細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法小結(jié)

細(xì)胞凋亡檢測(cè)法小結(jié)一、定性和定量研究只定性的研究方法常瓊脂糖膠電泳、脈沖場(chǎng)倒轉(zhuǎn)瓊脂糖凝膠電泳、形態(tài)學(xué)觀察（普通光學(xué)顯微鏡、透射電鏡、熒光顯微鏡）進(jìn)行定量或半定量的研究方法：各種流式細(xì)胞儀方法、原位末端標(biāo)記法定瓊脂糖凝膠電泳。二、區(qū)分凋亡和壞死可將二者區(qū)分開(kāi)的方法瓊糖膠電泳形學(xué)觀（射電鏡是是區(qū)分凋亡和壞死最可靠的方法雙色法流式細(xì)胞儀檢測(cè)雙色法流式細(xì)胞儀檢測(cè)等。不能將二者區(qū)分開(kāi)的方法：原位末端標(biāo)記法單色法流式細(xì)胞儀檢測(cè)等。三、樣品來(lái)源不同選擇組織主要用形態(tài)學(xué)方法染射電鏡蠟包埋組織切片進(jìn)行原位末端標(biāo)記或?qū)⒔M織碾碎消化做瓊脂糖凝膠電)。四、細(xì)胞凋亡檢測(cè)、早期檢磷酰絲氨在細(xì)胞外膜上的檢測(cè)細(xì)內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測(cè)細(xì)色素的位檢測(cè)線粒體膜電位變化的檢測(cè)

、晚期檢測(cè)：細(xì)胞凋亡晚期中，核酸內(nèi)切酶在核小體之間剪切核，生大量長(zhǎng)度在的片。對(duì)于晚期檢測(cè)通常有以下方法：末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺末端標(biāo))連介導(dǎo)的檢測(cè)粒酶檢、生化檢測(cè)：）典型的生化特征片段化）檢測(cè)方法主要有：瓊脂糖凝膠電泳、原位末端標(biāo)記）等）（末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺末端標(biāo)記）末轉(zhuǎn)移酶將帶標(biāo)記的（多為或直接到片的端再過(guò)酶聯(lián)顯色或熒光檢測(cè)定量分析結(jié)果做細(xì)胞懸液福爾馬林固定或石蠟處理的組織、細(xì)胞培養(yǎng)物等多種樣本的檢測(cè)。、連介導(dǎo)的檢當(dāng)?shù)蛲黾?xì)胞比例較小以及檢測(cè)樣品量很如活體組織切片時(shí)直瓊脂糖電泳可能觀察不到核的變化。通過(guò)連特異性接頭，專(zhuān)一性地?cái)U(kuò)梯度片段，從而靈敏地檢測(cè)凋亡時(shí)產(chǎn)生梯度片段。此外檢是半定量的因相同凋亡程度的不同樣品可進(jìn)行比較。如果細(xì)胞量很少，還可在分離提純后用和脫核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（使標(biāo)，然后進(jìn)行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細(xì)胞中的形成。上述兩種方法都針對(duì)細(xì)胞凋亡晚期核裂這一特征，但細(xì)胞受到其它損傷如機(jī)械損傷，紫外線等會(huì)產(chǎn)生這一現(xiàn)象因它對(duì)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)會(huì)受到其它原因的干擾需結(jié)合其它的方法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。其它方法：）端粒酶檢測(cè)端粒酶是由和白組成，它可以自身R為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒區(qū)重復(fù)序列使胞獲得永生。正常體細(xì)胞是沒(méi)有端粒酶活性的，每分裂一次，染色體的端粒會(huì)縮短，這可能作為有絲分裂的一種時(shí)鐘表細(xì)胞年齡復(fù)制衰老或細(xì)胞凋亡的信號(hào)研究發(fā)現(xiàn)以上的癌細(xì)胞或凋亡細(xì)胞都具有端粒酶的活性。）水的檢測(cè)研究者們發(fā)現(xiàn)了很多在細(xì)胞凋亡時(shí)表達(dá)異常的基因這特異基因的表達(dá)水平也成為檢測(cè)細(xì)胞凋亡的一種常用方法。據(jù)報(bào)道，蛋結(jié)合受體后能誘導(dǎo)癌細(xì)胞中的細(xì)胞毒性細(xì)胞（T）等靶細(xì)胞。和長(zhǎng)作抗凋亡（和）的調(diào)節(jié)物，它們的表達(dá)水平比例決定了細(xì)胞是凋亡還是存活。用熒光定量技術(shù)來(lái)檢測(cè)基因表達(dá)水平無(wú)疑比之前者更快更準(zhǔn)確。通過(guò)檢測(cè)和長(zhǎng)的)基的表水平來(lái)進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。、細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測(cè)：正常狀態(tài)下谷苷為細(xì)胞的一種重要的氧化還原緩沖劑內(nèi)毒的氧物通過(guò)被還而定期去除，氧化型的又可被還酶速還原。這一反應(yīng)在線粒體中尤為重要，許多呼吸作用中副產(chǎn)物的氧化損傷將由此被去除。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的除非常活躍時(shí)細(xì)胞液就由還原環(huán)境為氧化環(huán)境可能導(dǎo)致了凋亡早期細(xì)胞線粒體膜電位的降低，從而使細(xì)胞色素（三羧酸循環(huán)中的重要組分）從線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞液中，啟動(dòng)凋亡效應(yīng)器的級(jí)反應(yīng)。

、細(xì)胞色素C的位檢測(cè)細(xì)胞色素作為一種信號(hào)物質(zhì)，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重的作用。正常情況下，它存在于線粒體內(nèi)膜和外膜之間的腔中，凋亡信號(hào)刺激使其從線粒體釋放至細(xì)胞漿，結(jié)合（）啟動(dòng)級(jí)反應(yīng)：細(xì)胞色素復(fù)合物激活，者再激活和其它下游。、線粒體膜電位變化的檢測(cè)：）線粒體跨膜電位的耗散與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系）近年來(lái)陸續(xù)有報(bào)道說(shuō)明線粒體跨膜電位的耗散早于核酸酶的激活，早于磷酯酰絲氨酸暴露于細(xì)胞表面。而一旦線粒體跨膜電位耗散，細(xì)胞就會(huì)進(jìn)入不可逆的凋亡過(guò)程。）在細(xì)胞凋亡過(guò)程中線粒體跨膜電位的耗散主要是由于線粒體內(nèi)膜的透性轉(zhuǎn)變，這是由于生成了動(dòng)態(tài)的由多個(gè)蛋白質(zhì)組成的位于線粒體內(nèi)膜與外膜接觸位點(diǎn)的通透性轉(zhuǎn)變孔孔道能定線粒體跨膜電位就能防止細(xì)胞凋亡。線粒體在細(xì)胞凋亡作用中的進(jìn)一步證據(jù)：）若將純化的正常的線粒體與純化的細(xì)胞核在一起保溫，并不導(dǎo)致細(xì)核的變化。但若將誘導(dǎo)生成孔道的線粒體與純化的細(xì)胞核一同保溫，細(xì)胞核即開(kāi)始凋亡化。）形態(tài)學(xué)觀察，看到細(xì)胞數(shù)目有限，統(tǒng)計(jì)學(xué)上的準(zhǔn)確性受影響；）凝膠電泳檢測(cè)破了細(xì)胞的完整性不能測(cè)出凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞的比例；）流式細(xì)胞術(shù)可檢測(cè)細(xì)胞、亞細(xì)胞及分子水平的特征性變化。用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)的染料：、、、、啶橙等，其中最用。和雙：、均與胞核（）合。但是PI不通過(guò)正常的細(xì)胞膜，則膜通透性的熒光染料故細(xì)胞在處于壞死或晚期亡時(shí)細(xì)胞膜被破壞時(shí)可為著紅色常細(xì)胞和中早期調(diào)細(xì)胞均可被著是正常細(xì)胞核的著色的形態(tài)呈圓形，淡蘭色，內(nèi)有較深的蘭色顆粒；而調(diào)亡細(xì)胞的核由于濃集而呈亮蘭色，或核呈分葉，碎片狀，邊集。故著色為壞死細(xì)胞；亮蘭色，核呈分葉狀，邊集的著的為調(diào)亡細(xì)胞。和雙：磷脂酰絲氨酸（）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期（或細(xì)胞損傷時(shí)可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。）以和磷脂酰絲氨酸）異性結(jié)合。因此細(xì)胞處于調(diào)亡或壞死時(shí)，可陽(yáng)性（早期的壞死細(xì)胞可能為陰性只有壞死的細(xì)胞是陽(yáng)五、形態(tài)學(xué)觀察、普通光學(xué)顯微鏡觀察、透射電子顯微鏡觀察、熒光顯微鏡觀察、普通光鏡下觀察：用木伊紅）染色：細(xì)胞核固縮碎裂、呈藍(lán)黑色、胞漿呈淡紅色（凋亡細(xì)常細(xì)胞核呈均勻淡藍(lán)色或藍(lán)色，壞死細(xì)胞核呈很淡的藍(lán)色或藍(lán)色消失染法、瑞氏染色法，正常細(xì)胞核的色澤均一，凋亡細(xì)胞染色變深，壞死細(xì)胞染色淺或沒(méi)染上顏色直接用倒置顯微鏡觀察：

）細(xì)胞體積變小，全面皺縮；）凋亡小體為數(shù)個(gè)圓形小體圍繞在細(xì)胞周?chē)?、透射電子顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。細(xì)胞凋亡過(guò)程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：Ⅰ期的細(xì)胞核呈波紋狀或呈折縫樣，部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；期胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；期細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。、熒光顯微鏡常用的熒光染料：丫啶橙、、、和、等、三染料與的合是非嵌入式的，主要結(jié)合在的堿區(qū)。紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)射明的藍(lán)色熒光。）雙色法基本原理是與特異結(jié)合的活性染料，能進(jìn)入正常細(xì)胞而對(duì)細(xì)胞沒(méi)有太大得細(xì)胞毒作用。在亡細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度要比正常細(xì)胞中要高。為通透性，用于常規(guī)固定細(xì)胞的染色。碘化丙啶是種核酸染料不透過(guò)完整的細(xì)胞膜在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，能透過(guò)細(xì)胞膜而將細(xì)胞核染。因此將與PI匹使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。注意事項(xiàng)細(xì)凋亡時(shí)其可染性降低被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的標(biāo)志一但這種可染性降低也可能是因?yàn)榱康慕档驼咭驗(yàn)榻Y(jié)構(gòu)的改變使其與染料結(jié)合的能力發(fā)生改變所致。在分析結(jié)果時(shí)應(yīng)該注意。六、細(xì)胞凋亡的分子生物學(xué)檢測(cè)方:細(xì)胞凋亡中染色體的斷裂是個(gè)漸進(jìn)的分階段的過(guò)程色體先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為的片段大約﹪染色體和依賴(lài)的核酸內(nèi)切酶作用下，在核小體單位之間被隨機(jī)切斷，形成～核體多聚體鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口而產(chǎn)生的一系列的端可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶）作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到的3末端從而可進(jìn)行亡細(xì)胞的檢測(cè)這類(lèi)方法一般稱(chēng)為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒(méi)有的裂，因而沒(méi)有形，很少能夠被染色。低分子量的分后，也可使用聚酶進(jìn)行缺口翻譯低子量的標(biāo)或染色，然后分析凋亡細(xì)胞或口翻譯法實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色準(zhǔn)的反應(yīng)細(xì)胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征用于石蠟包埋組織切片冰凍組織切片培的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞凋亡測(cè)定可測(cè)出極少量的凋亡細(xì)胞敏遠(yuǎn)比一般的組織化學(xué)和生物化學(xué)測(cè)定法要高，因而在細(xì)胞凋亡的研究中已被廣泛采用。過(guò)氧化物酶標(biāo)記測(cè)定法原理：脫氧核糖核苷酸衍生物地高[（）在酶作用下可以摻入到凋亡細(xì)胞雙鏈或單鏈的末與形成異多聚體可與連接了報(bào)告酶（過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶抗高辛抗體結(jié)合。在適合底物存在下氧化物酶可產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)異準(zhǔn)確的定位出正在凋亡的細(xì)胞而可在普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。毛地黃植物是地高辛的唯一來(lái)源有物組織中幾乎不存在能與抗地高辛杭體結(jié)合的配

體，因而非特異性反應(yīng)很低。抗地高辛的特異性抗體與脊椎動(dòng)物甾體激素的交叉反應(yīng)不到％，若此抗體的Fc分通過(guò)蛋白酶水解的方法除去后，則可完全排除細(xì)胞Fc受非特異性的吸附作用。本方法可以用于福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片片和培養(yǎng)的或從組織中分離的細(xì)胞凋亡測(cè)定。一試配制、磷酸緩沖液（酸鹽，。、蛋白酶，白、含的沖液；緩液。、酶沖液（新鮮堿用調(diào)pH至，定容到；加入二甲砷酸鈉．和化鈷。、酶應(yīng)液酶；酶沖液，勻，置于冰上備用。、洗滌與終止反應(yīng)緩沖液：氯化鈉；檸檬酸鈉；、％二氨基聯(lián)苯（）液臨前過(guò)濾后，過(guò)氧化氫至。、％基綠基；乙鈉。、％醇，％％％％乙醇，二甲苯，％中性甲醛溶液，乙酸，松香水等。、過(guò)氧物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體）（二）實(shí)驗(yàn)步驟、標(biāo)本預(yù)處理：（蠟包埋的組織切片預(yù)處理組切片置于染色缸中二苯兩次次。用無(wú)水乙醇洗兩次每用％％醇各洗一次次用加入蛋白酶溶／室溫水解，除組織蛋白。用蒸餾水洗次每次，后按下步驟進(jìn)行作。（）凍組織切片預(yù)處理：將冰凍組織切片置10％性甲醛中，于室溫固定后去除多余液體。用洗兩次每次。乙醇：乙酸（：）的溶液中，于℃理，除多余體。用兩次，每次，后按下述步驟2進(jìn)操作。（）養(yǎng)的或從組織分離的細(xì)胞的預(yù)處理：將約個(gè)細(xì)于％性醛室溫中固定。在載玻片上滴加50～細(xì)懸液并之干燥。用洗次，每次，然后按下述步驟進(jìn)行操。、色缸中加入含％氧化氫的，室反應(yīng)用洗次，每次。、用濾紙小心吸去載玻片上組織周?chē)亩嘤嘁后w，立即在切片上加滴酶沖液，置室溫～。、用濾小心吸去切片周?chē)亩嘤嘁后w，立即在切片上滴加酶應(yīng)液，置濕盒中于反應(yīng)注意：陰性染色對(duì)照，加不含的反應(yīng)液切置于染色缸中已預(yù)熱到℃洗滌與終止反應(yīng)緩沖液℃溫，每將玻片輕輕提起和下一次，使液體輕微攪動(dòng)。、組織切片用洗次，次后直接在切片上滴加兩滴過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，于濕盒中室溫反應(yīng)。、用洗次每次。、在組織切片