人教版DNA的粗提取與鑒定教學(xué)設(shè)計(jì)

專(zhuān)題5DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)【課題目標(biāo)】本課題通過(guò)嘗試對(duì)植物或動(dòng)物組織中的DNA進(jìn)行粗提取，了解DNA的物理化學(xué)性質(zhì)，理解DNA粗提取以及DNA鑒定的原理?！菊n題重點(diǎn)與難點(diǎn)】課題重點(diǎn)：DNA的粗提取和鑒定方法。課題難點(diǎn)：DNA的粗提取和鑒定方法?！局R(shí)要點(diǎn)】的物理化學(xué)性質(zhì)，尤其是DNA的溶解性；2.二苯胺法鑒定DNA的方法和原理?！緦W(xué)習(xí)導(dǎo)航】DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)，包括DNA的提取、蛋白質(zhì)的提取、DNA片段的擴(kuò)增等，是開(kāi)展分子生物學(xué)研究的基本技術(shù)。本專(zhuān)題將從基礎(chǔ)入手，學(xué)習(xí)DNA的粗提取、PCR技術(shù)和血紅蛋白的提純。學(xué)習(xí)這些技術(shù)，不僅能夠幫助學(xué)生初步了解分子生物學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)方法，而且能夠鞏固必修課中學(xué)習(xí)的有關(guān)DNA和蛋白質(zhì)的理論知識(shí)。本專(zhuān)題的3個(gè)課題相對(duì)獨(dú)立，沒(méi)有嚴(yán)格的先后順序。課題1的操作難度不高，學(xué)生比較容易獲得結(jié)果。課題2的操作難度也不高，但PCR技術(shù)的原理是難點(diǎn)，學(xué)生要充分利用教材的圖文資料，并且在教師的引導(dǎo)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。課題3的操作難度比較大，所以學(xué)生一定要在教師的精心指導(dǎo)下完成操作。課題1DNA的粗提取與鑒定[導(dǎo)學(xué)誘思]1．提取DNA的方法提取生物大分子的基本思路是。對(duì)于DNA的粗提取而言，就是要利用、等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分。1）DNA的溶解性DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的中溶解度不同，利用這一特點(diǎn)，選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度就能使充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀，或者相反，以達(dá)到分離目的。圖5—1是DNA在NaCl溶液中的溶解度曲線，請(qǐng)根據(jù)曲線圖，思考：①在什么濃度下，DNA的溶解度最??？DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何變化的？②如何通過(guò)控制NaCl溶液的濃度使DNA在鹽溶液中溶解或析出？此外，DNA不溶于溶液，但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)則溶于酒精。利用這一原理，可以將DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步的分離。2）DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性蛋白酶能水解，但是對(duì)沒(méi)有影響。大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60—80oC的高溫，而DNA在以上才會(huì)變性。洗滌劑能夠瓦解，但對(duì)DNA沒(méi)有影響。3）DNA的鑒定在條件下，DNA遇會(huì)被染成色，因此二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。2．實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1）實(shí)驗(yàn)材料的選取凡是含有的生物材料都可以考慮，但是使用的生物組織，成功的可能性更大。在下面的生物材料中選取適合的實(shí)驗(yàn)材料：魚(yú)卵、豬肝、菜花（花椰菜）、香蕉、雞血、哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞、獼猴桃、洋蔥、豌豆、菠菜、在液體培養(yǎng)基的大腸桿菌思考：哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞的特點(diǎn)？2）破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液動(dòng)物細(xì)胞的破碎比較容易，以雞血細(xì)胞為例，在雞血細(xì)胞液中加入一定量的，同時(shí)用攪拌，過(guò)濾后收集濾液即可。如果實(shí)驗(yàn)材料是植物細(xì)胞，需要先用溶解細(xì)胞膜。例如，提取洋蔥的DNA時(shí)，在切碎的洋蔥中加入一定的和，進(jìn)行充分的攪拌和研磨，過(guò)濾后收集研磨液。思考：①為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂？②加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？③如果研磨不充分，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響?④此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分？3）去除濾液中的雜質(zhì)閱讀課本的三個(gè)方案，思考：為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)？方案二與方案三的原理有什么不同？4）DNA的析出與鑒定將處理后的溶液過(guò)濾，加入與濾液體積、冷卻的，靜置，溶液中會(huì)出現(xiàn)，這就是粗提取的DNA。用玻璃棒攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水分。取兩支20ml的試管，各加入物質(zhì)的量濃度為的NaCl溶液5ml，將絲狀物放入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向兩支試管中各加入4ml的?；旌暇鶆蚝?，將試管置于中加熱5min，待試管冷卻后，比較兩支試管溶液顏色的變化，看看溶解有DNA的溶液是否變。3．操作提示以血液為實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，每100ml血液中需要加入3g，防止。加入洗滌劑后，動(dòng)作要、，否則容易產(chǎn)生大量的泡沫，不利于后續(xù)步驟地操作。加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要，以免，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。二苯胺試劑要，否則會(huì)影響鑒定的效果。4．結(jié)果分析與評(píng)價(jià)[疑難點(diǎn)撥]的溶解度與NaCl溶液濃度的關(guān)系：當(dāng)NaCl溶液濃度低于L時(shí)，隨濃度的升高，DNA的溶解度降低；當(dāng)NaCl溶液濃度高于L時(shí)，隨濃度升高，DNA的溶解度升高。2.制備雞血細(xì)胞液時(shí)，要在新鮮的雞血中加入檸檬酸鈉的原因制備雞血細(xì)胞液時(shí)，要在新鮮的雞血中加入抗凝劑——檸檬酸鈉，防止血液凝固。其原理是檸檬酸鈉能與血漿中Ca2+發(fā)生反應(yīng)，生成檸檬酸鈣絡(luò)合物，血漿中游離的Ca2+大大減少，血液便不會(huì)凝固，因?yàn)殡u血紅細(xì)胞，白細(xì)胞都有細(xì)胞核，DNA主要存在于細(xì)胞核中，所以在離心或靜置沉淀后，要棄出上層清液——血漿。3．提取DNA的第一步是材料的選取，其目的是一定要選取DNA含量較高的生物材料，否則會(huì)由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中或多或少的損失而造成檢測(cè)的困難；第二步是DNA的釋放和溶解，這一步是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵，要盡可能使細(xì)胞內(nèi)的DNA全部溶解；第三步是DNA的純化，即根據(jù)DNA的溶解特性、對(duì)酶及高溫的耐受性的不同等特性，最大限度地將DNA與雜質(zhì)分開(kāi)；最后一步是對(duì)DNA進(jìn)行鑒定，這是對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的檢測(cè)。4．在DNA的析出的步驟中用到玻璃棒攪拌時(shí)，注意動(dòng)作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。5．盛放雞血細(xì)胞液的容器，最好是塑料容器。雞血細(xì)胞破碎以后釋放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，由于細(xì)胞內(nèi)DNA的含量本來(lái)就比較少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就會(huì)更少。因此，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中最好使用塑料的燒杯和試管，這樣可以減少提取過(guò)程的DNA的損失。[典例解析]本實(shí)驗(yàn)中有三次過(guò)濾：⑴過(guò)濾用蒸餾水稀釋過(guò)的雞血細(xì)胞液⑵過(guò)濾含粘稠物的LNaCl溶液⑶過(guò)濾溶解有DNA的2mol/LNaCl溶液以上三次過(guò)濾分別為了獲得（）A含核物質(zhì)的濾液、紗布上的粘稠物、含DNA的濾液B含核物質(zhì)的濾液、濾液中DNA粘稠物、含DNA的濾液C含核物質(zhì)的濾液、濾液中DNA粘稠物、紗布上的DNAD含較純的DNA濾液、紗布上的粘稠物、含DNA的濾液答案：A解析:用蒸餾水稀釋雞血細(xì)胞液，使血細(xì)胞的細(xì)胞膜、核膜破裂，釋放出核物質(zhì)，此時(shí)過(guò)濾只能得到含DNA和其他物質(zhì)如蛋白質(zhì)的濾液，這種濾液必須經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)中其他步驟得相繼處理，方能得到較純的DNA。DNA在LNaCl溶液中溶解度最低，成絲狀粘稠物，可經(jīng)過(guò)濾留在紗布上?！菊n本問(wèn)題答案和提示】（一）旁欄思考題1．為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂？答：蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)胞來(lái)說(shuō)是一種低滲液體，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞脹裂，再加上攪拌的機(jī)械作用，就加速了雞血細(xì)胞的破裂(細(xì)胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA。2．加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？答：洗滌劑是一些離子去污劑，能溶解細(xì)胞膜，有利于DNA的釋放；食鹽的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。3．如果研磨不充分，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？答：研磨不充分會(huì)使細(xì)胞核內(nèi)的DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等。4．此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分？答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質(zhì)。5．為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)？答：用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過(guò)反復(fù)溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)。6．方案二與方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開(kāi)；方案三利用的是DNA和蛋白質(zhì)對(duì)高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離。（二）練習(xí)1．答：提取DNA的第一步是材料的選取，其目的是一定要選取DNA含量較高的生物材料，否則會(huì)由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中或多或少的損失而造成檢測(cè)的困難；第二步是DNA的釋放和溶解，這一步是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵，要盡可能使細(xì)胞內(nèi)的DNA全部溶解；第三步是DNA的純化，即根據(jù)DNA的溶解特性、對(duì)酶及高溫的耐受性的不同等特性，最大限度地將DNA與雜質(zhì)分開(kāi)；最后一步是對(duì)DNA進(jìn)行鑒定，這是對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的檢測(cè)。2．答：提取蛋白質(zhì)比提取DNA的難度大。這是因?yàn)?，與DNA相比，蛋白質(zhì)對(duì)溫度、鹽濃度、pH等條件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)多種多樣，理化性質(zhì)各不相同，使得蛋白質(zhì)的提取沒(méi)有一種統(tǒng)一的方法，只能根據(jù)特定蛋白質(zhì)的特性摸索提取的條件，設(shè)計(jì)特定的方法。[課堂演練]一、選擇題（10個(gè)）1.在研究DNA的基因樣本前，采集來(lái)的血樣需要蛋白水解酶處理，然后用有機(jī)溶劑除去蛋白質(zhì)。用蛋白水解酶處理血樣的目的是（D）A.除去血漿中的蛋白質(zhì)B.除去染色體上的蛋白質(zhì)C.除去血細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)D.除去血細(xì)胞中的所有的蛋白質(zhì)，使DNA釋放，便于進(jìn)一步提純2．與析出DNA粘稠物有關(guān)的敘述，不正確的是（C）A.操作時(shí)緩緩滴加蒸餾水，降低DNA的溶解度B.在操作A時(shí)，用玻璃棒輕緩攪拌，以保證DNA分子完整C.加蒸餾水可同時(shí)降低DNA和蛋白質(zhì)的溶解度，兩者均可析出D.當(dāng)絲狀粘稠物不再增加時(shí)，此時(shí)NaCl的濃度相當(dāng)于L3．洗滌劑能夠瓦解（B），但對(duì)DNA沒(méi)有影響。A.細(xì)胞壁B.細(xì)胞膜C.細(xì)胞核D.細(xì)胞質(zhì)4．在沸水浴的條件下，DNA遇（D）會(huì)被染成藍(lán)色。A.斐林試劑B.蘇丹Ⅲ染液C.雙縮脲試劑D.二苯胺5．在DNA提取過(guò)程中，最好使用塑料試管和燒杯，目的是（B）A.不易破碎B.減少提取過(guò)程中DNA的損失C.增加DNA的含量D.容易洗刷6．下列操作中，對(duì)DNA的提取量影響最小的是（B）A.使雞血細(xì)胞在蒸餾水中充分破裂，放出DNA等核物質(zhì)B.攪拌時(shí)，要使用玻璃棒沿一個(gè)方向輕緩攪拌C.在“析出DNA粘稠物”時(shí)，要緩緩加蒸餾水，直至溶液中粘稠物不再增加D.在用酒精沉淀DNA時(shí)，要使用冷酒精，甚至再將混合液放入冰箱中冷卻E在DNA的溶解和再溶解時(shí)，要充分?jǐn)嚢?．DNA的粗提取中，將與濾液體積相等的、冷卻的（D），靜置2—3min，溶液中會(huì)出現(xiàn)白色絲狀物。．9%的NaCl的NaCl溶液C.質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%的HClD.體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精溶液8.以血液為實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，需要向血液中加入（C），防止血液凝固。A.醋酸鈉B.龍膽紫C.檸檬酸鈉D.醋酸洋紅9.在向溶解DNA的NaCl溶液中，不斷加入蒸餾水的目的是（C）A.加快溶解DNA的速度B.加快溶解雜質(zhì)的速度C.減少DNA的溶解度，加快DNA析出D.減小雜質(zhì)的溶解度，加快雜質(zhì)的析出10.去除濾液中的雜質(zhì)時(shí)，直接在濾液中加入嫩肉粉，利用嫩肉粉中的（C）分解蛋白質(zhì)。A.胃蛋白酶B.胰蛋白酶C.木瓜蛋白酶D.腸肽酶二、非選擇題（3個(gè)）1．提取雞血中DNA時(shí)，要除去血液中的上清液，這是因?yàn)槭裁?？答案：因?yàn)樯锨逡菏茄獫{，不含有血細(xì)胞，DNA存在于沉郁試管底部的雞血細(xì)胞的細(xì)胞核中，所以提取雞血中的DNA時(shí)，要除去血液中的上清液。2．填寫(xiě)本實(shí)驗(yàn)完成下列實(shí)驗(yàn)操作時(shí)所用試劑。⑴提取雞血細(xì)胞中核物質(zhì)⑵溶解核內(nèi)DNA：⑶析出2mol/LNaCl溶液中的DNA⑷DNA粘稠物的再溶解⑸提取雜質(zhì)較少的DNA白色乳狀絲狀物⑹DNA的鑒定答案：⑴蒸餾水⑵2mol/LNaCl溶液⑶蒸餾水⑷2mol/LNaCl溶液⑸冷卻的95%的酒精⑹二苯胺3.關(guān)于DNA粗提取的實(shí)驗(yàn)材料的選擇，也經(jīng)過(guò)了多次實(shí)驗(yàn)效果的比較，最終選擇雞血做實(shí)驗(yàn)材料的原因是什么？請(qǐng)回答下列問(wèn)題：⑴雞血細(xì)胞中紅細(xì)胞，家雞屬于鳥(niǎo)類(lèi)，新陳代謝旺盛，因而血液中細(xì)胞樹(shù)木較多，可以提供豐富的。⑵實(shí)驗(yàn)前由老師制備血細(xì)胞液供同學(xué)們做實(shí)驗(yàn)材料，而不用雞全血，主要原因是。⑶生活在牧區(qū)的人們，采集牛、羊和馬血比較方便，若他們按實(shí)驗(yàn)要求完成實(shí)驗(yàn)步驟后，結(jié)果是，這是因?yàn)檫@些動(dòng)物和人一樣，成熟的紅細(xì)胞中，但若改用動(dòng)物肝臟做實(shí)驗(yàn)材料，實(shí)驗(yàn)?zāi)茼樌M(jìn)行。這是因?yàn)?。⑷若選用動(dòng)物肝臟做實(shí)驗(yàn)材料，在提取之前，最好增加程序，使組織