實驗三重組質(zhì)粒轉化大腸桿菌

關于實驗三重組質(zhì)粒轉化大腸桿菌第一頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一實驗目的

學習將重組質(zhì)粒DNA導入大腸桿菌的方法學習氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞的方法為下一步重組體篩選做準備第二頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一實驗原理遺傳學中轉化的基本含義是使細胞獲得一新的可遺傳的表型性狀。分子克隆中用人工的方法將重組質(zhì)粒DNA導入大腸桿菌細胞，使攜帶有重組質(zhì)粒的大腸桿菌獲得在抗生素平板上生長的能力，從而與不攜帶重組質(zhì)粒的的細菌區(qū)分開來，這個過程就是轉化。將重組質(zhì)粒轉化進受體細菌時，需誘導受體細菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA。大腸桿菌細胞經(jīng)過一些特殊方法（電擊法、CaCl2等化學試劑法）的處理后，細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變，成為能允許外源DNA分子進入的細胞即感受態(tài)細胞(Competentcells)。第三頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一

轉化(Transformation)

是將外源DNA分子引入受體細胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領域的基本實驗技術。0.1mol/LCaCl2是一種低滲溶液，在0℃低溫處理大腸桿菌細胞時，細胞膨脹成球形，DNA可吸附在其表面。在短暫的熱沖擊（如42℃）下，細胞可吸收外源DNA。為了鑒定這些轉化子，須利用質(zhì)粒編碼的篩選標記，這些標記賦予細菌新的表型，是成功轉化的細菌很容易被篩選出來。pET32a質(zhì)粒帶有氨芐西林抗性基因（Ampr），其重組體轉化的大腸桿菌能夠在含氨芐西林的培養(yǎng)基上生長，而未轉化的受體菌則不能再這種培養(yǎng)基上生長。

第四頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一Ampr：氨芐西林抗性基因–β內(nèi)酰胺酶多克隆位點（MCS）：外源DNA片段的插入位點Amps菌株Ampr涂布于含Amp的培養(yǎng)基上，可以生長。次日可見白色菌落--轉化子。培養(yǎng)基上含有X-Gal和IPTG時，可使用藍白斑篩選方法鑒別真正的重組的轉化子。pET32apET32a第五頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一結構的三大要素：

多克隆位點選擇標記（耐藥性，LacZ）復制起始位點種類：

質(zhì)粒噬菌體酵母人工染色體（YAC）反轉錄病毒載體表達載體等第六頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一第七頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一pET-32aVectorThepETSystemisthemostpowerfulsystemyetdevelopedforthecloningandexpressionofrecombinantproteinsinE.coli.第八頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一pET-32cloning/expressionregion第九頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一Vector(pET-32a)Genefragment(SmPR10)pET32a-SmPR10第十頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一材料、設備及試劑

材料E.coliDH5α菌株:R-、M-、Amp-(轉化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子進入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。）pET32a-SmPR10質(zhì)粒DNA（濃度：2ng/μl):實驗室自制設備

恒溫搖床；電熱恒溫培養(yǎng)箱；臺式高速離心機；超凈工作臺；低溫冰箱；恒溫水浴鍋；分光光度計；微量移液槍。第十一頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一

試劑

1、LB固體和液體培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基配方：（單位g/L）

胰蛋白胨 10酵母提取物 5NaCl 10瓊脂粉（1.5%）15g（注：LB液體培養(yǎng)基不加瓊脂粉）按配方稱量藥品,加入一定量的ddH2O后置電爐上加熱熔解瓊脂，待瓊脂完全熔解后加入ddH2O定容至1000ml,用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0。121℃濕熱高壓滅菌20分鐘，待冷卻至60℃左右,在超凈工作臺中加入一定量的Amp儲存液,使終濃度為100μg/ml,搖勻后用培養(yǎng)皿鋪板。第十二頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一2、Amp母液：稱取氨芐西林100mg溶于1mlddH2O中，0.22μm濾器過濾除菌，用1.5ml離心管分裝后儲存于-20℃冰箱.3、0.1mol/LCaCl2溶液:稱0.56gCaCl2(無水分析純),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,用0.22μm濾器過濾除菌或高壓滅菌。EP管分裝于4℃冰箱儲存.4、pET32a-SmPR10質(zhì)粒：實驗室自制

第十三頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一操作步驟（一）受體菌的培養(yǎng)1、取-70℃或-20℃貯存的大腸桿菌DH5α菌種，在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜，進行活化;2、取幾微升活化后的菌液（取量視菌的密度而定）在LB平板上涂布,于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；從LB平板上挑取單菌落,接種于3-5mlLB液體培養(yǎng)基中,37℃下振蕩培養(yǎng)12小時左右,直至對數(shù)生長后期。3、將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)2-3小時至OD600＝0.5左右(生長對數(shù)期）。（注：這一步非常關鍵。培養(yǎng)過度的菌液含有較多的“老”細胞，制備成感受態(tài)細胞后其接受外援DNA能力較低，從而導致轉化率降低。）第十四頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一（二）、感受態(tài)細胞的制備(CaCl2

法)1、將菌液轉入1.5ml離心管中,冰上放置10分鐘,然后于4℃、4000rpm離心10分鐘。2、棄去上清,用預冷的0.1mol/L的CaCl2溶液1ml輕輕懸浮細胞,冰上放置10分鐘后,4℃、4000rpm離心10分鐘。3、棄去上清,加入0.1ml預冷的0.1mol/L的CaCl2溶液,輕輕懸浮細胞。每份100μl（注意懸液密度要均勻）,冰上放置備用。4、暫時不用的感受態(tài)細胞可置于-80℃保存。注：CaCl2處理后的細胞比較脆弱，盡量溫柔操作！第十五頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一（三）重組質(zhì)粒DNA的轉化質(zhì)粒和感受態(tài)細胞混和：在100μl感受態(tài)細胞懸液中加入5μl重組質(zhì)粒DNA（pET32a-SmPR10），輕輕混勻后冰上放置30分鐘。熱擊：42℃水浴中熱擊60秒（注：精確計算時間，熱擊過長將對細胞造成傷害）,熱擊后馬上置于冰上冷2-5分鐘。復蘇：向每管中加入800μlLB液體培養(yǎng)基(注：不含Amp),混勻后在37℃150rpm輕搖培養(yǎng)1小時，使細菌恢復正常生長狀態(tài)，并表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr)。思考：熱擊后的細胞已吸入外源質(zhì)粒，如本實驗中的pET32a，該質(zhì)粒可賦予宿主氨芐青霉素抗性。但是為什么復蘇時用的LB培養(yǎng)液不加Amp？第十六頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一（四）涂布平板篩選轉化質(zhì)粒

將管中培養(yǎng)液搖勻后取100μl均勻涂布于含Amp的篩選平板上。（注：將培養(yǎng)液搖勻后涂布。）2.正面向上放置半小時,待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37℃溫箱中培養(yǎng)過夜，次日觀察實驗結果。第十七頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一預期實驗結果感受態(tài)細胞+重組質(zhì)粒0.1MCaCl2+重組質(zhì)粒感受態(tài)細胞+無菌水第十八頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一實驗報告

思考題

(1).根據(jù)本實驗你認為影響轉化率的因素有哪些？

(2).如果實驗中對照組本不該長出菌落的平板上長出了一些菌落，你將如何解釋這種現(xiàn)象？第十九頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一實驗中要考慮的重要因素

為了提高轉化效率,實驗中要考慮以下幾個重要因素：1.細胞生長狀態(tài)和密度:不要用經(jīng)過多次繼代或儲于４℃的培養(yǎng)菌，最好從-70℃或-20℃甘油保