生物化學(xué)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

關(guān)于生物化學(xué)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)第一頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二pH對(duì)酶活性的影響實(shí)驗(yàn)原理只有當(dāng)酶蛋白處于一定的構(gòu)象及電荷狀態(tài)，才有利于酶和底物的結(jié)合和催化，使酶促反應(yīng)最強(qiáng)，因此酶反應(yīng)介質(zhì)的pH可影響酶分子。在某一pH時(shí)，酶的催化活性達(dá)到最大值，該pH稱為酶的最適pH。堿性磷酸酶的最適pH為8~12。本實(shí)驗(yàn)采用磷酸苯二鈉法，在不同的pH值的甘氨酸緩沖液條件下，測定其活性，從而確定其最適pH。以磷酸苯二鈉為底物，被堿性磷酸酶水解后則產(chǎn)生游離酚和磷酸鹽。酚在堿性溶液中與氨基安替比林作用，經(jīng)鐵氰化鉀氧化可產(chǎn)生紅色的醌類衍生物。根據(jù)紅色深淺就可測出酶的活性，從而得出酶的最適pH。第二頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二反應(yīng)式如下：第三頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)材料

甘氨酸緩沖液、0.04mol/L底物液、酶液、0.1mol/LpH10碳酸鹽緩沖液、0.5%鐵氰化鉀液、酚標(biāo)準(zhǔn)液、pH8.8Tris-乙酸緩沖液、堿液、0.3%4-氨基安替比林液、0.04mol/LNa2HPO4第四頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)方法1.取試管6支，編號(hào)，表操作管號(hào)123456各pH甘氨酸pH8.0pH9.0pH10.0pH11.0pH12.0------緩沖液（ml）1.01.01.01.01.0——蒸餾水（ml）——————————1.00.04mol/L底物液1.01.01.01.01.01.037℃水浴中保溫5min酶液（ml）0.10.10.10.10.1——pH8.8Tris-乙酸緩沖液——————————0.1第五頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二2.加入酶液后，立即計(jì)時(shí)，混勻后，在37℃水浴中準(zhǔn)確保溫5min。3.保溫后，各管中立即加入堿性液1.0ml終止反應(yīng)。4.各管中分別加入0.3%4-氨基安替比林液1.0ml及0.5%鐵氰化鉀2.0ml充分混勻，使呈色完全。室溫放置10min，以6號(hào)管為空白,不比色,用+來表示顏色的深淺.第六頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二溫度對(duì)酶活性的影響實(shí)驗(yàn)原理

溫度對(duì)酶活性有顯著的影響。溫度低時(shí)，酶促反應(yīng)減弱或停止，溫度從較低逐漸升高時(shí)，反應(yīng)速度也隨之逐漸增加，當(dāng)溫度升高到某一定值時(shí)，酶促反應(yīng)達(dá)到最高峰，此溫度稱為酶的最適溫度。但酶是蛋白質(zhì)，其本身也因溫度升高而變性，超過最適溫度時(shí)，其活性反而降低。一般溫度升至80℃以上，酶活性幾乎全部喪失。應(yīng)指出，在進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)時(shí)，酶的最適溫度會(huì)隨著保溫時(shí)間長短而有所變化。

本實(shí)驗(yàn)以堿性磷酸酶為例，在一定時(shí)間，觀察酶活性在不同溫度下的變化。第七頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)步驟1.取試管5支，編號(hào)，按表操作。1234空白0.1mol/LpH10的碳酸鹽緩沖液1.01.01.01.01.00.04mol/L底物液1.01.01.01.01.0預(yù)溫溫度放冰浴3min放37℃水浴3min放沸水浴3min酶液冰浴中預(yù)冷酶液0.1ml室溫下酶液0.1ml蒸餾水0.1ml保溫溫度放冰浴15min放冰浴15min后立即移至37℃水浴15min放37℃水浴15min放沸水浴15min后立即移至37℃水浴15min放37℃水浴15min第八頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二2.各管保溫后，立即加入堿性試劑1.0ml以終止反應(yīng)。3.各管中分別加入0.3%4-氨基安替比林液1.0ml及0.5%鐵氰化鉀2.0ml充分混勻，室溫放置10min，以空白管校正零點(diǎn)，不比色,用+來表示顏色的深淺.第九頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二底物濃度對(duì)酶活性的影響

實(shí)驗(yàn)原理1913年，Michaelis和Menten提出了酶促反應(yīng)速度和底物濃度的關(guān)系式，即米氏方程。

V＝Vm×[S]/(Km+[S])式中：

V為反應(yīng)初速度

Vm為最大反應(yīng)速度

[S]為底物濃度

Km為米氏常數(shù)Km值是酶的一個(gè)特征性常數(shù)，可近似表示酶與底物的親和力。

雙倒數(shù)作圖法是用實(shí)驗(yàn)方法測定Km值的最常用的方法。第十頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二雙倒數(shù)作圖法。

1Km11

=

+

V

Vmax[S]Vmax取米氏方程式的倒數(shù)形式：1/Vmax斜率=Km/Vmax-1/Km米氏常數(shù)Km的測定

實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇不同的[S]，測定相對(duì)應(yīng)的V。求出兩者的倒數(shù)，以1/V對(duì)1/[S]作圖，則得到一個(gè)斜率為Km/Vm的直線。將直線外推與橫軸相交，其橫軸截矩為：－1/[S]＝1/Km，由此求出Km值。該法比較簡便。本實(shí)驗(yàn)即以AKP為例，測定不同底物濃度對(duì)酶活性的影響，按雙倒數(shù)方程式作圖，計(jì)算出Km值。第十一頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)方法1.取干凈試管10支，編號(hào)，按表操作（注：刪除掉1、3、5、7試管）管號(hào)123456789100.04mol/L底物液0.050.10.20.30.40.81.01.2----------pH10的碳酸鹽緩沖液0.70.70.70.70.70.70.70.70.70.7蒸餾水(ml)1.151.11.00.90.80.40.2-----1.21.237℃水浴保溫5min酶液（ml）0.10.10.10.10.10.10.10.10.10.1第十二頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二

底物濃度對(duì)酶活性影響實(shí)驗(yàn)的操作酚標(biāo)準(zhǔn)液------------------------------------------------------0.1最終底物液(不加)12468162020------------加入酶后立即計(jì)時(shí)，各管混勻后均在37℃水浴中準(zhǔn)確保溫15min，保溫后立即加人堿性溶液以終止反應(yīng)堿性溶液1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.00.3%4-氨基安替比林液1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.00.5%鐵氰化鉀2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.0第十三頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二各管充分混勻，放置十分鐘，以第九管為對(duì)照，于波長510nm處比色，測定各管的吸光率，并計(jì)算出各管的酶活性。（注：9號(hào)試管為空白，10號(hào)為標(biāo)準(zhǔn)）2.作圖（1）以酶活性單位代表各管中該酶反應(yīng)速度（V）為縱坐標(biāo)，為以底物濃度（[S])橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上描出各點(diǎn)并連接之，觀察該圖形的形狀。（2）以酶活性單位的倒數(shù)代表該酶反應(yīng)速度的倒數(shù)（1/V）為縱坐標(biāo)，以底物濃度的倒數(shù)（1/[S]）為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上描出各點(diǎn)并連接之，求出該酶的Km。第十四頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響實(shí)驗(yàn)原理

能降低酶活性，甚至使酶完全喪失活性的物質(zhì)，被稱為酶的抑制劑。酶的抑制分為可逆性與不可逆性抑制兩大類。不可逆性抑制劑與酶生成共價(jià)結(jié)合的復(fù)合物，或以其他結(jié)合方式生成結(jié)合牢固且難于再解離的復(fù)合物。可逆性抑制劑如一般與酶的底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)（競爭性抑制劑），可與酶的活性中心結(jié)合，從而使酶與其底物結(jié)合的比例減少，降低酶促反應(yīng)速度，但當(dāng)加大底物濃度時(shí)，可逆轉(zhuǎn)其抑制。

本實(shí)驗(yàn)以無機(jī)磷酸鹽及茶堿作為堿性磷酸酶的競爭性抑制劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所得數(shù)據(jù)仍按雙倒數(shù)方程作圖，從而觀察此類抑制的動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)。第十五頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)方法1.取干凈試管10支，編號(hào)，按表操作（注：刪除掉1、3、5、7試管）管號(hào)123456789100.04mol/L底物液0.050.10.20.30.40.81.01.2----------0.04mol/LNa2HPO40.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.1mol/LpH10的碳酸鹽緩沖液0.60.60.60.60.60.60.60.60.60.6蒸餾水1.151.11.00.90.80.40.2-----1.21.2第十六頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二管號(hào)1234567891037℃保溫5min酶液0.10.10.10.10.10.10.10.10.10.1酶標(biāo)準(zhǔn)液一一一一一一一一一一最終底物液(不加)12468162024一一加入酶液后，立即計(jì)時(shí)，混勻后37℃水浴中準(zhǔn)確保溫15min，保溫后，立即加入堿性溶液以終止反應(yīng)堿性溶液1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.00.3%4-氨基安替比林液1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.00.5%鐵氰化鉀2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.0第十七頁，共十九頁，編輯于2023年，星期二

充分混勻，室溫放10min，以空白為對(duì)照，于波長510nm處比色，記錄各管吸光率，并計(jì)算各