免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)第1頁/共20頁研究背景：在世界范圍內(nèi)乳腺癌的發(fā)病率逐年上升,而且乳腺癌患者有年輕化趨勢。目前的常規(guī)治療手段對提高乳腺癌患者長期生存率仍不十分理想,所以研究有效的治療方法已迫在眉睫。近年來,免疫基因治療越來越受到人們的重視。白細(xì)胞介素23(IL-23)是2000年發(fā)現(xiàn)的一種由p19亞基和p40亞基共同構(gòu)成的1種細(xì)胞因子,主要來源于活化的單核巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(DC),其具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)活性,參與自身免疫性疾病、慢性炎癥反應(yīng)和某些感染性疾病的發(fā)病和調(diào)控過程。有報(bào)道提出,IL-23可通過誘導(dǎo)和增強(qiáng)小鼠脾細(xì)胞CTL活性和IFN-γ等細(xì)胞因子的產(chǎn)生而發(fā)揮抗腫瘤作用,但與IL-12相比,不會(huì)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生高水平的γ干擾素(IFN-γ),減少了毒副作用。因此,IL-23作為腫瘤基因治療的候選因子越來越受到關(guān)注。

牛牛文庫文檔分享第2頁/共20頁目的與方法目的:

研究白細(xì)胞介素23(IL-23)在小鼠乳腺癌中的抗腫瘤作用及其免疫功能變化。方法:

將逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染IL-23基因的小鼠乳腺癌細(xì)胞(IL-23/MA-891)、轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒空載體的小鼠乳腺癌細(xì)胞(LXSN/MA-891)及親代小鼠乳腺癌細(xì)胞(MA-891)分別接種于小鼠皮下,觀察小鼠成瘤及腫瘤生長情況;30d時(shí)取3組小鼠脾臟和腫瘤組織,用ELISA法檢測3組小鼠脾細(xì)胞在MA-891誘導(dǎo)下IFN-γ、TNF-α、IL-12和IL-4的產(chǎn)生情況;用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測腫瘤組織細(xì)胞表面分子MHC-I、MHC-II、CD80、CD86的表達(dá),檢測脾細(xì)胞CD11c陽性細(xì)胞的比率,并對脾細(xì)胞中CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞進(jìn)行分選;用免疫組織化學(xué)技術(shù)對3組腫瘤組織中CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞浸潤情況進(jìn)行檢測。

牛牛文庫文檔分享第3頁/共20頁實(shí)驗(yàn)材料逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染IL-23基因的小鼠乳腺癌細(xì)胞(IL-23/MA-891)；轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒空載體的小鼠乳腺癌細(xì)胞(LXSN/MA-891)及親代小鼠乳腺癌細(xì)胞(MA-891)；津白II號(hào)小鼠(雌性,6~8周齡)；IFN-γ、TNF-α和IL-4ELISA檢測試劑盒；IL-12ELISA檢測試劑盒；FITC標(biāo)記的抗小鼠CD11c、CD80、CD4、CD8單克隆抗體(mAb)及PE標(biāo)記的CD86mAb抗體；FITC標(biāo)記的抗小鼠MHC-I類分子mAb和PE標(biāo)記的抗小鼠MHC-II類分子mAb；兔抗鼠CD4、CD8抗體、山羊抗兔IgG抗體及SP試劑。

牛牛文庫文檔分享第4頁/共20頁實(shí)驗(yàn)步驟2.脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的檢測1.小鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)3.脾細(xì)胞中CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞的分選4.脾細(xì)胞CD11c分子表達(dá)的檢測7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析6.腫瘤組織中CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞浸潤情況的檢測5.腫瘤組織細(xì)胞表面分子的檢測

牛牛文庫文檔分享第5頁/共20頁1.荷瘤小鼠體內(nèi)致瘤性及腫瘤生長情況觀察津白II號(hào)小鼠隨機(jī)分為3組,分別于右側(cè)背部皮下注射0.1mL的IL-23/MA-891LXSN/MA-891和MA-891細(xì)胞,結(jié)果表明,IL-23基因轉(zhuǎn)染組與空載體轉(zhuǎn)染組及親代細(xì)胞組在小鼠體內(nèi)的成瘤率均為100%。但I(xiàn)L-23基因轉(zhuǎn)染組小鼠皮下結(jié)節(jié)生長速度明顯慢于接種空載體轉(zhuǎn)染組及親代細(xì)胞組,表明IL-23基因轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長能力明顯下降(圖1)。說明導(dǎo)入IL-23基因的小鼠乳腺癌細(xì)胞分泌的IL-23發(fā)揮了明顯的抗腫瘤作用,減低了腫瘤在活體內(nèi)的侵襲能力,降低了其生長速度。

牛牛文庫文檔分享第6頁/共20頁2.脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的檢測皮下接種IL-23/MA-891、LXSN/MA-891和MA-891細(xì)胞后30d的小鼠脾細(xì)胞在體外經(jīng)MA-891誘導(dǎo)后,用ELISA法檢測脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中Th1類細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α,Th1類細(xì)胞誘導(dǎo)因子IL-12及Th2類細(xì)胞因子IL-4的含量。結(jié)果顯示,接種IL-23/MA-891細(xì)胞的小鼠脾細(xì)胞可產(chǎn)生高水平的IFN-γ、TNF-α和IL-12等Th1類及相關(guān)細(xì)胞因子,與接種LXSN/MA-891細(xì)胞和MA-891細(xì)胞2組小鼠的脾細(xì)胞相比明顯增加(n=6,P<0.01);而Th2類細(xì)胞因子IL-4的水平卻無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=6,P>0.05,圖2)。

牛牛文庫文檔分享第7頁/共20頁3.脾細(xì)胞中CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞的分選取皮下接種IL-23/MA-891、LXSN/MA-891和MA-891細(xì)胞后30d的小鼠脾細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,FCM分選結(jié)果顯示IL-23/MA-891組CD4+淋巴細(xì)胞及CD8+淋巴細(xì)胞比率(34.0±1.7,14.6±0.6)%均較LXSN/MA-891(12.3±0.8,9.1±0.5)%、MA-891(12.5±0.7,9.0±0.6)%組明顯增高(n=6,P<0.01)。4.脾細(xì)胞中CD11c陽性細(xì)胞比率的變化接種IL-23/MA-891、LXSN/MA-891和MA-891細(xì)胞后30d的小鼠脾細(xì)胞中CD11c陽性細(xì)胞(DC)表達(dá)的FCM檢測顯示:接種IL-23/MA-891細(xì)胞組小鼠脾臟中,CD11c陽性細(xì)胞比率(21.4±1.6)%與接種LXSN/MA-891和MA-891細(xì)胞組小鼠脾臟相比CD11c陽性細(xì)胞比率(12.4±1.0,11.6±0.6)%有明顯增高(n=6,P<0.01);而接種LXSN/MA-891和MA-891細(xì)胞組小鼠脾臟中CD11c陽性細(xì)胞比率之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

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5.腫瘤組織中細(xì)胞表面分子表型的變化

經(jīng)FCM分析,皮下接種IL-23/MA-891、LXSN/MA-891和MA-891細(xì)胞后30d,IL-23/MA-891組腫瘤組織細(xì)胞表面分子MHC-I、MHC-II、CD80、CD86表達(dá)與接種MA-891和LXSN/MA-891細(xì)胞組相比較有明顯的提高(P<0.01);MA-891和LXSN/MA-891組小鼠的腫瘤組織細(xì)胞表面分子表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)

。6.腫瘤組織中CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞浸潤情況的檢測（圖3）

牛牛文庫文檔分享第9頁/共20頁總結(jié)1.樹突狀細(xì)胞(DC)是最重要的抗原提呈細(xì)胞,IL-23可以與小鼠DC結(jié)合,誘導(dǎo)DC產(chǎn)生IFN-γ,提高DC的抗原提呈能力。2.CD11c是小鼠DC的表面標(biāo)志,可用來分離和鑒定小鼠DC。3.IL-23可通過增加腫瘤的抗原性及抗原提呈的協(xié)同刺激作用,增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能,防止腫瘤逃逸,發(fā)揮抗腫瘤作用。結(jié)論:轉(zhuǎn)染IL-23基因的小鼠乳腺癌細(xì)胞所分泌的IL-23具有生物學(xué)活性,增強(qiáng)了細(xì)胞免疫功能,在小鼠體內(nèi)發(fā)揮了明顯的抗腫瘤作用。

牛牛文庫文檔分享第10頁/共20頁1.小鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)

將津白II號(hào)小鼠隨機(jī)分為3組,分別于右側(cè)背部皮下注射0.1mL(含5×105個(gè)活細(xì)胞)的IL-23/MA-891、LXSN/MA-891和MA-891細(xì)胞。觀察小鼠成瘤及腫瘤生長情況,各組小鼠每隔2d用游標(biāo)卡尺測量皮下腫瘤長徑和短徑,用下列公式計(jì)算腫瘤體積:腫瘤體積(cm3)=長徑×短徑2×1/2。實(shí)驗(yàn)步驟

牛牛文庫文檔分享第11頁/共20頁2.脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的檢測

于接種IL-23/MA-891、LXSN/MA-891和MA-891細(xì)胞后30d,分別取3組各6只小鼠脾臟,無菌制備脾細(xì)胞懸液,按每孔0.1mL脾細(xì)胞(含2×105個(gè))和0.1mL絲裂霉素處理的/MA-891細(xì)胞(含2×105個(gè))加入到96孔板中,再加入終濃度0.05g/LConA刺激小鼠脾細(xì)胞,48h后用ELISA法檢測各組脾細(xì)胞培養(yǎng)液中IFN-γ、TNF-α、IL-12和IL-4的含量。

牛牛文庫文檔分享第12頁/共20頁3.脾細(xì)胞中CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞的分選

同1.2.2方法取出3組小鼠脾臟,制成單細(xì)胞懸液,用PBS洗2次,然后每組加入FITC標(biāo)記的抗小鼠CD4、CD8mAb,避光作用60min,采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)進(jìn)行CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞的分選試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)步驟

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4.脾細(xì)胞CD11c分子表達(dá)的檢測

同上將3組小鼠脾細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,用PBS洗2次,分別加入FITC標(biāo)記抗小鼠CD11cmAb,避光作用60min,用FCM分析CD11c陽性細(xì)胞的比率。實(shí)驗(yàn)步驟

牛牛文庫文檔分享第14頁/共20頁5.腫瘤組織細(xì)胞表面分子的檢測于注射IL-23/MA-891、LXSN/MA-891和MA-891細(xì)胞后30d,取出3組小鼠腫瘤組織制成單細(xì)胞懸液,用PBS洗2次,然后每組分別加入FITC標(biāo)記抗小鼠MHC-I類分子、CD80mAb及PE標(biāo)記抗小鼠MHC-II類分子、CD86mAb,避光作用60min,用FCM分析細(xì)胞表面待測分子的表達(dá)情況。

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6.腫瘤組織中CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞浸潤情況的檢測

同上切取3組腫瘤組織,100g/L甲醛固定,石蠟包埋組織做5cm厚切片,常規(guī)脫蠟、水化,加TritonX-100修復(fù)暴露抗原(4.℃過夜)。以100mL/L山羊血清封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)(37.℃30min)后,分別滴加兔抗鼠CD4、CD8抗體(4.℃過夜),山羊抗兔IgG和SABC(37.℃各孵育1h)。用DAB顯色后,再以蘇木素復(fù)染,于顯微鏡下觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)步驟

牛牛文庫文檔分享第16頁/共20頁7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS12.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ONEWAY-ANOVA)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)步驟

牛牛文庫文檔分享第17頁/共20頁GroupMHC-IMHC-IICD80CD86IL-23/MA-891450.4±13.1b426.7±4.0b617.0±10.5b714.5±10.0bLXSN/MA-8912614±8.8287.1±9.5483.5±13.6531.8±17.0MA-891275.5±12.6275.6±11.0488.3±11.0538.4±20.5表1FCM檢測3組腫瘤細(xì)胞表面MHC-I、MHC-II、CD80和CD86分子的表達(dá)(MIF值)

牛牛文庫文檔分享第18頁/共20頁圖3免疫組化檢測小鼠腫瘤組織中CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞浸潤情況免疫組化結(jié)果顯示,接種IL-23/MA-891