第3章蛋白質(zhì)化學(xué)課件

第3章蛋白質(zhì)化學(xué)課件蛋白質(zhì)是由20種L-α-氨基酸縮合而成的長鏈分子(多肽鏈polypeptidechain)。蛋白質(zhì)作為生物體的最重要的組分，是生活細(xì)胞中含量最豐富、功能最復(fù)雜的生物大分子（分子量為6000~1000000D或更大）。幾乎參與所有的生命活動和生命過程。因此研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能是生命科學(xué)最基本的課題。大腸桿菌中約有3000種蛋白質(zhì)，真核細(xì)胞中約有35000種蛋白質(zhì)。FirefliesemitlightcatalyzedbyluciferasewithATPErythrocytescontainalargeamountofhemoglobins,theoxygen-transportingprotein.Theproteinkeratinisthechiefstructuralcomponentsofhair,scales,horn,wool,nailsandfeathers.

①催化作用③代謝調(diào)節(jié)④細(xì)胞運動⑤保護(hù)作用⑥物質(zhì)運輸⑦細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成胞通訊⑧參與遺傳⑨蛋白貯藏⑩其他淀粉酶溶菌酶DNA聚合酶

膠原蛋白膜蛋白伸展蛋白

胰島素生長素促甲狀腺激素肌動蛋白鞭毛纖毛蛋白抗體補(bǔ)體干擾素

血紅蛋白脂蛋白細(xì)胞色素蛋白受體蛋白味覺蛋白細(xì)胞表面抗原

轉(zhuǎn)錄因子阻遏蛋白細(xì)胞周期蛋白酪蛋白卵清蛋白麥醇溶蛋白毒蛋白

凝集素金屬蛋白蛋白質(zhì)的功能組成蛋白質(zhì)的元素組成蛋白質(zhì)的元素有：C、H、O、N和S，這些元素在蛋白質(zhì)中的組成百分比約為：C：50%H：7%O：23%N：16%S：0~3%其它(P、Mo、Fe等)微量元素。

平均含N量：16％平均殘基Mw:1102.1.1蛋白質(zhì)氨基酸結(jié)構(gòu)及分類2.1.1.1氨基酸結(jié)構(gòu)特點①組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸（脯氨酸除外）均為-AA。②除Gly外，其它Aa的-碳原子均為不對稱碳原子，因而均有兩種不同的空間構(gòu)型。20種AA在結(jié)構(gòu)上的差異取決于側(cè)鏈基團(tuán)R的不同。②除Gly外，其它AA的-碳原子均為不對稱碳原子，因而均有兩種不同的空間構(gòu)型：L-型（左）和D-型（右），二者互為對映體。L—丙氨酸D—丙氨酸D—甘油醛Inproteinchemistry,weuseGreekletternomenclature.2.1.1.2氨基酸的種類和結(jié)構(gòu)按R基的極性分⑴非極性AA（8種）:Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Pro、Trp;⑵極性AA(12種)：①R-基不帶電荷的AA（中性AA）：Gly、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Tyr②R-基帶正電荷的AA（堿性AA）：Lys、Arg、His③R-基帶負(fù)電荷的AA（酸性AA）：Glu,AspGly,GAla,AVal,VLeu,LMet,MIle,IPhe,F;Tyr,Y;Trp,WSer,SThr,TCys,CPro,PAsn,NGln,QLys,K;Arg,R;His,HAsp,D;Glu,E2.1.2氨基酸的理化性質(zhì)2.1.2.1氨基酸的兩性解離與等電點氨基酸的酸堿滴定氨基酸的酸堿滴定2.1.2.2氨基酸的化學(xué)性質(zhì)1、兩性解離和等電點⑴AA的兩性解離酸性溶液中的AA水溶液中的AA堿性溶液中有AA

（陽離子）（兼性離子）（陰離子）氨基酸的兩性解離性質(zhì)及等電點

pH=pI

凈電荷=0

pH<pI凈電荷為正pH>pI凈電荷為負(fù)NH2RCHRCOOHNH3+CHRCOOCHCOONH3++H++OH-+H++OH-(pK′1)(pK′2)

當(dāng)氨基酸溶液在某一定pH值時，使某特定氨基酸分子上所帶正負(fù)電荷相等，成為兩性離子，在電場中既不向陽極也不向陰極移動，此時溶液的pH值即為該氨基酸的等電點(isoelectricpoint，pI)。等電點（isoelectricpoint)在一定pH值時，Aa以兼性離子存在，在電場中不會向正、負(fù)極移動，此時的pH值稱氨基酸的等電點（pI）。

pI=1/2(pK1’

+pK2’)

酸性AapI=1/2(pK1’

+pKR’)

堿性AapI=1/2(pK2’

+pKR’)K1’

和

K2’

分別代表-C上的-COOH和-NH3+的表觀解離常數(shù)，如果側(cè)鏈R基上有可解離的基團(tuán)，用KR’

表示其表觀解離常數(shù)。表觀解離常數(shù)可用測定滴定曲線方法求得。、光吸收組成蛋白質(zhì)的20種Aa均不吸收可見光，在近紫外光區(qū)（220nm~300nm）Tyr、Trp、Phe有吸收光的能力，其吸收峰和摩爾消光系數(shù)為：

Tyrmax=278nm

Trpmax=279nm

Phemax=259nm

一般蛋白質(zhì)的最大吸收在280nm波長處，可用分光光度法測量蛋白質(zhì)含量。2、氨基酸的重要化學(xué)反應(yīng)

①、茚三酮反應(yīng)

氨基酸脫羧脫氨被氧化，水合茚三酮被還原，氧化型和還原型的水合茚三酮與氨反應(yīng)生成二酮茚-二酮茚胺的取代鹽等藍(lán)紫色化合物。

脯氨酸(Pro)或羥脯氨酸(Hyp)與茚三酮反應(yīng)，生成黃色化合物。常用于AA的定性和定量分析。水合茚三酮還原型水合茚三酮藍(lán)紫色物質(zhì)②Sanger反應(yīng)

在弱堿溶液中AA與2,4-二硝基氟苯（FDNB）反應(yīng)，生成黃色的二硝基苯氨基酸（DNP-AA），Sanger首先用此反應(yīng)鑒定多肽鏈或蛋白質(zhì)的NH2末端氨基酸。③Edman反應(yīng)

在弱堿條件下AA與異硫氰酸苯酯（PITC）反應(yīng)生成苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物，生成的衍生物可通過層析法分離鑒定，Edman首先用此反應(yīng)鑒定多肽的N-端AA。異硫氰酸苯酯(PITC)苯氨基硫甲酰衍生物苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物（PTC-氨基酸）（PTH-氨基酸）2.2肽(peptide)

2.2.1肽和肽鏈的結(jié)構(gòu)即命名氨基酸的-羧基與另一個氨基酸的-氨基脫水形成肽。肽鍵是蛋白質(zhì)分子中氨基酸連接的基本方式。肽鍵相連構(gòu)成了蛋白質(zhì)的主鏈。2.2肽(peptide)

2.2.1肽和肽鏈的結(jié)構(gòu)及命名氨基酸的-羧基與另一個氨基酸的-氨基脫水形成肽。肽鍵是蛋白質(zhì)分子中氨基酸連接的基本方式。肽鍵相連構(gòu)成了蛋白質(zhì)的主鏈。肽鍵⑴肽氨基酸間通過肽鍵聯(lián)結(jié)起來的化合物稱為肽。兩個氨基酸形成的肽叫二肽，三個氨基酸形成的肽叫三肽……，十個氨基酸形成的肽叫十肽，一般將十肽以下稱為寡肽(oligopeptide)，以上者稱為多肽(polypeptide)或稱多肽鏈。⑵氨基酸殘基(aminoacidresidues)肽鏈中的氨基酸在參加肽鍵形成時失去了1分子水，已經(jīng)不是原來完整的分子，稱為氨基酸殘基。⑶命名及書寫方式一條肽鏈通常含有一個游離的-氨基端(N-末端)和一個游離的-羧基端(C-末端)。規(guī)定肽鏈的氨基酸排列順序從其N-末端開始，到C-末端終止。常把N-末端氨基酸殘基放在左邊，C-末端氨基酸殘基放在右邊。小分子肽一般按其氨基酸殘基排列順序命名。絲氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸⑷二硫鍵連接氨基酸殘基的共價鍵除肽鍵外，兩個Cys殘基的側(cè)鏈之間可形成二硫鍵(disulfidebond)，即胱氨酸殘基中的二硫鍵。它可使兩條單獨的肽鏈共價交聯(lián)起來(鏈間二硫鍵)，或使一條鏈的某一部分形成環(huán)(鏈內(nèi)二硫鍵)。

氧化型

GSSG還原型GSH2.2.2重要的天然活性肽生物體內(nèi)存在很多游離的活性肽（activepeptide），它們具有特殊的生物學(xué)功能。如：催產(chǎn)素、加壓素、舒緩激肽、生長激素釋放因子、谷胱甘肽等。動植物細(xì)胞中的還原型谷胱甘肽，可作為某些氧化還原酶的輔酶，在細(xì)胞中作為-SH緩沖劑，維持細(xì)胞蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基處于還原態(tài)，并防止過氧化物累積。

Tyr-Gly-Gly-Phe-Met

酪氨酰甘氨酰甘氨酰苯丙氨酰蛋氨酸

Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu

酪氨酰甘氨酰甘氨酰苯丙氨酰亮氨酸

腦啡肽（5肽），近年來引起人們的關(guān)注，它們在中樞神經(jīng)中形成，具有鎮(zhèn)痛作用。是體內(nèi)產(chǎn)生的一類鴉片,但不上癮。后者有中科院上海生化所，1982年5月利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)合成。

催產(chǎn)素：8肽，能使多種平滑肌收縮，催產(chǎn)催乳；參與記憶。加壓素：8肽，可使小動脈收縮，增高血壓，減少排尿；促進(jìn)遺忘。促甲狀腺素釋放因子（TRH）短桿菌肽S某些抗生素也是肽或肽衍生物，如：短桿菌肽S（環(huán)10肽），放線菌素D和多粘菌素E等。α-鵝膏蕈堿：雙環(huán)8肽，劇毒。真核RNA聚合酶II高度敏感，RNA聚合酶III中度敏感，RNA聚合酶I不敏感，真核生物轉(zhuǎn)錄抑制劑。但不影響原核生物RNA合成。

功能性活性肽：功能性食品玉米肽（玉米降血壓肽），大豆肽，乳肽調(diào)節(jié)人體代謝，促進(jìn)免疫，抗菌、降血壓，促消化。2.3蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)具有三維空間結(jié)構(gòu)，執(zhí)行復(fù)雜的生物學(xué)功能，結(jié)構(gòu)與功能之間有密切關(guān)系。為了研究方便，將蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分為一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu)4個層次，同時在二、三級結(jié)構(gòu)間又劃分出超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域。2.3.1蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)中氨基酸的排列順序。1953年英國Sanger等人，完成了牛胰島素(Isulin)一級結(jié)構(gòu)測定工作，分子量為5700D，有A鏈(21AA)和B鏈(30AA)兩條肽鏈，兩個鏈間二硫鍵和一個鏈內(nèi)二硫鍵(A鏈)。1960年StanfordMoore等完成了牛胰核糖核酸酶(RNase)的分析，RNase由一條含124個氨基酸殘基的多肽鏈組成，分子內(nèi)含有4個鏈內(nèi)二硫鍵，分子量為12600。它是水解核糖核酸磷酸二酯鍵的酶。1967年Edman等發(fā)明的氨基酸序列分析儀1973年Moor等制造的氨基酸自動分析儀極大地推動了氨基酸序列測定的進(jìn)度。目前已對上千種蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了測定。蛋白質(zhì)的構(gòu)象和維持構(gòu)象的作用力蛋白質(zhì)的構(gòu)象(conformation)：蛋白質(zhì)分子是由氨基酸首尾相連而成的共價多肽鏈，每一種蛋白質(zhì)都有自己特有的構(gòu)象，而不是一條走向隨機(jī)的松散鏈，這樣才能保證其特有的性質(zhì)和功能。蛋白質(zhì)天然構(gòu)象主要是由氫鍵、離子鍵、疏水作用、范德華力等這些弱的作用力維持的，二硫鍵、酯鍵和配位鍵也參與蛋白質(zhì)構(gòu)象的維持。氫鍵：多肽鏈中電負(fù)性很強(qiáng)的N原子或O原子與N-H或O-H的H原子之間可形成氫鍵。鹽鍵(離子鍵)：蛋白質(zhì)分子中的某些氨基酸在生理pH條件下，其側(cè)鏈?zhǔn)菐щ姾苫鶊F(tuán)，它們之間可以形成離子鍵。疏水作用：介質(zhì)水分子對疏水基團(tuán)的排斥作用，疏水作用在維持蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和四級結(jié)構(gòu)的形成中占有重要作用。范德華力：范得華力雖然很弱，但在蛋白質(zhì)分子中它的數(shù)量較大，且具有加和性，因此也是形成和穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象的一種作用力。配位鍵：兩個原子之間由單方面提供共用電子對形成的共價鍵。如Fe2+、Cu2+、Zn2+等金屬離子以配位鍵與蛋白質(zhì)連接，參與蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的形成與維持。a.鹽鍵、b.f.氫鍵、c.疏水作用d.范得華力、e.二硫鍵、g.酯鍵2.3.3蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)(secondarystructure)多肽鏈(polypeptidechain)借助氫鍵盤旋折疊而形成的局部空間結(jié)構(gòu).主要有-螺旋結(jié)構(gòu),折疊結(jié)構(gòu),

轉(zhuǎn)角,無規(guī)則卷曲.2.3.2.1多肽鏈折疊的空間限制⑴肽平面(peptideplane)是組成多肽鏈的基本單位。多肽鏈?zhǔn)呛芏嗟碾钠矫嫱ㄟ^碳原子相連而成的。1肽鍵的鍵長在C—N與C=N之間，具有部分雙鍵性質(zhì)。不能自由旋轉(zhuǎn)。2肽鍵的四個原子和與之相連的兩個碳原子(C)都處在同一個剛性平面。且通常呈反式構(gòu)型。參與肽鍵形成的2個原子以及另外4個取代成員：羰基氧原子、酰胺氫原子、以及2個相鄰的-碳原子構(gòu)成了一個肽單位（peptidegroup）（圖2.2b）。肽鏈主鏈上只有C連接的兩個鍵(C–N、C–C)是單鍵，它們可以旋轉(zhuǎn)，繞(C–N)鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱角，繞(C–C)鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱ψ角，這兩個旋轉(zhuǎn)角度稱二面角(dihedralangle)?？杀硎境鱿噜彽碾钠矫娴南鄬ξ恢?。ψ=±180o

，

=±180o實際上肽鏈在構(gòu)象上受到很大的限制

一個蛋白質(zhì)的構(gòu)象取決于肽單位繞N-C鍵和C-N鍵的旋轉(zhuǎn)，這些鍵連接著多肽鏈中的剛性的肽單位。旋轉(zhuǎn)本身受到肽鏈的主鏈和相鄰殘基的側(cè)鏈原子之間的立體干擾的限制.圖2.5a表示的是肽鏈中的肽單位處于一種伸展?fàn)顟B(tài)；圖2.5b表示的是肽單位處于一種不穩(wěn)定構(gòu)象。當(dāng)C的一對二面角=180o、ψ=180o時，的兩個相鄰肽平面呈充分伸展的構(gòu)象。二者均為0o的構(gòu)象實際上不存在。2.3.2.2二級結(jié)構(gòu)的基本類型為了使暴露在多水介質(zhì)中的疏水基團(tuán)降低到最小程度，同時保持多肽鏈與周圍水分子之間形成的氫鍵相互作用的有利能量狀態(tài)，多肽鏈自發(fā)折疊形成由氫鍵維系的有規(guī)則的重復(fù)構(gòu)象，從而形成蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。⑴-螺旋結(jié)構(gòu)（-helix）1951年P(guān)auling和Corey對α-角蛋白(α-keratin)進(jìn)行X線衍射分析，從衍射圖中看到有0.5～0.54nm的重復(fù)單位，故推測蛋白質(zhì)分子中有重復(fù)性結(jié)構(gòu)，認(rèn)為這種重復(fù)性結(jié)構(gòu)為α-螺旋。天然蛋白質(zhì)絕大多數(shù)為右手螺旋。α-螺旋（可重復(fù)性結(jié)構(gòu)）特點：①多個肽鍵平面通過α-碳原子旋轉(zhuǎn)，相互緊密盤曲成規(guī)則的周期性構(gòu)象，即右手螺旋或左手螺旋。②主鏈呈螺旋上升，每3.6個氨基酸殘基上升一圈，相當(dāng)于0.54nm，每個Aa殘基沿軸上升0.15nm。③N-末端出發(fā)，氫鍵是由每個肽基的C＝O與前面第3個肽基的N-H之間形成。氫鍵的取向與中心軸平行。氫鍵是穩(wěn)定α－螺旋的主要鍵。α

-螺旋也叫3.613-螺旋④-螺旋中氨基酸側(cè)鏈R分布在螺旋外側(cè)，其形狀、大小及電荷影響α-螺旋的形成。酸性或堿性氨基酸集中的區(qū)域，由于同電荷相斥，不利于α-螺旋形成；較大的R(如苯丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸)集中的區(qū)域，也妨礙α-螺旋形成；脯氨酸因其α-碳原子位于五元環(huán)上，不易扭轉(zhuǎn)，加之它是亞氨基酸，不易形成氫鍵，故不易形成上述α-螺旋；甘氨酸的R基為H，空間占位很小，也會影響該處螺旋的穩(wěn)定。⑵折疊結(jié)構(gòu)（

pleated）Pauling等人曾對β-角蛋白進(jìn)行X線衍射分析，發(fā)現(xiàn)具有0.7nm的重復(fù)單位。如將毛發(fā)α-角蛋白在濕熱條件下拉伸，可拉長到原長二倍，這種α-螺旋的X線衍射圖可改變?yōu)榕cβ-角蛋白類似的衍射圖。說明β-角蛋白中的結(jié)構(gòu)和α-螺旋拉長伸展后結(jié)構(gòu)相同。

折疊也稱β-片層（pleatedsheet）conformation)是由兩條或多條幾乎完全伸展的多肽鏈側(cè)向通過氫鍵連接在一起，相鄰兩肽鏈以相同或相反方向平行排列成片狀。β-片層結(jié)構(gòu)特點：①肽鏈處于相當(dāng)伸展的結(jié)構(gòu)，肽鏈平面之間折疊成鋸齒狀，相鄰肽鍵平面間呈110°角。每個Aa殘基伸展的長度為0.35，Aa殘基的R側(cè)鏈伸出在鋸齒的上方或下方。②依靠兩條肽鏈或一條肽鏈內(nèi)的兩段肽鏈間的C=O與另一條的-NH基之間形成氫鍵，使構(gòu)象穩(wěn)定。③兩段肽鏈可以是平行的或是反平行的。④平行的β-片層結(jié)構(gòu)中，兩個殘基的間距為0.65nm；反平行的β-片層結(jié)構(gòu)，則間距為0.7nm。

蠶絲的主要成分是絲心蛋白，而絲心蛋白的主要二級結(jié)構(gòu)是-折疊。Pauling和Corey正是依據(jù)絲心蛋白的X-射線衍射圖提出了-折疊結(jié)構(gòu)。絲心蛋白含有的多肽鏈都是反平行排列的-折疊結(jié)構(gòu)。⑶

轉(zhuǎn)角（非重復(fù)結(jié)構(gòu)）（turn）也稱彎曲(bend)、回折(reverseturn)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)(hairpinstructure)，是指肽鏈出現(xiàn)的180o回折，由彎曲處的第一個Aa殘基的-C=O與第四個Aa殘基的-NH之間形成氫鍵(41氫鍵)。產(chǎn)生一種不很穩(wěn)定的環(huán)形結(jié)構(gòu)。⑷無規(guī)卷曲沒有確定規(guī)律性的部分肽鏈構(gòu)象，肽鏈中肽鍵平面不規(guī)則排列，屬于松散的無規(guī)卷曲(randomcoil)。2.3.4蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)(tertiarystructure)2.3.4.1超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域都是蛋白質(zhì)構(gòu)象中二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)之間的一個層次。⑴超二級結(jié)構(gòu)(super-secondarystructure)超二級結(jié)構(gòu)是多肽鏈內(nèi)順序上相互鄰近的若干二級結(jié)構(gòu)單元常在空間折疊中靠近，相互作用形成規(guī)則的結(jié)構(gòu)組合體(combination)，充當(dāng)三級結(jié)構(gòu)的構(gòu)件。己知的超二級結(jié)構(gòu)有3種基本組合形式：α螺旋組合(αα)；β折疊組合(βββ)和α螺旋β折疊組合(βαβ)，其中βαβ組合最常見。它們可直接作為三級結(jié)構(gòu)的“建筑塊”或結(jié)構(gòu)域的組成單位，是蛋白質(zhì)構(gòu)象中二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)之間的一個層次。

由二股或三股右手-螺旋彼此纏繞而成的左手超螺旋(superhelix)，存在于-角蛋白、肌球蛋白和纖維蛋白中。由兩段或三段平行折疊鏈（單股鏈）和一段連結(jié)鏈組成，連結(jié)鏈為-螺旋或無規(guī)則卷曲。最常見的組合是由三段平行式的折疊鏈和二段-螺旋鏈構(gòu)成，稱為Rossmann折疊(Rossmannfold)。是由幾段平行的折疊鏈連結(jié)而成，有曲折和回形拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種類型。⑵結(jié)構(gòu)域(domain)結(jié)構(gòu)域是存在于球狀蛋白質(zhì)分子中的兩個或多個相對獨立的，在空間上能辨認(rèn)的三維實體，充當(dāng)三級結(jié)構(gòu)的構(gòu)件，其間由單肽鏈相連。一個典型的結(jié)構(gòu)域都具有一種特殊的功能，例如可以結(jié)合小分子等。每個結(jié)構(gòu)域含有1～3個配體的結(jié)合部位。常見的是一種/式的折疊桶，它是由重復(fù)的單位組成的，折疊桶的核心通常都是疏水結(jié)合部位或反應(yīng)部位。2.3.4.2蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)是整條多肽鏈在各種二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過側(cè)鏈基團(tuán)的相互作用，借助次級鍵維系，進(jìn)一步盤繞折疊形成具有一定規(guī)律的三維空間結(jié)構(gòu)。穩(wěn)定蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的主要是次級鍵，包括：氫鍵、疏水鍵、鹽鍵以及范德華力等。這些次級鍵可存在于一級結(jié)構(gòu)序號相隔很遠(yuǎn)的氨基酸殘基的R基團(tuán)之間，因此蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)主要指氨基酸殘基的側(cè)鏈間的結(jié)合。因此，三級結(jié)構(gòu)是由多肽鏈的Aa順序決定的。具備三級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)有細(xì)長型的纖維狀蛋白質(zhì)(fibrousprotein)，如絲心蛋白；基本上呈球形的球狀蛋白質(zhì)(globularprotein)，如血漿清蛋白、球蛋白、肌紅蛋白。球狀蛋白的疏水基多聚集在分子的內(nèi)部，而親水基則多分布在分子表面，因而球狀蛋白質(zhì)是親水的，更重要的是，多肽鏈經(jīng)過如此盤曲后，可形成某些發(fā)揮生物學(xué)功能的特定區(qū)域，例如酶的活性中心等。肌紅蛋白和丙糖磷酸異構(gòu)酶的三級結(jié)構(gòu)2.3.5蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)(quaternarystructure)具有三級結(jié)構(gòu)的幾條多肽鏈通過次級鍵相互組合而形成的特定構(gòu)象稱為蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。四級結(jié)構(gòu)的概念只適用于具有多個亞基的蛋白質(zhì)，所以四級結(jié)構(gòu)指的是亞基的組織。亞基(subunit、單體)：四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)中的每一個具有獨立三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈稱為亞基(subunit)或亞單位、單體(monomer)。四級結(jié)構(gòu)實際上是指亞基的立體排布、相互作用及接觸部位的布局。亞基之間不含共價鍵，亞基間次級鍵的結(jié)合比二、三級結(jié)構(gòu)疏松，因此在一定的條件下，四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)可分離為其組成的亞基，而亞基本身構(gòu)象仍可不變。亞基單獨存在時無生物活性，只有聚合成特定的四級結(jié)構(gòu)才具有完整的生物活性。球狀蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的形成：多肽鏈的主鏈?zhǔn)紫日郫B成一系列二級結(jié)構(gòu)，相鄰的構(gòu)象單元隨即組合成規(guī)則的超二級結(jié)構(gòu)，若干超二級結(jié)構(gòu)進(jìn)一步盤旋產(chǎn)生結(jié)構(gòu)域，兩個或多個結(jié)構(gòu)域形成具有獨立三級結(jié)構(gòu)的亞基，若干亞基組裝成具有特定四級結(jié)構(gòu)的寡聚體。2.5蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)的順序異構(gòu)現(xiàn)象是蛋白質(zhì)生物功能多樣性和種屬特異性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，如一個由20種氨基酸組成的20肽，有2×1018種順序異構(gòu)體。2.5.1蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與生物功能的關(guān)系蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)是空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，特定的空間構(gòu)象主要是由蛋白質(zhì)分子中肽鏈和側(cè)鏈R基團(tuán)形成的次級鍵來維持，蛋白質(zhì)的多肽鏈在體內(nèi)被合成后，即可根據(jù)一級結(jié)構(gòu)的特點自然折疊和盤曲，形成一定的空間構(gòu)象。因此，蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定了它的二級、三級結(jié)構(gòu)，即由一級結(jié)構(gòu)可以自動地發(fā)展到二、三級結(jié)構(gòu)。2.5.1.1一級結(jié)構(gòu)的種屬差異與分子進(jìn)化同源蛋白質(zhì)(homologousprotein)的種屬差異與生物進(jìn)化同源蛋白質(zhì)是指在不同有機(jī)體中實現(xiàn)同一功能的蛋白質(zhì)(如血紅蛋白)。同源蛋白質(zhì)的氨基酸順序中有許多位置的氨基酸對所有的種屬是相同的，稱不變殘基(invariantresidue)；而其它位置的氨基酸對不同的種屬有相當(dāng)大的變化，稱可變殘基(variableresidue)；同源蛋白質(zhì)的氨基酸順序中這樣的相似性稱為順序同源(sequencehomology)。不同種屬來源的細(xì)胞色素c(cytochromec)中，可以變換的氨基酸殘基數(shù)目與這些種屬在系統(tǒng)發(fā)生上的位置有密切關(guān)系，即在進(jìn)化位置上相距愈遠(yuǎn)，則氨基酸順序之間的差別愈大。CytC分子中Aa殘基的差異數(shù)目及分歧時間

2.5.1.2一級結(jié)構(gòu)的變異與分子病在蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)中，參與功能活性部位的殘基或處于特定構(gòu)象關(guān)鍵部位的殘基，即使在整個分子中發(fā)生一個殘基的異常，該蛋白質(zhì)的功能也會受到明顯的影響。被稱之為“分子病”的鐮刀狀紅細(xì)胞性貧血僅僅是574個氨基酸殘基中，一個氨基酸殘基改變所造成的。血紅蛋白β亞基N端的第6號氨基酸殘基發(fā)生了變異，它變異來源于基因上遺傳信息的突變。2.5.2蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系空間結(jié)構(gòu)是功能的直接體現(xiàn)者，空間結(jié)構(gòu)的變化，特別是活性中心構(gòu)象的變化，會導(dǎo)致功能發(fā)生改變或喪失。核糖核酸酶S中的4個二硫鍵維持其三級結(jié)構(gòu)，用巰基乙醇的尿素溶液證明了蛋白質(zhì)的功能取決于特定的天然構(gòu)象，而規(guī)定其構(gòu)象所需的信息包含在它的氨基酸序列中。2.以血紅蛋白為例來說明構(gòu)象與功能的關(guān)系血紅蛋白(hemoglobin,Hb)是紅細(xì)胞中所含有的一種結(jié)合蛋白質(zhì)，它的蛋白質(zhì)部分稱為珠蛋白(globin),非蛋白質(zhì)部分稱為血紅素(輔基)。Hb分子由四個亞基構(gòu)成,每一亞基結(jié)合一分子血紅素.人的Hb分子結(jié)構(gòu)為α2β2,α和β構(gòu)象相似.每個亞基都具有獨立三級結(jié)構(gòu),肽鏈折疊盤曲形成球狀,表面為親水區(qū)，球形向內(nèi)有20多個巰水AA側(cè)鏈構(gòu)成口袋形的疏水區(qū)，輔基血紅素就嵌接在其中。血紅蛋白和肌紅蛋白的AA殘基數(shù)和AA序列有相當(dāng)大的差異，但三級結(jié)構(gòu)幾乎完全相同，血紅蛋白的亞基和肌紅蛋白的單體分子各有一個血紅素與O2結(jié)合。Hb在體內(nèi)的主要功能為運輸氧氣，而Hb的別構(gòu)效應(yīng)，極有利于它在肺部與O2結(jié)合及在周圍組織釋放O2。Hb通過其輔基血紅素的Fe2+與O2發(fā)生可逆結(jié)合，血紅素的鐵原子共有6個配位鍵，其中4個與血紅素的吡咯環(huán)的N結(jié)合，一個與珠蛋白亞基His殘基的咪唑基的N相連接,空著的一個配位鍵可與O2可逆地結(jié)合,結(jié)合物稱氧合血紅蛋白。血紅蛋白亞基的構(gòu)象血紅素的結(jié)構(gòu)式Fe2+在氧合時落入血紅素平面在血紅素中，四個吡咯環(huán)形成一個平面，在未與O2結(jié)合時，F(xiàn)e2+的位置高于平面0.7?。一旦O2進(jìn)入某一個α亞基的疏水“口袋”時，與Fe2+的結(jié)合會使Fe2+向該平面內(nèi)移動0.75?，嵌入四吡咯平面中。血紅蛋白亞基間鹽鍵示意圖一個亞基的別構(gòu)作用，促進(jìn)另一亞基變構(gòu)的現(xiàn)象，稱為亞基間的協(xié)同效應(yīng)(cooperativity)。在不同氧分壓下，Hb氧飽和曲線呈“S”型。別構(gòu)效應(yīng)（allostericsite）：蛋白質(zhì)與配基結(jié)合改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)的生物活性的現(xiàn)象。別構(gòu)蛋白質(zhì)（allostericprotein）：具別構(gòu)效應(yīng)的蛋白質(zhì),除活性部位外,還有與別的配基結(jié)合的部位.別構(gòu)蛋白都為寡聚蛋白?？偨Y(jié)人的Hb分子結(jié)構(gòu)為α2β2,α和β構(gòu)象相似.每個亞基都具有獨立三級結(jié)構(gòu),肽鏈折疊盤曲形成球狀,表面為親水區(qū)，球形向內(nèi)有20多個疏水AA側(cè)鏈構(gòu)成口袋形的疏水區(qū)，輔基血紅素就嵌接在其中。血紅蛋白的亞基之間相互作用形成穩(wěn)定的四級結(jié)構(gòu)，使其中的血紅素與O2的結(jié)合能力降低。當(dāng)血紅蛋白分子中一個亞基的血紅素與O2結(jié)合后，立即引起該亞基的構(gòu)象發(fā)生變化,這種構(gòu)象變化隨即通過亞基間次級鍵引起另外3個亞基的構(gòu)象改變，結(jié)果改變了整個分子的構(gòu)象，使所有亞基都變成適宜與O2結(jié)合的構(gòu)象，從而使血紅蛋白的氧合速度大大加快。2.6蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的大分子化合物，其部分理化性質(zhì)與氨基酸相似，如兩性電離、等電點、呈色反應(yīng)、成鹽反應(yīng)等，同時又具有膠體性和變性等。2.6.1蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量和測定方法蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量一般在104~106。其相對分子質(zhì)量可根據(jù)其化學(xué)組成測定或者利用蛋白質(zhì)的某些理化性質(zhì)來測定。①沉降速度法將蛋白質(zhì)溶液放在超速離心機(jī)的離心管中進(jìn)行超速離心。由于超過重力幾十萬倍的離心力的作用，而使蛋白質(zhì)分子沉降下來。大小和形狀都相同的蛋白質(zhì)分子下沉速度相同，在離心管中產(chǎn)生一個明顯的界面，利用光學(xué)系統(tǒng)可以觀察到此界面的移動，從而測得蛋白的沉降速度。一種顆粒在單位離心力場中沉降速率為恒定值，稱沉降系數(shù)(sedimentationcoefficient，S)，用S表示?？梢酝ㄟ^公式計算蛋白質(zhì)分子量。已測得許多蛋白質(zhì)的s值都在1×10-13-200×10-13秒之間。因此將1×10-13秒作為沉降系數(shù)的一個單位,用S(Svedbergunit)表示。某蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)為30×10-13秒，表示為30S。用超速離心法測得某種蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)之后，則可按照一定公式,計算出該蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量。

②凝膠過濾法在層析柱中裝入葡聚糖凝膠顆粒。這種凝膠顆粒具有多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這些網(wǎng)孔只允許較小的分子進(jìn)入顆粒內(nèi)，而大于網(wǎng)孔的分子則被排阻。當(dāng)用洗脫液洗脫時，被排阻的相對分子質(zhì)量大的分子先被洗脫下來，相對分子質(zhì)量小的分子后下來。

Cation-exchangecolumn將3種以上相對分子質(zhì)量有較大的差異的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)制成混合溶液，經(jīng)上柱和洗脫，根據(jù)洗脫峰的位置，量出各種蛋白質(zhì)的洗脫體積。以相對分子質(zhì)量的對數(shù)(lgMr)和洗脫體積作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測蛋白質(zhì)在相同條件下的洗脫體積，在標(biāo)準(zhǔn)曲線查出其相對分子質(zhì)量。此法僅適用于球狀分子的相對分子質(zhì)量測定。

③SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度，決定于蛋白分子的大小、形狀和電荷數(shù)量；而在SDS-聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度，則決定于蛋白質(zhì)分子的大小。SDS(十二烷基硫酸鈉)是一種去垢劑，可與蛋白質(zhì)結(jié)合，使其變性并帶上大量的負(fù)電荷，解離成亞基，同時變成棒狀，從而掩蓋了蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的差異。這樣，蛋白質(zhì)的電泳速度只決定于蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小。SDS-凝膠電泳時，蛋白質(zhì)分子的相對遷移率與蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的對數(shù)成直線關(guān)系。用幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的對數(shù)對相應(yīng)的相對遷移率作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)測得的樣品的相對遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可以查出樣品的相對分子質(zhì)量。負(fù)極正極蛋白質(zhì)條帶電泳介質(zhì)2.6.2蛋白質(zhì)的兩性電離及等電點蛋白質(zhì)是由Aa組成的高分子化合物，具有許多游離的氨基、羧基、咪唑基、胍基、巰基、酚基等，因此與Aa一樣，能象酸一樣解離，也能象堿一樣解離，也是兩性電解質(zhì)。當(dāng)溶液在某一pH值時，蛋白質(zhì)所帶正、負(fù)電荷相等，即總凈電荷為零，此時溶液的pH稱該蛋白質(zhì)的等電點(isoelectricpoint)。蛋白質(zhì)在等電點時，因沒有同性電荷排斥，故最不穩(wěn)定，溶解度最小，極易借靜電引力結(jié)合成較在的聚集體沉淀出來（分離提純蛋白質(zhì)的方法）。電泳：帶電質(zhì)點在電場中向電荷相反的電極泳動的現(xiàn)象。電泳方法是實驗室、生產(chǎn)、臨床診斷等常用來分離蛋白質(zhì)和鑒定蛋白質(zhì)純度的手段。2.6.3蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)分子量很大，一般在10000~1000000之間，在水溶液中分子直徑在1~100nm之間，具有膠體溶液的性質(zhì)，如不能通過半透膜、電泳現(xiàn)象等。因此可用透析和電泳的方法來分離、純化蛋白質(zhì)。維持蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定性的因素水化層：球狀蛋白質(zhì)表面多親水基團(tuán)(-COOH、-OH、-SH、-CONH2

等），具有強(qiáng)烈地吸引水分子作用，在水溶液中蛋白質(zhì)顆粒的表面形成一層很厚的水化膜，從而阻止蛋白質(zhì)顆粒的相互聚集。同性電荷：在非等電點時蛋白顆粒帶有同性電荷，相互排斥。

蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)破壞蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)就會凝聚成大的質(zhì)點而從溶液中析出的現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)沉淀(precipitation)。穩(wěn)定蛋白質(zhì)親水膠體的因素是顆粒表面的水化層和電荷。若除掉這兩個穩(wěn)定因素（如調(diào)節(jié)溶液pH至等電點和加入脫水劑），蛋白質(zhì)便容易凝集析出。高濃度中性鹽、有機(jī)溶劑、重金屬鹽、生物堿試劑等都可引起蛋白質(zhì)沉淀。①中性鹽加入高濃度的中性鹽（如[H4N]2SO4、Na2SO3、NaCl等），可有效破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化層，同時又中和了蛋白質(zhì)的電荷，使蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀。這種加鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出的現(xiàn)象稱為鹽析(saltingout)。鹽析法是最常用的分離蛋白質(zhì)的方法。鹽溶與鹽析：鹽析（saltingout）：在蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn)定性而使其析出，這種方法稱為鹽析。鹽溶（saltingin）：低濃度的中性鹽可增加蛋白質(zhì)的溶解度。由于蛋白質(zhì)分子吸附某些鹽類離子后，帶電表層使蛋白質(zhì)分子相互排斥，而蛋白質(zhì)分子與水分子的相互作用加強(qiáng)，因此溶解度提高。由于大量中性鹽的加入，使水的活度降低，原來溶液中的大部分自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水，從而降低蛋白質(zhì)極性基團(tuán)與水分子間的相互作用，破壞了蛋白質(zhì)分子表面的水化層，同時又中和了蛋白質(zhì)的電荷，使蛋白質(zhì)沉淀。常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等。各種蛋白質(zhì)鹽析時所需的鹽濃度及pH不同，故可用于對混和蛋白質(zhì)組分的分離。用半飽和的硫酸銨來沉淀出血清中的球蛋白，飽和硫酸銨可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出來。鹽析沉淀的蛋白質(zhì)，經(jīng)透析除鹽，仍保證蛋白質(zhì)的活性。調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的pH至等電點后，再用鹽析法則蛋白質(zhì)沉淀的效果更好。②有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)可與水混合的有機(jī)溶劑，如酒精、甲醇、丙酮等，對水的親和力很大，能破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化膜，使蛋白質(zhì)顆粒容易凝集而沉淀。調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液至等電點時，加入有機(jī)溶劑可加速蛋白質(zhì)沉淀。常溫下有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)往往引起變性。在低溫條件下，則變性進(jìn)行較緩慢，可用于分離制備蛋白質(zhì)。③重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì)當(dāng)溶液pH值高于等電點時，蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷，它易與重金屬離子（Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag+）結(jié)合成不溶性鹽而沉淀。重金屬沉淀的蛋白質(zhì)常是變性的，誤食重金屬鹽后可大量飲用牛奶或豆?jié){等蛋白質(zhì)，然后用催吐劑將結(jié)合的重金屬鹽嘔吐出來解毒。若在低溫條件下，并控制重金屬離子濃度，也可用于分離制備不變性的蛋白質(zhì)。④生物堿試劑和某些酸類沉淀蛋白質(zhì)pH小于等電點時蛋白質(zhì)帶正電荷，易與帶負(fù)電（酸根陰離子）的生物堿試劑(如苦味酸、鎢酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯醋酸、過氯酸、硝酸)生成不溶性鹽而沉淀。血液化學(xué)分析時常利用此原理除去血液中的蛋白質(zhì)，此類沉淀反應(yīng)也可用于檢驗?zāi)蛑械鞍踪|(zhì)。⑤加熱凝固(coagulation)將接近于等電點的蛋白質(zhì)溶液加熱，可使蛋白質(zhì)發(fā)生凝固而沉淀。加熱使蛋白質(zhì)變性，