ACTH促腎上腺素皮質(zhì)激素MSH促黑激素一級結(jié)構(gòu)不同的蛋白質(zhì)功能不同由4個亞基組成血紅蛋白功能:運輸O2二、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關系(一)肌紅蛋白Mb與血紅蛋白Hb蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)決定生物學功能肌紅蛋白(1個亞基)與血紅蛋白(4個亞基)且一級結(jié)構(gòu)有較大差異,但均具有與氧可逆地結(jié)合的能力其結(jié)構(gòu)特點是,都與血紅素(輔基)共價結(jié)合O2O2(二)血紅蛋白構(gòu)象變化與結(jié)合氧的能力變構(gòu)效應蛋白質(zhì)分子與它的配體結(jié)合后構(gòu)象發(fā)生變化,其功能也隨之變化的現(xiàn)象,稱為變構(gòu)效應協(xié)同效應蛋白質(zhì)分子中的1個亞基與其的配體結(jié)合后,能影響其它亞基與配體的結(jié)合,稱為協(xié)同效應促進正協(xié)同效應抑制負協(xié)同效應第四節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)一、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)(一)兩性解離和等電點蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。在溶液中的帶電狀況主要取決于溶液的pH值PrCOOHNH3+PrCOO-NH3+PrCOO-NH2+OH-+H++OH-+H+pH=pIpH<pIpH>pI此時溶液的pH值稱為蛋白質(zhì)的等電點(pI)等電點(pI):在某一pH值溶液中,蛋白質(zhì)酸性基團和堿性基團的解離程度相當?shù)鞍踪|(zhì)分子所帶正負電荷相等,凈電荷為零蛋白質(zhì)分子顆粒大小1-100nm之間,屬膠體顆粒范圍,在溶液中能形成穩(wěn)定的膠體蛋白質(zhì)的膠體原因:表面形成水化層表面同種電荷的斥力(二)蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)(三)蛋白質(zhì)的變性、沉淀與凝固變性后的蛋白稱為變性蛋白質(zhì)1.蛋白質(zhì)的變性作用在某些理化因素作用下.蛋白質(zhì)的構(gòu)象被破壞,失去其原有的性質(zhì)和生物活性,稱為蛋白質(zhì)的變性作用(denaturation)概念:常見的變性因素:強酸、強堿、有機溶劑、尿素、胍、重金屬生物堿、化學因素物理因素劇烈振蕩熱、紫外線、超聲波、變性蛋白質(zhì)的主要特征:(2)生物活性喪失(4)變性蛋白質(zhì)容易消化(1)蛋白質(zhì)分子中的次級鍵斷裂,構(gòu)象破壞,但不涉及共價鍵的破壞,一級結(jié)構(gòu)不變(3)變性蛋白質(zhì)的溶解度常降低、粘度增加、擴散系數(shù)減小當破壞了維持蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素甚至蛋白質(zhì)的構(gòu)象時,蛋白質(zhì)就會從溶液中析出,這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的沉淀。蛋白質(zhì)的沉淀(pre-cipitation)概念:應用:(1)蛋白質(zhì)分離純化(2)解毒(3)臨床檢驗(1)鹽析法(saltingout)向蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽使蛋白質(zhì)沉淀稱為鹽析常用的中性鹽:不破壞蛋白質(zhì)的構(gòu)象,蛋白質(zhì)不發(fā)生變性硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等使蛋白質(zhì)沉淀的方法概念:特點:作用原理:鹽離子與水親和力極強,奪去蛋白質(zhì)的水化層,減少分子間靜電斥力生物堿試劑(如鞣酸、苦味酸、鎢酸等),某些酸類(主要是指三氯醋酸、磺酰水楊酸和硝酸等),與帶正電的蛋白質(zhì)結(jié)合生成不溶性的鹽而沉淀(4)生物堿試劑和某些酸類沉淀法反應溶液的pH<pI,確保蛋白質(zhì)以陽離子形式存在
缺點:原理:常引起蛋白質(zhì)變性注意事項:3.蛋白質(zhì)的凝固作用蛋白質(zhì)的凝固作用實際上是蛋白質(zhì)變性后進一步發(fā)展的不可逆結(jié)果如加熱可使蛋白質(zhì)變?yōu)椴蝗菰偃芙獾哪龎K二、蛋白質(zhì)的分離純化(一)鹽析和有機溶劑沉淀(二)電泳(三)透析和超濾(四)層析(五)超速離心分類:根據(jù)支持物的不同,電泳電泳可分為:薄膜電泳、凝膠電泳……(二)電泳概念:帶電顆粒在電場中向著所帶電荷相反方向移動稱為電泳。原理:不同的蛋白質(zhì)的因結(jié)構(gòu)、形狀和帶電量的不同而有不同的泳動速度,從而達到分析和分離蛋白質(zhì)的目的應用:電泳技術是生化常用分析技術之一利用壓力或離心力強行使水和小分子雜質(zhì)通過超濾膜(一種半透膜)除去,而蛋白質(zhì)留在膜上,稱為超過濾將蛋白質(zhì)溶液放在半透膜的袋內(nèi),置于流動的適當?shù)木彌_液(如純水)中,小分子雜質(zhì)(如硫酸銨、氧化鈉等)從袋中透出,而蛋白質(zhì)保留于袋中從而將蛋白質(zhì)純化,這種方法稱為透析(三)透析透析工作圖半透膜原理層析種類:凝膠過(分子篩)離子交換層析(陰離子和陽離子)親和層析(四)層析帶正電荷多蛋白緊密結(jié)合帶負電荷多蛋白流過層析柱陽離子交換樹脂工作示意圖分子篩層析親和層析工作示意圖蛋白質(zhì)載體介質(zhì)配體結(jié)合洗脫洗脫介質(zhì)(六)超速離心三、多肽鏈中氨基酸的順序分析第一步:
分離提純蛋白質(zhì),測定NH2末端的數(shù)目,確定蛋白質(zhì)分子是由幾條肽鏈構(gòu)成的,并分離出每條肽鏈。測定肽鏈的分子量,計算組成該肽鏈的氨基酸殘基數(shù)。及每種aa的百分組成。一般過程:肽鏈分子中氨基酸殘基數(shù)=肽鏈的分子量÷120
(各種的氨基酸殘基的平均分子量為120)再將肽鏈徹底水解,用離子交換層析法將各種的氨基酸分離a.丹磺酰氯法
丹磺酰氯是一種強熒光劑,它能專一地與鏈N-端α-氨基反應生成丹磺酰-肽,后者水解生成的丹磺酰-氨基酸具有很強的熒光,可直接用電泳法或?qū)游龇ㄨb定出N-端是何種氨基酸。第二步測定肽鏈的氨基末端和羧基末端1.N末端的測定b.二硝基苯氟法:過時2.C末端的測定常用羧基肽酶法羧基肽酶專一地將肽鏈水解成片斷,分別進行順序分析第三步肽鏈的局部水解胰蛋白酶的作用原理1.酶解法CNBr與Met反應測定Pr的一級結(jié)構(gòu)
2.化學法層析鑒定就可N-端開始確定被測肽段的氨基酸排列順序第四步肽段氨基酸順序分析一般采用Edman降解法弱堿條件異硫氰酸苯酯+N端α-氨基苯氨基硫甲酰肽(PTC-肽)酸性條件環(huán)化水解苯乙內(nèi)酰硫氨基酸(PTH-aa)失去原N-端氨基酸的肽剩下的肽可反復進行上述處理,依次生成各種PTH-aa,Edman降解法的示意圖
一般常用多種方法使肽鏈斷裂,并分析出各肽段中的氨基酸順序。由于在不同部位斷鏈,只要找出多套肽段的重疊部位,然后組合排列對比,即可推斷肽段的排列順序,從而得出完整肽鏈中氨基酸的順序第五步肽鏈一級結(jié)構(gòu)的確定則其氨基酸排列順序為:
Thr-Asn-Val-Lys-Ala-Trp-Gly-lys如測一個九肽測得N端氨基酸殘基為Thr又分別測得片段:
Ala-Ala-Trp-Gly-Lys
Val-Lys-Ala-Ala-TrpThr-Asn-Val-Lys另外,亦可以通過基因中核苷酸順序推測蛋白質(zhì)的氨基酸順序四、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的測定1.X射線晶體衍射法X-衍射圖代表射線穿過(蛋白質(zhì))晶體的一系列平行剖面的各原子的電子密度,然后再借助計算機繪
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