細胞凋亡檢測方法小結(jié)

細胞凋亡檢測法小結(jié)一、定性和定量研究只定性的研究方法常瓊脂糖膠電泳、脈沖場倒轉(zhuǎn)瓊脂糖凝膠電泳、形態(tài)學(xué)觀察（普通光學(xué)顯微鏡、透射電鏡、熒光顯微鏡）進行定量或半定量的研究方法：各種流式細胞儀方法、原位末端標記法定瓊脂糖凝膠電泳。二、區(qū)分凋亡和壞死可將二者區(qū)分開的方法瓊糖膠電泳形學(xué)觀（射電鏡是是區(qū)分凋亡和壞死最可靠的方法雙色法流式細胞儀檢測雙色法流式細胞儀檢測等。不能將二者區(qū)分開的方法：原位末端標記法單色法流式細胞儀檢測等。三、樣品來源不同選擇組織主要用形態(tài)學(xué)方法染射電鏡蠟包埋組織切片進行原位末端標記或?qū)⒔M織碾碎消化做瓊脂糖凝膠電)。四、細胞凋亡檢測、早期檢磷酰絲氨在細胞外膜上的檢測細內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測細色素的位檢測線粒體膜電位變化的檢測

、晚期檢測：細胞凋亡晚期中，核酸內(nèi)切酶在核小體之間剪切核，生大量長度在的片。對于晚期檢測通常有以下方法：末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺末端標)連介導(dǎo)的檢測粒酶檢、生化檢測：）典型的生化特征片段化）檢測方法主要有：瓊脂糖凝膠電泳、原位末端標記）等）（末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺末端標記）末轉(zhuǎn)移酶將帶標記的（多為或直接到片的端再過酶聯(lián)顯色或熒光檢測定量分析結(jié)果做細胞懸液福爾馬林固定或石蠟處理的組織、細胞培養(yǎng)物等多種樣本的檢測。、連介導(dǎo)的檢當?shù)蛲黾毎壤^小以及檢測樣品量很如活體組織切片時直瓊脂糖電泳可能觀察不到核的變化。通過連特異性接頭，專一性地擴梯度片段，從而靈敏地檢測凋亡時產(chǎn)生梯度片段。此外檢是半定量的因相同凋亡程度的不同樣品可進行比較。如果細胞量很少，還可在分離提純后用和脫核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（使標，然后進行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細胞中的形成。上述兩種方法都針對細胞凋亡晚期核裂這一特征，但細胞受到其它損傷如機械損傷，紫外線等會產(chǎn)生這一現(xiàn)象因它對細胞凋亡的檢測會受到其它原因的干擾需結(jié)合其它的方法來檢測細胞凋亡。其它方法：）端粒酶檢測端粒酶是由和白組成，它可以自身R為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒區(qū)重復(fù)序列使胞獲得永生。正常體細胞是沒有端粒酶活性的，每分裂一次，染色體的端粒會縮短，這可能作為有絲分裂的一種時鐘表細胞年齡復(fù)制衰老或細胞凋亡的信號研究發(fā)現(xiàn)以上的癌細胞或凋亡細胞都具有端粒酶的活性。）水的檢測研究者們發(fā)現(xiàn)了很多在細胞凋亡時表達異常的基因這特異基因的表達水平也成為檢測細胞凋亡的一種常用方法。據(jù)報道，蛋結(jié)合受體后能誘導(dǎo)癌細胞中的細胞毒性細胞（T）等靶細胞。和長作抗凋亡（和）的調(diào)節(jié)物，它們的表達水平比例決定了細胞是凋亡還是存活。用熒光定量技術(shù)來檢測基因表達水平無疑比之前者更快更準確。通過檢測和長的)基的表水平來進行細胞凋亡的檢測。、細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測：正常狀態(tài)下谷苷為細胞的一種重要的氧化還原緩沖劑內(nèi)毒的氧物通過被還而定期去除，氧化型的又可被還酶速還原。這一反應(yīng)在線粒體中尤為重要，許多呼吸作用中副產(chǎn)物的氧化損傷將由此被去除。當細胞內(nèi)的除非?；钴S時細胞液就由還原環(huán)境為氧化環(huán)境可能導(dǎo)致了凋亡早期細胞線粒體膜電位的降低，從而使細胞色素（三羧酸循環(huán)中的重要組分）從線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞液中，啟動凋亡效應(yīng)器的級反應(yīng)。

、細胞色素C的位檢測細胞色素作為一種信號物質(zhì)，在細胞凋亡中發(fā)揮著重的作用。正常情況下，它存在于線粒體內(nèi)膜和外膜之間的腔中，凋亡信號刺激使其從線粒體釋放至細胞漿，結(jié)合（）啟動級反應(yīng)：細胞色素復(fù)合物激活，者再激活和其它下游。、線粒體膜電位變化的檢測：）線粒體跨膜電位的耗散與細胞凋亡有密切關(guān)系）近年來陸續(xù)有報道說明線粒體跨膜電位的耗散早于核酸酶的激活，早于磷酯酰絲氨酸暴露于細胞表面。而一旦線粒體跨膜電位耗散，細胞就會進入不可逆的凋亡過程。）在細胞凋亡過程中線粒體跨膜電位的耗散主要是由于線粒體內(nèi)膜的透性轉(zhuǎn)變，這是由于生成了動態(tài)的由多個蛋白質(zhì)組成的位于線粒體內(nèi)膜與外膜接觸位點的通透性轉(zhuǎn)變孔孔道能定線粒體跨膜電位就能防止細胞凋亡。線粒體在細胞凋亡作用中的進一步證據(jù)：）若將純化的正常的線粒體與純化的細胞核在一起保溫，并不導(dǎo)致細核的變化。但若將誘導(dǎo)生成孔道的線粒體與純化的細胞核一同保溫，細胞核即開始凋亡化。）形態(tài)學(xué)觀察，看到細胞數(shù)目有限，統(tǒng)計學(xué)上的準確性受影響；）凝膠電泳檢測破了細胞的完整性不能測出凋亡細胞占總細胞的比例；）流式細胞術(shù)可檢測細胞、亞細胞及分子水平的特征性變化。用于流式細胞儀檢測的染料：、、、、啶橙等，其中最用。和雙：、均與胞核（）合。但是PI不通過正常的細胞膜，則膜通透性的熒光染料故細胞在處于壞死或晚期亡時細胞膜被破壞時可為著紅色常細胞和中早期調(diào)細胞均可被著是正常細胞核的著色的形態(tài)呈圓形，淡蘭色，內(nèi)有較深的蘭色顆粒；而調(diào)亡細胞的核由于濃集而呈亮蘭色，或核呈分葉，碎片狀，邊集。故著色為壞死細胞；亮蘭色，核呈分葉狀，邊集的著的為調(diào)亡細胞。和雙：磷脂酰絲氨酸（）正常位于細胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細胞凋亡的早期（或細胞損傷時可從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。）以和磷脂酰絲氨酸）異性結(jié)合。因此細胞處于調(diào)亡或壞死時，可陽性（早期的壞死細胞可能為陰性只有壞死的細胞是陽五、形態(tài)學(xué)觀察、普通光學(xué)顯微鏡觀察、透射電子顯微鏡觀察、熒光顯微鏡觀察、普通光鏡下觀察：用木伊紅）染色：細胞核固縮碎裂、呈藍黑色、胞漿呈淡紅色（凋亡細常細胞核呈均勻淡藍色或藍色，壞死細胞核呈很淡的藍色或藍色消失染法、瑞氏染色法，正常細胞核的色澤均一，凋亡細胞染色變深，壞死細胞染色淺或沒染上顏色直接用倒置顯微鏡觀察：

）細胞體積變小，全面皺縮；）凋亡小體為數(shù)個圓形小體圍繞在細胞周圍。、透射電子顯微鏡觀察凋亡細胞體積變小，細胞質(zhì)濃縮。細胞凋亡過程中細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：Ⅰ期的細胞核呈波紋狀或呈折縫樣，部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；期胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；期細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。、熒光顯微鏡常用的熒光染料：丫啶橙、、、和、等、三染料與的合是非嵌入式的，主要結(jié)合在的堿區(qū)。紫外光激發(fā)時發(fā)射明的藍色熒光。）雙色法基本原理是與特異結(jié)合的活性染料，能進入正常細胞而對細胞沒有太大得細胞毒作用。在亡細胞中的熒光強度要比正常細胞中要高。為通透性，用于常規(guī)固定細胞的染色。碘化丙啶是種核酸染料不透過完整的細胞膜在凋亡中晚期的細胞和死細胞，能透過細胞膜而將細胞核染。因此將與PI匹使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來。注意事項細凋亡時其可染性降低被認為是凋亡細胞的標志一但這種可染性降低也可能是因為量的降低者因為結(jié)構(gòu)的改變使其與染料結(jié)合的能力發(fā)生改變所致。在分析結(jié)果時應(yīng)該注意。六、細胞凋亡的分子生物學(xué)檢測方:細胞凋亡中染色體的斷裂是個漸進的分階段的過程色體先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為的片段大約﹪染色體和依賴的核酸內(nèi)切酶作用下，在核小體單位之間被隨機切斷，形成～核體多聚體鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口而產(chǎn)生的一系列的端可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶）作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標記到的3末端從而可進行亡細胞的檢測這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標記法于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有的裂，因而沒有形，很少能夠被染色。低分子量的分后，也可使用聚酶進行缺口翻譯低子量的標或染色，然后分析凋亡細胞或口翻譯法實際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色準的反應(yīng)細胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征用于石蠟包埋組織切片冰凍組織切片培的細胞和從組織中分離的細胞的細胞凋亡測定可測出極少量的凋亡細胞敏遠比一般的組織化學(xué)和生物化學(xué)測定法要高，因而在細胞凋亡的研究中已被廣泛采用。過氧化物酶標記測定法原理：脫氧核糖核苷酸衍生物地高[（）在酶作用下可以摻入到凋亡細胞雙鏈或單鏈的末與形成異多聚體可與連接了報告酶（過氧化物酶或堿性磷酸酶抗高辛抗體結(jié)合。在適合底物存在下氧化物酶可產(chǎn)生很強的顏色反應(yīng)異準確的定位出正在凋亡的細胞而可在普通光學(xué)顯微鏡下進行觀察。毛地黃植物是地高辛的唯一來源有物組織中幾乎不存在能與抗地高辛杭體結(jié)合的配

體，因而非特異性反應(yīng)很低。抗地高辛的特異性抗體與脊椎動物甾體激素的交叉反應(yīng)不到％，若此抗體的Fc分通過蛋白酶水解的方法除去后，則可完全排除細胞Fc受非特異性的吸附作用。本方法可以用于福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片片和培養(yǎng)的或從組織中分離的細胞凋亡測定。一試配制、磷酸緩沖液（酸鹽，。、蛋白酶，白、含的沖液；緩液。、酶沖液（新鮮堿用調(diào)pH至，定容到；加入二甲砷酸鈉．和化鈷。、酶應(yīng)液酶；酶沖液，勻，置于冰上備用。、洗滌與終止反應(yīng)緩沖液：氯化鈉；檸檬酸鈉；、％二氨基聯(lián)苯（）液臨前過濾后，過氧化氫至。、％基綠基；乙鈉。、％醇，％％％％乙醇，二甲苯，％中性甲醛溶液，乙酸，松香水等。、過氧物酶標記的抗地高辛抗體）（二）實驗步驟、標本預(yù)處理：（蠟包埋的組織切片預(yù)處理組切片置于染色缸中二苯兩次次。用無水乙醇洗兩次每用％％醇各洗一次次用加入蛋白酶溶／室溫水解，除組織蛋白。用蒸餾水洗次每次，后按下步驟進行作。（）凍組織切片預(yù)處理：將冰凍組織切片置10％性甲醛中，于室溫固定后去除多余液體。用洗兩次每次。乙醇：乙酸（：）的溶液中，于℃理，除多余體。用兩次，每次，后按下述步驟2進操作。（）養(yǎng)的或從組織分離的細胞的預(yù)處理：將約個細于％性醛室溫中固定。在載玻片上滴加50～細懸液并之干燥。用洗次，每次，然后按下述步驟進行操。、色缸中加入含％氧化氫的，室反應(yīng)用洗次，每次。、用濾紙小心吸去載玻片上組織周圍的多余液體，立即在切片上加滴酶沖液，置室溫～。、用濾小心吸去切片周圍的多余液體，立即在切片上滴加酶應(yīng)液，置濕盒中于反應(yīng)注意：陰性染色對照，加不含的反應(yīng)液切置于染色缸中已預(yù)熱到℃洗滌與終止反應(yīng)緩沖液℃溫，每將玻片輕輕提起和下一次，使液體輕微攪動。、組織切片用洗次，次后直接在切片上滴加兩滴過氧化物酶標記的抗地高辛抗體，于濕盒中室溫反應(yīng)。、用洗次每次。、在組織切片