分子生物學蛋白質組學的研究方法和進展

分子生物學蛋白質組學的研究方法和進展第1頁/共67頁2023/3/21220世紀生命科學的輝煌成就1953年Watson&Crick，DNA雙螺旋結構提出1957年，“中心法則”的問世20世紀90年代，人類基因組計劃（HGP）第2頁/共67頁2023/3/213基因組計劃的局限無法解決“基因精細調控”問題“mRNA”

無法反映蛋白質的質與量。第3頁/共67頁2023/3/214

以往人類對于蛋白質的研究只是針對生命活動中某一種或某幾種蛋白質，難以形成一種整體觀，難以系統(tǒng)透徹地闡釋生命活動的基本機制。大規(guī)模、全方位的蛋白質研究勢在必行。第4頁/共67頁2023/3/215

第一節(jié)蛋白質組學的概念及其發(fā)展史第5頁/共67頁2023/3/216蛋白質組（proteome）

同一基因組在不同細胞、不同組織中蛋白質表達各不相同?？臻g和時間上呈動態(tài)變化。

由一個細胞或一個組織的基因組所表達的全部蛋白質。第6頁/共67頁2023/3/217蛋白質組學(proteomics)

從整體角度分析細胞內動態(tài)變化的蛋白質組成、表達水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質之間相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質功能與細胞生命活動規(guī)律。第7頁/共67頁2023/3/218主要研究內容了解特定的細胞、組織或器官表達的蛋白質種類；

明確各種蛋白質分子相互作用網(wǎng)絡；

描繪蛋白質的精確三維結構，揭示其結構上的關鍵部位，如與藥物結合并且決定其活性的部位。

第8頁/共67頁2023/3/219功能蛋白質組學

(functionalproteomics)

細胞在一定階段或與某一生理現(xiàn)象相關的全部蛋白質。第9頁/共67頁2023/3/2110國際研究進展1996年，澳大利亞建立了世界上第一個蛋白質組研究中心（APAF）美國NCI——

肺、直腸、乳腺和卵巢等腫瘤的蛋白質組數(shù)據(jù)庫NCI與FDA

——

有關癌癥不同發(fā)病階段和治療階段的蛋白質組數(shù)據(jù)庫英國、法國、德國、日本等國也分別投入巨資進行蛋白質組學的研究第10頁/共67頁2023/3/2111TheHUPOWorld…CanadaUSAChinaJapanKoreaAsiaOceaniaSwedenRussiaUnitedKingdomItalyGermanyFranceLatinAmericaAustraliaTheHumanProteomeOrganisation第11頁/共67頁2023/3/21121.HumanLiverProteomeProject(HLPP)2.HumanBrainProteomeProject(HBPP)3.ProteomicStandardsInitiative(PSI)4.HumanAntibodyInitiative(HAI)5.PlasmaproteomeProject(PPP)6.MouseModelsHumanDisease(MMHD)7.HumanDiseaseGlycomics/ProteomeInitiative(HGPI)8.HUPOCardiovascularInitiative(HUPOCVI)第12頁/共67頁2023/3/2113國內進展國家自然科學基金委于1997年設立了重大項目“蛋白質組學技術體系的建立”1998年啟動了蛋白質組學研究中國科學院生物化學研究所、軍事醫(yī)學科學院等單位啟動蛋白質組研究中國科學院上海生命科學研究院、軍事醫(yī)學科學院與復旦大學相繼成立了專門的蛋白質組學研究中心第13頁/共67頁2023/3/2114

科技部已將疾病蛋白質組研究列入我國“973”計劃項目和“863”計劃項目；國家自然科學基金委員會也將“蛋白質組研究”列為重點項目。我國在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白質組研究方面取得了較大進展。第14頁/共67頁2023/3/2115

第二節(jié)蛋白質組學研究方法概述第15頁/共67頁2023/3/2116一、蛋白質組表達模式研究方法研究蛋白質組的組成成分主要技術有雙向凝膠電泳、以質譜為代表的蛋白質鑒定技術及生物信息學技術。

第16頁/共67頁2023/3/2117（一）蛋白質組研究中的樣品制備

采用細胞或組織的全蛋白質組分進行蛋白質組分析。進行樣品預分級，將細胞或組織中的全體蛋白質分成不同部分，分別進行研究，提高低豐度蛋白質的上樣量和檢測靈敏度。第17頁/共67頁2023/3/2118樣品預分級的主要依據(jù)蛋白質溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白質定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白質細胞器定位：線粒體、高爾基體、葉綠體等

第18頁/共67頁2023/3/2119組織水平蛋白質組樣品制備

原因：臨床樣本都是各種細胞或組織混雜，而且狀態(tài)不一，如腫瘤中癌變的上皮類細胞總是與血管、基質細胞等混雜。第19頁/共67頁2023/3/2120激光捕獲顯微切割(lasercapturemicrodissection，LCM)

可直接在顯微鏡下從組織切片中精確分離特定的細胞或細胞群。第20頁/共67頁2023/3/2121（二）蛋白質組研究中的樣品分離雙向凝膠電泳(two-dimensionalelectrophoresis,2-DE)

利用蛋白質等電點和分子量差異，結合凝膠化學特性，分離各種蛋白質的方法。第21頁/共67頁2023/3/2122工作原理：根據(jù)蛋白質等電點的不同進行第一向等電聚焦電泳分離轉移到第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，再根據(jù)相對分子質量大小不同進行分離第22頁/共67頁2023/3/2123等電聚焦電泳進行過程中等電聚焦電泳結束后（＋）（＋）（－）（－）低pH低pH高pH高pH第一向等電聚焦電泳（isoelectrophoresisfocusing,IEF）聚丙烯酰胺凝膠內的緩沖液在電場作用下沿電場方向在凝膠內制造一個pH梯度。每種蛋白質都將遷移至與它的pI相一致的pH處。第23頁/共67頁2023/3/2124固相pH梯度等電聚焦的優(yōu)點克服了載體兩性電解質陰極漂移等缺點?？梢跃_設定pH梯度。尤其可在較窄的pH范圍內進行第二輪分析，大大提高了分辨率及重復性。

第24頁/共67頁2023/3/2125雙向凝膠垂直電泳雙向電泳后的凝膠經(jīng)染色后蛋白呈現(xiàn)二維分布圖：水平方向反映出蛋白在pI上的差異，垂直方向反映分子量上的差別。第二向SDS電泳第25頁/共67頁2023/3/21263-4mm70-240mmgelPlasticbacking固相pH梯度等電聚焦電泳（第一向）示意圖第26頁/共67頁2023/3/2127SDS-PAGESDS電泳（第二向）示意圖第27頁/共67頁2023/3/2128

二維電泳的主要步驟：

1.樣品準備

2.第一維：固相pH梯度等電聚焦

3.第二維：SDS電泳

4.染色：考馬氏亮蘭或銀染

5.圖像分析：肉眼或自動掃描第28頁/共67頁2023/3/2129Gelstaining1stdimensionIEF2nddimensionSDSImaginganddataevaluationSpotexcisionandmassspectrometrySamplepreparation2-DE流程圖第29頁/共67頁2023/3/2130蛋白質二維電泳圖譜3010kDapH10pH3pI第30頁/共67頁2023/3/2131低分化星形膠質細胞瘤中表達明顯上調蛋白cAMP-dependent

proteinkinase(L4)1212L4L4Low-gradeHigh-gradeTCP-1-epsilon(L2)Proteindisulfide

isomeraseA3(L3)6659L2L3L2L36659Low-gradeHigh-gradeDihydropteridinereductase(L5)3636L5L5Low-gradeHigh-grade3944L13944L1Low-gradeHigh-gradeGlialfibrillaryacidicprotein,astrocyte(L1)第31頁/共67頁2023/3/2132Low-gradeHigh-gradePeroxiredoxin6(H5)ApoliproteinA-I(H4)4040H4H413134848H5H5FibrinogenfragmentD(H3)-Internexin(H1)H1H168686868H2H2H3H3Actin,cytoplasmic1(H2)Low-gradeHigh-gradeLow-gradeLow-gradeHigh-gradeHigh-grade高分化星形膠質細胞瘤中表達明顯上調蛋白第32頁/共67頁2023/3/2133二維電泳優(yōu)點

可分離10～100kD范圍內蛋白質高靈敏度和高分辨率便于計算機進行圖像分析處理與質譜分析匹配第33頁/共67頁2023/3/2134二維電泳缺點

極酸、極堿性蛋白質，疏水性蛋白質，極大蛋白質、極小蛋白質及低豐度蛋白質用此種技術難于有效分離。膠內酶解過程費時、費力，難于與質譜聯(lián)用實現(xiàn)自動化。

第34頁/共67頁2023/3/2135新型非凝膠技術

液相色譜法分配色譜法吸附色譜法離子交換色譜法排阻色譜法毛細管電泳LabAllianceModel2000二元高壓半制備梯度系統(tǒng)第35頁/共67頁2023/3/2136（三）蛋白質組研究的樣品鑒定

基本原理：樣品分子離子化后，根據(jù)離子間質荷比(m/z)的差異來分離并確定樣品的分子量。

第36頁/共67頁2023/3/2137SpotidentificationSpotPickingDigestionMSAnalysisandDatabasesearchSpotcutterSpotsofinterest第37頁/共67頁2023/3/2138

生物質譜技術(MassSpectrometry)

通過測定樣品離子的質荷（m/z）來進行成分和結構分析。MolecularsIonsDetectorSuccessfulionpathQuadrupoleIonAnalyzerElectronImpactIonizer第38頁/共67頁2023/3/2139“軟電離”的特點分子電離時保留整個分子的完整性，不會形成碎片離子。靈敏度高、快速、能同時提供樣品的精確分子量和結構信息、既可定性又可定量、并能有效地與各種色譜聯(lián)用來分析復雜體系。

第39頁/共67頁2023/3/2140基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜（matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry，MALDI-TOFMS）

電噴霧質譜（electrosprayionizationmassspectrometry，ESI-MS）

主要質譜類型第40頁/共67頁2023/3/2141鑒定和注釋蛋白質的路線

通過肽質譜指紋圖(peptidemassfinger-printing,PMF)和數(shù)據(jù)庫搜尋匹配通過測出樣品中部分肽段二級質譜信息或氨基酸序列標簽和數(shù)據(jù)庫搜尋匹配第41頁/共67頁2023/3/2142SampleMSSpectrum第42頁/共67頁2023/3/2143典型二級質譜圖第43頁/共67頁2023/3/2144肽質譜指紋圖在數(shù)據(jù)庫中匹配不成功的可能原因樣品量太少，PMF圖信噪比太低2-DE膠上所取的一個蛋白質點并非單一蛋白質角蛋白或其他蛋白質的污染蛋白質發(fā)生較多的轉譯后修飾，數(shù)據(jù)庫中未有記載所用胰蛋白酶質量不夠好，蛋白酶自酶解片段多未知的新蛋白質

數(shù)據(jù)庫規(guī)模太小第44頁/共67頁2023/3/2145

組織切片或印片原位質譜分析技術兩級飛行時間串聯(lián)質譜（MALDI-TOF/TOF）傅里葉轉換回旋共振質譜（FTMS）表面增強激光解吸/電離飛行時間質譜（SELDI-TOF-MS）

聯(lián)合技術精確鑒定蛋白質

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液質聯(lián)用技術（LC-MS/MS）

蛋白質混合物通過液相色譜分離以代替2-DE的分離,然后進入MS系統(tǒng)獲得肽段分子量,再通過串聯(lián)MS技術,得到部分序列信息,最后通過計算機聯(lián)網(wǎng)查詢、鑒定。第46頁/共67頁2023/3/2147

根據(jù)蛋白質帶電性及疏水性不同，用MS分離多肽復合物。

多維色譜技術（LC/LC-MS/MS）多維蛋白質鑒定技術

(multidimensionalproteinidentificationtechnology)

第47頁/共67頁2023/3/2148（四）蛋白質組學研究的生物信息學

生物信息學是蛋白質組學研究的一個不可缺少的部分。

構建和分析雙向凝膠電泳圖譜

數(shù)據(jù)庫的搜索與構建第48頁/共67頁2023/3/2149蛋白質組數(shù)據(jù)庫SWISS-PROT:http://www.expasy.ch/sprot/

擁有目前世界上最大、種類最多的蛋白質組數(shù)據(jù)庫。NRDB:http://www.nrdb.co.uk/dbEST:/NCBI:/Genomes/EMBL:/

Prosite：/prosite/PDB：/pdb/目前應用最普遍數(shù)據(jù)庫第49頁/共67頁2023/3/2150secondarystructure–localspatialarrangementb-sheeta-helixprimarystructure–aminoacidsequenceDRLEFIVTALLKPWN-terminusC-terminustertiarystructure–proteinfoldingquaternarystructure–multimericcomplexes二、蛋白質功能模式的研究方法第50頁/共67頁2023/3/2151結構蛋白質組學（StructuralProteomics）第51頁/共67頁2023/3/2152（一）蛋白質翻譯后修飾的研究糖基化、乙?；⒓谆?、羧基化二硫鍵配對、焦谷氨酸化蛋白質降解······第52頁/共67頁2023/3/2153（二）蛋白質相互作用研究技術生命的基本過程是不同功能蛋白質在時空上有序和協(xié)同作用新陳代謝以蛋白質復合體或多蛋白質網(wǎng)絡協(xié)同作用實現(xiàn)細胞信號轉導及病原體感染和免疫反應

第53頁/共67頁2023/3/21541989年Field和Song等人在酵母細胞中設計的分析蛋白質相互作用的方法。真核細胞轉錄激活因子(GAL4)的結構和活性特點為基礎的。N端含NLS和與酵母GAL1基因啟動子上游激活序列(UASG)結合的結構域。C端含GAL1轉錄激活結構域1.酵母雙雜交系統(tǒng)（yeasttwo-hybridsystem）

第54頁/共67頁2023/3/2155系統(tǒng)構建分別構建含GAL4BD

和AD

的兩個酵母融合蛋白表達載體；建立含特殊基因型、適用于雙雜交體分析的酵母菌株。

第55頁/共67頁2023/3/2156酵母雙雜交（YeastTwo-Hybrid）第56頁/共67頁2023/3/2157主要特點和優(yōu)勢使蛋白質表現(xiàn)型和基因型相聯(lián)系篩選cDNA文庫真實反應體內蛋白質間相互作用情況不需分離靶蛋白敏感性高

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