細(xì)胞劃痕試驗(yàn)

直尺微槍頭（滅菌）無清培養(yǎng)基準(zhǔn)備：所有能滅菌的器械都要滅菌，直尺和筆操作前紫外照射（凈臺內(nèi)）流：。先用筆在板背后，用直尺比著，均勻得劃橫線，大約每隔一道，橫穿過孔。每孔至少穿過5條。。在空中加入約個(gè)胞，具體數(shù)因細(xì)胞不同而不同，掌握為過夜能鋪滿。。第二天用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直不能傾斜。。用細(xì)胞，去處劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基。。放入度培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。按，，小取樣，拍照。NOTE板可以保證有相當(dāng)距離的平直劃痕，我覺得不錯(cuò)的。而且因?yàn)闂l定位線，與劃痕相交，這樣就有個(gè)固定監(jiān)測點(diǎn)，不作重復(fù)，誤差也很小。如果你連續(xù)監(jiān)測小，你需要考慮到劃痕縮小是細(xì)胞遷移和細(xì)胞繁殖共同作用的結(jié)果，而不是單純的細(xì)胞遷移。如果你要單純的考慮細(xì)胞遷移，你可以先用絲裂霉素（）處理一小時(shí)，抑制細(xì)胞的分裂，這樣你的結(jié)果就是細(xì)胞遷移的作用了。照片拍完之后，可以用J來量劃痕區(qū)域的像素定量比較細(xì)胞遷的速度。無血清的話，應(yīng)該一個(gè)細(xì)胞周期內(nèi)殖可以忽略吧。而且我定點(diǎn)監(jiān)測的話，差不多可以對應(yīng)到每個(gè)細(xì)胞好沒有看見很顯的增殖現(xiàn)象裂霉素貌似很貴的說。如果用這個(gè)還不如直接用呢另，哪有下載么？謝謝。下載網(wǎng)址無血清培養(yǎng)確實(shí)細(xì)胞增殖可以略了不由于細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)整體性的下調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移的速度也會慢很多道是不是大多數(shù)文獻(xiàn)都用無血清培養(yǎng)狀態(tài)下作劃痕實(shí)驗(yàn)?zāi)?？目最的法是transwell法一般做劃痕實(shí)驗(yàn)都無血清或者低血否則細(xì)胞增殖就不能忽略。一般認(rèn)細(xì)胞周期是24小時(shí)，對于一些特殊的細(xì)胞系來說，生長可能會快一點(diǎn)。因此好像還沒看見用帶血清培養(yǎng)，短時(shí)間檢測的。不過我會去試試看。可能是個(gè)好方法。劃痕法的意義在于，價(jià)格低廉，操作簡單。還有很重要的一點(diǎn)在于細(xì)胞外圍環(huán)境簡單單純，容易控制如加藥的，可會和血清的組分有反映，而且受血清批次的影響，造成誤差。如果是鋪了物質(zhì)的，組分就更復(fù)雜了劃痕法的不足也很明顯，適用的細(xì)胞系很窄一般只能用于上，維樣細(xì)胞系。因?yàn)?。這些細(xì)胞本身有遷移能力，且較強(qiáng)。。細(xì)胞有極性，方便測量，觀察。細(xì)對無血清有較強(qiáng)的忍受至少小很腫瘤細(xì)胞系是不適合做劃痕的，很多腫瘤細(xì)胞系在無血清培養(yǎng)下小細(xì)胞凋亡就超過。也就是發(fā)展的最大要求一些上皮樣細(xì)胞甚至可以忍受高達(dá)72小的無血清實(shí)驗(yàn)以彌合劃痕。

wrote:現(xiàn)在好多雜都不認(rèn)這個(gè)實(shí)驗(yàn)了，要求做了這個(gè)方法無法進(jìn)行精確定量，前期做起來容易，后期數(shù)據(jù)處理比較麻煩，還得附圖雜志照片之昂貴，遠(yuǎn)超過了的格。以的版本有個(gè)直方圖的功能可以直接反映選擇區(qū)域的象素多，用來做面積分析應(yīng)當(dāng)很好用做劃痕復(fù)的實(shí)驗(yàn)應(yīng)當(dāng)也很好用更專業(yè)的的話PS沒必要了。tacthginwrote:本人正打算投稿呢中就包括劃痕實(shí)驗(yàn)否請指一下哪些雜志不認(rèn)這個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)兀?/p>

我個(gè)人認(rèn)為選scratchassay或是transwellassay是據(jù)研的胞的點(diǎn)決定的。上皮細(xì)胞，癌細(xì)胞，角質(zhì)細(xì)胞，在生理狀態(tài)下，形成單層或者復(fù)層上皮，當(dāng)病理狀態(tài)下，比如創(chuàng)傷愈合，細(xì)胞遷移的時(shí)候，以側(cè)向運(yùn)動為主很的模擬了這種運(yùn)動形式，是很好的模型。這類細(xì)胞在生理狀態(tài)下并不形成病理狀態(tài)下的細(xì)胞遷移是在細(xì)胞因子或趨化因子的影響下在基質(zhì)中向運(yùn)動，模了這種運(yùn)動形式，是適合的模型。非常同意，戰(zhàn)的思想其實(shí)在傷口彌合中的向創(chuàng)口處遷移就是典型的側(cè)向爬行但是其實(shí)癌細(xì)胞的移倒不是側(cè)向爬行那么簡單覺得應(yīng)該是綜合效應(yīng)而且要看是什么類型的腫瘤因?yàn)閷τ谶h(yuǎn)端病灶的轉(zhuǎn)移然是通過血液運(yùn)輸?shù)倪@一個(gè)細(xì)胞去黏附和再黏附的過程。其實(shí)也不能很好的模仿這個(gè)過程。只是以模仿腫瘤細(xì)胞融解基質(zhì)，侵入到正組織的這個(gè)過程。也就是侵襲以對做的來說可transwell會更好。但我覺得并不能就簡單否定。胞的遷移作為細(xì)胞的一個(gè)正常生理活動表細(xì)胞生理變化的一個(gè)重要指標(biāo)點(diǎn)很主要的意義。(3).腫瘤細(xì)遷移實(shí)驗(yàn)常用8.0、12.0μm膜，上種腫瘤細(xì)，下室加入FBS或些特定的趨因子腫細(xì)胞會向養(yǎng)成分高的室跑，計(jì)進(jìn)入下室細(xì)胞量可反腫細(xì)的遷能(4).腫細(xì)胞襲驗(yàn)常用8.0、12.0μm膜，原理腫瘤細(xì)遷移實(shí)驗(yàn)類似。上室種腫瘤胞下室加入FBS或某特定的趨因子瘤細(xì)胞向營養(yǎng)成分高的下室跑但與腫瘤細(xì)胞移實(shí)驗(yàn)不的是，聚酸酯膜上室側(cè)鋪上一層基質(zhì)膠，用模仿體內(nèi)胞外基質(zhì)細(xì)胞欲進(jìn)入室，先要泌基質(zhì)金蛋白酶MMPs）將基膠降解，可通過聚酸酯膜。數(shù)進(jìn)入下室的胞量可反腫瘤細(xì)胞侵襲能力。

．步驟2．1Transwell室制備2．1．1無基膠Transwell小室制備①被基膜：用50mg/LMatrigel1:8稀釋包被Transwell小底部膜的上室面，4℃風(fēng)干。如果要在下室面鋪FN的，可將200ul槍頭的端剪掉,吸取FN均勻涂抹在室的下面。用膠原（collagen）的話，般配成直接用吸了涂在上。②化基膜：吸出培養(yǎng)板殘余液體每孔加入含10g/LBSA無血清養(yǎng)液，37℃30min另有tianjin_glioma戰(zhàn)友提供的方上室的碳酸酯膜加入稀釋的Matrigel(3.9ug/ul)60-80μl(注意體積可太大，以剛把聚碳酸酯膜浸濕為最好)，置37℃30min使Matrigel合成凝膠2．1．2有基膠的Transwell小室制Chemicon司的ECM550系列說明書要將室放入培養(yǎng)板中在上室加入300μl預(yù)的無血清培養(yǎng)，室溫下置15－30min，使基質(zhì)再水化。吸去剩余養(yǎng)液。2．2制備胞懸液①備細(xì)懸液前可先讓細(xì)胞撤血饑餓12－24h，進(jìn)一步去血清的影響但這一步不是必須的②化細(xì)，終止消化后離心棄去養(yǎng)液，用PBS1－2遍，用含BSA的無血培養(yǎng)基重懸。調(diào)整胞密度至1－10×105，人認(rèn)為不超過5×105具體實(shí)驗(yàn)時(shí)用密度要己摸索，為不同細(xì)胞，其侵襲能力是不同的個(gè)人經(jīng)驗(yàn)細(xì)胞量過多，穿膜的細(xì)胞過多過快如果最后用計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)結(jié)果的話將以計(jì)數(shù)；過少的話，可能沒到檢測時(shí)間點(diǎn)，有的細(xì)胞都已穿過，因此最少也要證在收樣時(shí)候，上室內(nèi)還要一定量的胞存在。個(gè)人認(rèn)為，照組和處盡量不要開計(jì)數(shù)，因?yàn)榧?xì)胞數(shù)目的差異會嚴(yán)影響實(shí)驗(yàn)果。如果需要對胞預(yù)處理不得不分計(jì)數(shù)，那么計(jì)數(shù)一定要多重復(fù)幾次力求準(zhǔn)確盡量保證對照組處理組細(xì)密度一致2．3接種胞①細(xì)胞液100－200μl加入Transwell小，不同公司的、不同大的Transwell室對細(xì)胞懸量有不同求，請參說明書。24板小一般200μl。②孔下室一加入500μl含F(xiàn)BS或趨化因的培養(yǎng)基同培養(yǎng)板加的量有不同要求，具體請考說明書這里要特注意的是，下層培養(yǎng)液和小室間常有氣泡產(chǎn)，一旦產(chǎn)生氣泡下層培養(yǎng)的趨化作就減弱甚至消失了，在種板的時(shí)候特別留心一旦出現(xiàn)氣泡，將小室提，去除氣，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板。③養(yǎng)細(xì)：常規(guī)培養(yǎng)－48h主要依細(xì)胞侵襲能力而定）。時(shí)間點(diǎn)的選除了要考慮到細(xì)胞細(xì)侵襲力外處理因素細(xì)胞數(shù)目的影響也不可忽視。以我的課題例，我使的藥物不會抑制腫瘤細(xì)胞侵襲力，還對細(xì)胞殖有明顯制。我選擇的藥濃度是用選出的72h的IC50。這個(gè)濃度處理細(xì)胞，內(nèi)細(xì)胞增殖并無明顯制，但24h，抑作用就開始現(xiàn)了。所，用這個(gè)度來做Transwell，處理時(shí)間也須限定在，否則旦藥物抑制了細(xì)胞增殖或者誘導(dǎo)出亡，使處組

細(xì)胞數(shù)目少對照組，么就難以定穿過膜的細(xì)胞比對照組少，究竟由于侵襲抑制引起，還是理后細(xì)胞目本身就對照組少而引起的了。時(shí)間過長不以，同樣過短也不，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)會有一定量的儲存，短時(shí)間內(nèi)可能侵襲能力不有太大改。同時(shí)從物被吸收進(jìn)去，進(jìn)而發(fā)揮作用，影MMPs表，到最后釋放到培基中，還要一個(gè)過。時(shí)間點(diǎn)的選擇可盡量長點(diǎn)，也可擇多個(gè)時(shí)點(diǎn)研究時(shí)間依賴應(yīng)，但前是這個(gè)時(shí)范圍內(nèi)細(xì)胞數(shù)目不能有明顯變化。另外，我看細(xì)胞在小內(nèi)的形態(tài)是正常培養(yǎng)貼壁的形態(tài)，而是圓形，仍是懸時(shí)的形態(tài)，不過聚集成團(tuán)所以看到胞不正常貼壁也不要緊張，是正常象在培養(yǎng)過程，膜下會漸有少量氣泡產(chǎn)生，這是正常現(xiàn)象，可不予理，但我到過培養(yǎng)一段時(shí)后，膜下現(xiàn)了大氣，幸虧及時(shí)發(fā)現(xiàn)，否則后果將非常重。因此個(gè)人建議，最好種細(xì)胞后12h把培養(yǎng)板培養(yǎng)箱里出來看看確信沒有大氣泡產(chǎn)生。2．4結(jié)果計(jì)檢測穿過的胞數(shù)有兩方法：2．4．1直接數(shù)法2．4．1．1貼壁”胞計(jì)數(shù)這里所謂的貼壁”是細(xì)胞穿過后，可以附著在膜的下室側(cè)而不會到下室里去。通過給細(xì)胞色，可在下計(jì)數(shù)細(xì)①棉簽去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)②色常的染色方法有結(jié)晶紫染、臺藍(lán)染色Giemsa染色蘇木精染伊紅染色。個(gè)人推薦采0.1%結(jié)紫染色這種方法有下優(yōu)勢：(1).不需要固定胞，直接染色即可。(2).配簡單方便(3).染色后可以33%醋酸脫，將結(jié)晶紫完全洗脫下，洗脫液在酶標(biāo)儀上570nm測其OD值，間反映細(xì)胞數(shù)個(gè)人認(rèn)為是結(jié)晶紫色最大的優(yōu)勢所在。因?yàn)椋m然經(jīng)過準(zhǔn)的細(xì)胞計(jì)往往穿過膜細(xì)胞數(shù)仍難以準(zhǔn)確控制可能某一批實(shí)穿過的細(xì)會特別多致細(xì)胞堆這種情況下難以計(jì)數(shù)了這種情況下就可以用醋脫色后用標(biāo)儀檢測。使用結(jié)紫染色要意，染色要將膜風(fēng)干，否則可能會染不上。③胞計(jì)：我們使用的是LeicaDC300F正置顯鏡進(jìn)行察和拍照，Transwell小室反過來底朝上可清楚看小室底膜下室側(cè)附著的細(xì)胞。也有不少人用術(shù)刀將膜下后染色再貼在玻片滴二甲再上蓋玻片可以長保存是這樣