基因工程基本操作程序

關(guān)于基因工程基本操作程序第一頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日一、目的基因的獲取

1.基因的結(jié)構(gòu)2.目的基因的概念3.目的基因的獲取的方法第二頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日1.基因的結(jié)構(gòu)（1）原核生物基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游編碼蛋白質(zhì)調(diào)控遺傳信息的表達（調(diào)控程序）…A‥………ATGTGCACGTAGTTA………‥G……T‥………TACACGTGCATCAAT………‥C…啟動子終止子第三頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動子終止子ATGTGCACGTAGTTATACACGTGCATCAATRNA聚合酶AUGUGCACGUAGUUA

啟動子：位于基因首端一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶:能夠識別啟動子上的結(jié)合位點并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì).

終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉(zhuǎn)錄終止。第四頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)（能編碼蛋白質(zhì)）啟動子終止子（2）真核與原核生物基因結(jié)構(gòu)的比較外顯子內(nèi)含子編碼蛋白質(zhì)（不能編碼蛋白質(zhì)）①相同點：都是由能夠編碼蛋白質(zhì)的編碼區(qū)和具有調(diào)控作用的非編碼區(qū)。②不同點：原核細胞基因的編碼區(qū)是連續(xù)的；真核細胞的編碼區(qū)是間隔的，不連續(xù)的。真核生物基因結(jié)構(gòu)第五頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日外顯子：真核細胞基因DNA中的編碼序列，這些序列被轉(zhuǎn)錄成RNA并進而翻譯為蛋白質(zhì)。內(nèi)含子：真核細胞基因DNA中的間插序列，這些序列被轉(zhuǎn)錄成RNA，但隨即被剪除而不翻譯。第六頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日2.目的基因的概念

主要是指編碼蛋白質(zhì)基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。例如：與生物抗逆性相關(guān)的基因，與生物優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因，藥物和保健品相關(guān)的基因，與毒物降解相關(guān)的基因，以及與工業(yè)所需要酶相關(guān)的基因。

目前被廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、植物抗病基因（抗病毒、抗細菌)、人胰島素基因等。第七頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日3.目的基因的獲取的方法（3）用化學方法直接人工合成目的基因（1）從基因庫中獲取目的基因（2）應(yīng)用PCR技術(shù)擴增目的基因第八頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日（1）從基因庫中獲取目的基因①基因文庫和部分基因文庫的慨念②基因組文庫和cDNA文庫的主要區(qū)別③怎樣從基因文庫中找到我們所需要的目的基因第九頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日①基因文庫和部分基因文庫的慨念：

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導入受體菌的群體中儲存,各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫。

基因文庫中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫叫做基因組文庫。

基因文庫中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫叫做部分基因文庫。如：cDNA文庫。第十頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日部分基因文庫的建立方法mRNA反轉(zhuǎn)錄酶單鏈DNA合成

雙鏈DNA（cDNA）

載體插入導入受體菌群（cDNA文庫）分離目的基因基因組文庫的建立方法提取某種生物的全部DNA用適當?shù)南拗泼该盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與運載體連接導入受體菌中儲存（基因組文庫）分離目的基因第十一頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日cDNA合成過程

第一步：反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的

DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。第二步：核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈降解，使之變成單鏈的DNA。第三步：以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。20.03.202312第十二頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日②基因組文庫和cDNA文庫的主要區(qū)別

文庫類型cDNA文庫

基因組文庫

文庫大小基因中啟動子（具有啟動作用的DNA片段）基因中內(nèi)含子(位于編碼蛋白質(zhì)序列的非編碼DNA片段）

基因多少

物種間的基因交流小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以第十三頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日（2）應(yīng)用PCR技術(shù)擴增目的基因①定義：②原理：DNA雙鏈復(fù)制PCR是聚合酶鏈式反應(yīng)的縮寫，是一項在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)，在短時間內(nèi)大量擴增目的基因DNA分子熱變性（在90～95OC時，解旋，雙鏈分開溫度降低又結(jié)合成雙鏈）因此，在PCR技術(shù)中不需要解旋酶（與復(fù)制不同之處)③儀器：PCR擴增儀（自動調(diào)控溫度的儀器）④條件：有一段已知的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物，三磷酸脫氧核苷酸dNTP，酶等。第十四頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日④過程：a.DNA熱變性（90～95OC)：b.復(fù)性或退火（55～60OC)：c.延伸（70～75OC)：d.重復(fù)a.b.c步驟：

雙鏈DNA模板在熱的作用下，氫鍵斷裂形成單鍵DNA系統(tǒng)溫度降低，引物結(jié)合到互補DNA鏈上，形成局部的雙鏈DNA

在Taq酶作用下，合成與模板互補的DNA子鏈，形成雙鏈DNA

每重復(fù)一次，目的基因增加一倍PCR擴增為指數(shù)形式擴增2n(n為擴增循環(huán)的次數(shù)），在短時間內(nèi)擴增大量目的基因。第十五頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日怎樣從基因文庫中找到我們所需要的目的基因

根據(jù)目的基因的有關(guān)信息，例如，根據(jù)基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA，以及基因的表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性來獲取目的基因。第十六頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日以哺乳動物基因組DNA為例，介紹Southern印跡雜交的基本步驟

一、待測核酸樣品的制備

（一）制備待測DNA

將基因文庫中的所有菌落裂解，用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白質(zhì)和RNA（如量不夠可用PCR擴增）（二）DNA限制酶消化

基因組DNA很長，需要將其切割成大小不同的片段之后才能用于雜交分析，通常用限制酶消化DNA。消化后電泳分離DNA（三）DNA變性：分離后移至于堿性溶液中浸泡，DNA片段經(jīng)過堿變性作用，形成單鏈狀態(tài)。單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移到固相（一種特制的膜）支持物上。第十七頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日以哺乳動物基因組DNA為例，介紹Southern印跡雜交的基本步驟二、探針標記：通過PCR方法將目的基因已知的部分核酸序列擴增出來，進行放射性同位素標記，即用標記了放射性同位素的目的DNA片段作為探針，將標記的DNA探針置沸水浴10min，迅速置冰上冷卻1-2min，使DNA變性成單鏈。三、Southern雜交：將待測單鏈DNA濾膜和標記的探針單鏈DNA放入雜交液中即可進行雜交反應(yīng)。雜交是在相對高離子強度的緩沖鹽溶液中進行也就是說，只有探針和待測順序之間有非常高的同源性時，才能在低鹽高溫的雜交條件下結(jié)合。第十八頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日以哺乳動物基因組DNA為例，介紹Southern印跡雜交的基本步驟四、放射性自顯影檢測

將雜交后的濾膜，放入有2張X光底片暗盒中，使濾膜對X光底片曝光然后沖洗X光底片，在膜上陽性反應(yīng)（雜交帶）。主要應(yīng)用

1.遺傳病診斷2.DNA圖譜分析3.PCR產(chǎn)物分析第十九頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日(3)用化學方法直接人工合成目的基因蛋白質(zhì)氨基酸序列→mRNA的核苷酸序列→目的基因序列→目的基因針對：基因比較小，核苷酸序列又已知推測化學合成思考：

不具有，缺少非編碼區(qū)(啟動子、終止子）和非編碼序列（如內(nèi)含子），要人工構(gòu)建。人工合成的目的基因是否具有完整基因結(jié)構(gòu)的基因？推測第二十頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日1.作用：二.基因表達載體的構(gòu)建——核心IMN2.組成：①使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在并遺傳給子代。②同時使目的基因能表達和發(fā)揮作用。(3)終止子：是使轉(zhuǎn)錄在需要的地方停止(4)標記基因：是鑒別受體細胞中是否含有目的基因從而將含有目的基因的細胞篩選出來(2)啟動子：是RNA聚合酶識別和結(jié)合部位(1)目的基因

不同受體細胞，目的基因?qū)胧荏w細胞的方法不同，基因表達載體的構(gòu)建有所差異。第二十一頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日質(zhì)粒DNA分子限制酶處理一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種基因表達載體的構(gòu)建20.03.202322第二十二頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日尋根問底：將生物的所有DNA直接導入受體細胞不是更簡便嗎？如果這么做，結(jié)果會怎樣？有人采用總DNA注射法進行遺傳轉(zhuǎn)化：即將一個生物中的總DNA提取出來，通過注射或花粉管通道法導入受體細胞，沒有進行表達載體的構(gòu)建。這種方法針對性差，完全靠運氣，也無法確定什么基因?qū)肓耸荏w細胞。此法目前爭議頗多，嚴格來說不算基因工程。第二十三頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日資料:

科學家在培育抗蟲棉時，起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質(zhì)粒中，然后導入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲基因在棉花體內(nèi)沒有表達。

然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入抗蟲基因啟動子，導入棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力。科學家又在有啟動子、抗蟲基因的質(zhì)粒中插入抗蟲基因終止子，導入棉花受精卵，結(jié)果成長的植株，有了抗蟲能力。

資料證明：載體構(gòu)建組成要完整第二十四頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日三、將目的基因?qū)胧荏w細胞1.轉(zhuǎn)化：

目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的工程2.常見轉(zhuǎn)化方法：①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法：雙子葉植物和裸子植物。（1）將目的基因?qū)胫参锛毎刍驑尫ǎ簡巫尤~植物。

②花粉管通道法（3）將目的基因?qū)胛⑸锛毎惺軕B(tài)細胞法。（2）將目的基因?qū)雱游锛毎@微注射法。第二十五頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日①特點:

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法：（1）將目的基因?qū)胫参锛毎芨腥倦p子葉植物和祼子植物,對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力②過程：③適用生物：雙子葉植物、祼子植物。第二十六頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日Hind限制性酶ⅠⅡHindIIIHindIII目的DNATi質(zhì)粒蘇云金桿菌構(gòu)建表達載體Bt毒素蛋白基因

蘇云金桿菌DNA連接酶

T-DNA(可轉(zhuǎn)移-DNA)

知識拓展農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的過程：第二十七頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日花粉管通道法：將目的基因?qū)胫参锛毎俨僮鞣椒ǎ孩谔攸c：

在植物花受粉后，花粉形成花粉管還末愈合前期，剪去柱頭，然后，滴入DNA（含目的基因）使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞十分簡便經(jīng)濟③例：轉(zhuǎn)基因抗蟲棉第二十八頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日基因槍法：

利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法①操作方法：②金屬粒：將目的基因?qū)雴巫尤~植物細胞

鎢粉粒子和金粉粒子，粒子的直徑一般在0.6～4um。③適用：單子葉植物第二十九頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日①細胞類型：②操作程序：___顯微注射法：（2）將目的基因?qū)雱游锛毎l(fā)育成新性狀動物移植到子宮或輸卵管培養(yǎng)成早期胚胎顯微注射取受精卵（體內(nèi)或體外受精）提純含目的基因表達載體受精卵第三十頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日③常用法：②常用菌：①微生物作受體細胞原因：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對少④過程：大腸桿菌Ca2+處理獲得感受態(tài)細胞Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA___感受態(tài)細胞法（3）將目的基因?qū)胛⑸锛毎谌豁?，共五十二頁，編輯?023年，星期日例：第三十二頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日

若通過基因過程生產(chǎn)人的糖蛋白可以用大腸桿菌作為工程菌嗎？答：不可以，糖蛋白上的糖鏈是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上加工完成，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體存在真核細胞中，大腸桿菌是原核生物，細胞中不含這兩種細胞器。以酵母菌作為工程菌可以嗎?答：可以，酵母菌為真核生物（真菌類）。第三十三頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日四目的基因的檢測與鑒定——檢查是否成功

導入過程完成后，全部受體細胞都能攝入重組

DNA分子嗎？真正能攝入重組DNA分子的受體細胞很少。

目的基因進入受體細胞后，是否都能穩(wěn)定維持和表達？不一定，需要檢測1.檢測方法：分子雜交技術(shù)：（1）DNA分子與DNA分子的之間雜交（2）DNA分子與RNA分子的之間雜交（3）蛋白質(zhì)分子（抗原與抗體）之間雜交2.個體生物學水平的鑒定：抗蟲、抗病結(jié)種實驗，活性比較實驗第三十四頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日1.檢測轉(zhuǎn)基因生物的DNA探針15N15N14N14N（1）檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因基因探針：放射性同位素等標記的DNA分子方法：DNA分子雜交技術(shù)變性變性第三十五頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日

如果顯示出雜交帶，就表明待測樣品含有目的基因。第三十六頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日變性方法：DNA分子雜交（northern雜交）（2）檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA探針15N15N轉(zhuǎn)基因生物的mRNA14N14N如果顯示出雜交帶，就表明待測樣品目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)錄。第三十七頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日提?。?）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法：抗原-抗體雜交蘇云金桿菌Bt毒素蛋白將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體抗體蛋白質(zhì)

出現(xiàn)雜交帶脫分化組織培養(yǎng)證明：提取蛋白質(zhì)與Bt毒素蛋白質(zhì)一樣第三十八頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達。2.鑒定——個體生物學水平的鑒定（1）多細胞個體抗蟲、抗病接種實驗，活性比較實驗第三十九頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日

不能，受體細胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達。

受體細胞攝入DNA分子后就說明目的基因完成了表達嗎？若不能表達，要對抗蟲基因再進行修飾。第四十頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日細菌的檢測，將每個受體細胞單獨培養(yǎng)形成菌落，檢測菌落中是否有目的基因的表達產(chǎn)物。淘汰無表達產(chǎn)物的菌落，保留有表達產(chǎn)物的進一步培養(yǎng)、研究。（2）單細胞生物無表達產(chǎn)物無表達產(chǎn)物有表達產(chǎn)物無表達產(chǎn)物第四十一頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日1、有關(guān)基因工程的敘述中，錯誤的是()A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來

B、限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得

C、目的基因須由運載體導入受體細胞

D、人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶課堂練習第四十二頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日2、下列屬于獲取目的基因的方法的是()①利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成②從基因組文庫中提取③從受體細胞中提取④利用PCR技術(shù)⑤利用DNA轉(zhuǎn)錄 ⑥人工合成

A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥課堂練習第四十三頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日3、有關(guān)基因工程的敘述正確的是（）

A、限制酶只在獲得目的基因時才用

B、重組質(zhì)粒的形成在細胞內(nèi)完成

C、質(zhì)粒都可作為運載體

D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料第四十四頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期日4、基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計施工的，在基因操作的基本步驟中，不進行堿基互補配對的步驟是

（）

A、人工合成目的基因

B、目的基因與運載體結(jié)合

C、將目的基因?qū)胧荏w細胞

D、目的基因的檢測和表達1A2D3D4C第四十五