細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)++培訓(xùn)課件版

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)CellCulture病理（腎臟）實(shí)驗(yàn)室白潔第一頁，共58頁。第一頁，共58頁。細(xì)胞培養(yǎng)概念：取動(dòng)物組織，在體外，無菌條件下，模擬體內(nèi)環(huán)境（營養(yǎng)、溫度、pH值、氣體），對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，使細(xì)胞能夠生存、生長、保持原來生物學(xué)特性的一種實(shí)驗(yàn)方法。

第二頁，共58頁。第二頁，共58頁。內(nèi)容細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件細(xì)胞培養(yǎng)基本實(shí)驗(yàn)第三頁，共58頁。第三頁，共58頁。一、細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件實(shí)驗(yàn)室條件：環(huán)境、設(shè)備、器材、試劑實(shí)驗(yàn)操作者工作范疇：無菌操作、溫育、培養(yǎng)液配置、洗刷、無菌處理、細(xì)胞和用品儲(chǔ)存等

back第四頁，共58頁。第四頁，共58頁。實(shí)驗(yàn)室條件

無菌環(huán)境

儀器設(shè)備普通器材

一般試劑第五頁，共58頁。第五頁，共58頁。

無菌室結(jié)構(gòu)模式圖back

第六頁，共58頁。第六頁，共58頁。儀器設(shè)備

超凈工作臺(tái)、二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、液氮罐、低溫冰箱、重蒸水裝置、負(fù)壓真空泵、普通冰箱、消毒鍋、烤箱、水浴鍋、天平等

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第七頁，共58頁。第七頁，共58頁。二氧化碳培養(yǎng)箱

back第八頁，共58頁。第八頁，共58頁。超凈工作臺(tái)

back第九頁，共58頁。第九頁，共58頁。倒置顯微鏡back第十頁，共58頁。第十頁，共58頁。液氮罐back第十一頁，共58頁。第十一頁，共58頁。普通器材玻璃瓶皿：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、吸管、離心管、抽慮瓶等塑料瓶皿：多孔培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶等

第十二頁，共58頁。第十二頁，共58頁。back第十三頁，共58頁。第十三頁，共58頁。一般試劑

培養(yǎng)液

平衡鹽液消化液

抗生素液

pH調(diào)整液

back第十四頁，共58頁。第十四頁，共58頁。back第十五頁，共58頁。第十五頁，共58頁。培養(yǎng)液

使用培養(yǎng)液：天然培養(yǎng)基5-20%

合成培養(yǎng)基80-95%附加成分再加適量抗生素液，調(diào)整pH值即可

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第十六頁，共58頁。第十六頁，共58頁。天然培養(yǎng)基小牛血清胎牛血清組織提取液

back第十七頁，共58頁。第十七頁，共58頁。合成培養(yǎng)基RPMI1640Eagle培養(yǎng)液：DMEM、MEM、IMDMHamF12、HamF10、PC199Mc-Coy5A

back第十八頁，共58頁。第十八頁，共58頁。附加成分

促貼壁物：層粘連蛋白等激素：胰島素、氫化考的松、GH等生長因子：ECGF、NGF、FGF等酶抑制物：大豆胰旦白酶抑制劑等

back第十九頁，共58頁。第十九頁，共58頁。平衡鹽液

HanksD-HanksEarlePBSHBSS

back第二十頁，共58頁。第二十頁，共58頁。消化液胰蛋白酶(0.125-0.25%)膠原酶()EDTA(0.01-0.02%)

back第二十一頁，共58頁。第二十一頁，共58頁?？股匾烘溍顾?100ug/ml)青霉素(100單位/ml)制霉菌素(100單位/ml)終濃度不超過萬分之一為宜

back第二十二頁，共58頁。第二十二頁，共58頁。pH調(diào)整液5.6%NaHCO2HEPES1NHCL10%HAC1NNaOH

back第二十三頁，共58頁。第二十三頁，共58頁。無菌操作洗手著裝近火焰操作試劑瓶等斜放第二十四頁，共58頁。第二十四頁，共58頁。實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備清洗：玻璃、塑料、橡膠、金屬類等消毒：無菌室、培養(yǎng)用液、培養(yǎng)器皿（玻璃、塑料、橡膠、金屬）等

第二十五頁，共58頁。第二十五頁，共58頁。清洗示意圖白箭頭：玻璃制品黑箭頭：橡膠制品

back第二十六頁，共58頁。第二十六頁，共58頁。消毒方法物理消毒法：射線、紫外線、干熱、濕熱、過濾、煮沸等 化學(xué)消毒法：乳酸、甲醛、過氧乙酸、新潔爾滅、乙醇等抗生素滅菌第二十七頁，共58頁。第二十七頁，共58頁。二、細(xì)胞培養(yǎng)的基本內(nèi)容

細(xì)胞傳代培養(yǎng)*細(xì)胞凍存與復(fù)蘇*第二十八頁，共58頁。第二十八頁，共58頁。第二十九頁，共58頁。第二十九頁，共58頁。

第三十頁，共58頁。第三十頁，共58頁。細(xì)胞計(jì)數(shù)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：手工計(jì)數(shù)細(xì)胞Coulter計(jì)數(shù)儀：自動(dòng)計(jì)數(shù)計(jì)算：以活細(xì)胞計(jì)數(shù)；成團(tuán)細(xì)胞算一個(gè)細(xì)胞數(shù)＝4大格細(xì)胞數(shù)/4×104個(gè)/ml壓線細(xì)胞計(jì)數(shù)原則：

數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右第三十一頁，共58頁。第三十一頁，共58頁。第三十二頁，共58頁。第三十二頁，共58頁。第三十三頁，共58頁。第三十三頁，共58頁。常規(guī)觀察培養(yǎng)液：顏色：含有指示劑酚紅，顏色反應(yīng)PH值新鮮的正常：PH7.2～7.4，桃紅色；培養(yǎng)后，細(xì)胞產(chǎn)酸，變黃，需換液；透明度：清亮透明，混濁多為污染（懸浮細(xì)胞除外）第三十四頁，共58頁。第三十四頁，共58頁。第三十五頁，共58頁。第三十五頁，共58頁。培養(yǎng)液短期內(nèi)變黃：1、是否有細(xì)菌污染；2、可能培養(yǎng)皿沒清洗干凈，有殘留物；3、細(xì)胞生長太快；4、細(xì)胞接種量過大。第三十六頁，共58頁。第三十六頁，共58頁。細(xì)胞的生長狀態(tài)貼壁細(xì)胞隨貼附支持物形狀不同而形態(tài)各異，最常見的是貼附于平面支持物細(xì)胞。在一般光鏡下生存中的細(xì)胞是均質(zhì)而透明的，結(jié)構(gòu)不明顯。細(xì)胞在生長期常有1-2個(gè)核仁，在細(xì)胞機(jī)能狀態(tài)不良時(shí)，細(xì)胞輪廓會(huì)增強(qiáng)，反差增大。若胞質(zhì)中時(shí)而出現(xiàn)顆粒、脫滴和腔泡等，表明細(xì)胞代謝不良。

第三十七頁，共58頁。第三十七頁，共58頁。第三十八頁，共58頁。第三十八頁，共58頁。第三十九頁，共58頁。第三十九頁，共58頁。第四十頁，共58頁。第四十頁，共58頁。第四十一頁，共58頁。第四十一頁，共58頁。第四十二頁，共58頁。第四十二頁，共58頁。第四十三頁，共58頁。第四十三頁，共58頁。第四十四頁，共58頁。第四十四頁，共58頁。第四十五頁，共58頁。第四十五頁，共58頁。懸浮細(xì)胞圓形，可以單個(gè)細(xì)胞或聚集成團(tuán)生長；細(xì)胞透亮，核、膜分界清楚；可大量繁殖，鏡下可見分裂期細(xì)胞；肉眼可見在培養(yǎng)瓶中可沉底，輕輕晃動(dòng)后均勻分布；培養(yǎng)基清亮。培養(yǎng)生長不好時(shí)，聚集成團(tuán)的細(xì)胞少，生長慢，細(xì)胞有皺縮、破碎、透光性降低等現(xiàn)象。第四十六頁，共58頁。第四十六頁，共58頁。第四十七頁，共58頁。第四十七頁，共58頁。第四十八頁，共58頁。第四十八頁，共58頁。微生物污染傳代或換液后24h～48h可觀察到；細(xì)菌、真菌污染的典型表現(xiàn)：培養(yǎng)液混濁，液體內(nèi)漂浮有菌絲或細(xì)菌；支原體污染：不明顯，細(xì)胞生長明顯變緩，胞質(zhì)內(nèi)顆粒增多，有中毒表現(xiàn)，但培養(yǎng)液多不發(fā)生混濁。第四十九頁，共58頁。第四十九頁，共58頁。第五十頁，共58頁。第五十頁，共58頁。第五十一頁，共58頁。第五十一頁，共58頁。第五十二頁，共58頁。第五十二頁，共58頁。

細(xì)胞凍存與復(fù)蘇細(xì)胞凍存（緩慢）細(xì)胞復(fù)蘇（快速）凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融第五十三頁，共58頁。第五十三頁，共58頁。細(xì)胞凍存和復(fù)蘇優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。第五十四頁，共58頁。第五十四頁，共58頁。細(xì)胞凍存方法配制凍存液：20%血清培養(yǎng)基＋10%DMSODMSO溶解要產(chǎn)熱，應(yīng)提前配，避免傷細(xì)胞。

DMSO的作用收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，加入適量凍存液,用吸管吹打成細(xì)胞懸液（1×106～5×106細(xì)胞/ml)加入1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍批號(hào)。第五十五頁，共58頁。第五十五頁，共58頁。慢凍程序原則：當(dāng)溫度在-25℃以上時(shí)，1～2℃/min；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，5～10℃/min；當(dāng)溫度達(dá)-100℃時(shí)，可迅速放入液氮中。GMP程序：將冷凍管（管口朝上）放入紗布袋內(nèi)，4°冰箱0.5h；－20°冰箱0.5h；－70°冰箱0.5h；轉(zhuǎn)入液氮。簡易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1～2℃的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。第五十六頁，共58頁。第五十六頁，共58頁。細(xì)胞復(fù)蘇方法

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