HPLC高效液相色譜法培訓(xùn)

1高效液相色譜法HighPerformanceLiquidChromatography

HPLC當(dāng)前1頁，總共112頁。2講授提綱HPLC儀器HPLC基本操作HPLC使用注意事項(xiàng)HPLC分類分析中的實(shí)際問題當(dāng)前2頁，總共112頁。3Agilent1100儀器當(dāng)前3頁，總共112頁。41HPLC的組成及工作流程1螺旋注射泵2往復(fù)柱塞泵3往復(fù)隔膜泵4氣動(dòng)放大泵1自動(dòng)進(jìn)樣器2手動(dòng)進(jìn)樣器1液固2液液3鍵合相色譜4離子交換5空間排阻1紫外檢測器2熒光檢測器3蒸發(fā)光散射4示差折光檢測器5電化學(xué)檢測器6電導(dǎo)檢測器7質(zhì)譜檢測器色譜柱是高效液相色譜儀的“心臟”，是實(shí)現(xiàn)色譜分離的基礎(chǔ)。當(dāng)前4頁，總共112頁。5儀器組成高壓輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)色譜分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)當(dāng)前5頁，總共112頁。6儀器組成高壓輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)當(dāng)前6頁，總共112頁。7高壓輸液系統(tǒng)

溶劑貯液瓶溶劑脫氣裝置高壓輸液泵梯度洗脫裝置當(dāng)前7頁，總共112頁。8溶劑貯液瓶用途：貯存流動(dòng)相溶劑材料：玻璃或塑料，無色或棕色，容積：約為0.5～2.0L位置：高于泵，以保一定的輸液靜壓差。當(dāng)前8頁，總共112頁。9溶劑脫氣裝置真空脫氣機(jī)在線真空脫氣機(jī)可實(shí)現(xiàn)流動(dòng)相在進(jìn)入輸液泵前的連續(xù)真空脫氣，適用于多元溶劑系統(tǒng)。簡單的高效液相色譜儀無在線脫氣裝置，流動(dòng)相必須用離線脫氣法。當(dāng)前9頁，總共112頁。10真空脫氣機(jī)當(dāng)前10頁，總共112頁。11溶劑脫氣方法離線脫氣法抽真空脫氣超聲波振蕩脫氣吹氦脫氣在線脫氣法當(dāng)前11頁，總共112頁。12抽真空脫氣——常用方法用微型真空泵，降壓至0.05~0.07MPa即可除去溶解的氣體。使用真空泵連接抽濾瓶可以一起完成過濾和脫氣的雙重任務(wù)。濾膜常用0.45μm，分有機(jī)相和水相膜，切不可用水相膜過濾有機(jī)相。當(dāng)前12頁，總共112頁。13將流動(dòng)相置于超聲波清洗機(jī)中，用超聲波振蕩10~30min，即可。

用在液體中比空氣中溶解度低的氦氣，以60mL／min的流速緩緩地通過流動(dòng)相10~15min，除去溶于流動(dòng)相中氣體。超聲波振蕩脫氣吹氦脫氣當(dāng)前13頁，總共112頁。14高壓輸液泵是HPLC系統(tǒng)中最重要的部件之一。輸液泵的性能好壞直接影響到整個(gè)系統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果的可靠性。當(dāng)前14頁，總共112頁。15輸液泵應(yīng)具備的性能①流量穩(wěn)定，其RSD應(yīng)＜0.5%。對定性定量的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。②流量范圍寬，分析型應(yīng)在0.1~10ml/min范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)，制備型能達(dá)到100ml/min。③輸出壓力高，一般可高達(dá)400~500kg/cm2。④液缸容積小，適于梯度洗脫。⑤密封性好，耐腐蝕。當(dāng)前15頁，總共112頁。16輸液泵類型1螺旋注射泵2往復(fù)柱塞泵3往復(fù)隔膜泵4氣動(dòng)放大泵目前應(yīng)用最多的是柱塞往復(fù)泵。當(dāng)前16頁，總共112頁。17泵的使用與維護(hù)防止任何固體微粒進(jìn)入泵體，因此應(yīng)過濾流動(dòng)相。流動(dòng)相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖液的流動(dòng)相不應(yīng)停泵過夜或保留在泵內(nèi)更長時(shí)間。必須泵入純水將泵充分清洗后，再換成適合于保存色譜柱和有利于泵維護(hù)的溶劑。當(dāng)前17頁，總共112頁。18泵的使用與維護(hù)防止流動(dòng)相耗盡空泵運(yùn)轉(zhuǎn)，導(dǎo)致柱塞磨損、缸體或密封損環(huán)，最終產(chǎn)生漏液。輸液泵的工作壓力不能超過規(guī)定的最高壓力，否則會(huì)使高壓密封環(huán)變形，產(chǎn)生漏液(40MPa,400bar,5800psi)。流動(dòng)相應(yīng)脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性，如果有大量氣泡，泵就無法正常工作。當(dāng)前18頁，總共112頁。19梯度洗脫裝置用途：梯度洗脫。等度(isocratic)高效液相洗脫方式梯度(gradient)低壓梯度（外梯度）梯度洗脫方式高壓梯度（內(nèi)梯度）當(dāng)前19頁，總共112頁。20低壓梯度在常壓下將兩種或多種溶劑按一定比例輸入泵前的比例閥中混合后，再用高壓泵將流動(dòng)相以一定的流量輸出至色譜柱。常見的是四元泵，如waters2690/2695；Agilent1100。特點(diǎn)：只需一個(gè)高壓輸液泵，由計(jì)算機(jī)控制四元比例閥來改變?nèi)軇┍壤瑢?shí)現(xiàn)二元~四元梯度洗脫，成本低廉、使用方便。由于溶劑在常壓下混合，易產(chǎn)生氣泡，需要良好的在線脫氣裝置。當(dāng)前20頁，總共112頁。21梯度洗脫系統(tǒng)（低壓梯度）當(dāng)前21頁，總共112頁。22高壓梯度一般只用于二元梯度，即用兩個(gè)高壓泵分別按設(shè)定比例輸送兩種不同溶液至混合器，在高壓狀態(tài)下將兩種溶液進(jìn)行混合，然后以一定的流量輸出。主要優(yōu)點(diǎn)：只要通過梯度程序控制器控制每個(gè)泵的輸出，就能獲得任意形式的梯度曲線，且精度很高，易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制。如：waters515當(dāng)前22頁，總共112頁。23梯度洗脫系統(tǒng)（高壓梯度）當(dāng)前23頁，總共112頁。24進(jìn)樣系統(tǒng)作用：將試樣引入色譜柱位置：在高壓泵和色譜柱之間類型：手動(dòng)或自動(dòng)進(jìn)樣器：六通閥當(dāng)前24頁，總共112頁。25進(jìn)樣器

手動(dòng)六通閥經(jīng)注射器進(jìn)樣自動(dòng)六通閥圓盤式自動(dòng)進(jìn)樣器鏈?zhǔn)阶詣?dòng)進(jìn)樣器當(dāng)前25頁，總共112頁。26當(dāng)前26頁，總共112頁。27六通閥手動(dòng)進(jìn)樣器原理示意圖

LoadInject

當(dāng)前27頁，總共112頁。28六通閥有6個(gè)接口，1和4之間接定量環(huán)，2接高壓泵，3接色譜柱，5、6接廢液管。定量環(huán)常見體積有5、10、20、50μL等，可以根據(jù)需要更換不同體積的定量環(huán)。當(dāng)前28頁，總共112頁。29手動(dòng)進(jìn)樣器用微量注射器將樣品溶液注入六通閥注意必須使用HPLC專用平頭微量注射器，不能使用氣相色譜尖頭微量注射器，否則會(huì)損壞六通閥。進(jìn)樣方式：有部分裝液法和完全裝液法當(dāng)前29頁，總共112頁。30進(jìn)樣方式①部分裝液法：注入的樣品體積應(yīng)不大于定量環(huán)體積的50%，并要求每次進(jìn)樣體積準(zhǔn)確、相同。②完全裝液法：注入的樣品體積應(yīng)最少是定量環(huán)體積的3倍，以完全置換定量環(huán)內(nèi)流動(dòng)相，消除管壁效應(yīng)，確保進(jìn)樣準(zhǔn)確度及重現(xiàn)性。當(dāng)前30頁，總共112頁。31當(dāng)前31頁，總共112頁。32自動(dòng)進(jìn)樣器由計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制進(jìn)樣六通閥、計(jì)量泵和進(jìn)樣針的位置，按預(yù)先編制的進(jìn)樣操作程序工作，自動(dòng)完成定量取樣、洗針、進(jìn)樣、復(fù)位等過程。當(dāng)前32頁，總共112頁。33色譜分離系統(tǒng)保護(hù)柱色譜柱柱溫箱柱切換閥當(dāng)前33頁，總共112頁。34色譜柱色譜柱是分離好壞的關(guān)鍵使用時(shí)，流動(dòng)相的方向應(yīng)與柱的填充方向一致。色譜柱的柱管外壁都以箭頭顯著地標(biāo)示了該柱的使用方向，安裝和更換色譜柱時(shí)要使流動(dòng)相按箭頭所指方向流動(dòng)。當(dāng)前34頁，總共112頁。35

色譜柱(尺寸)分析型：?4.6mm制備型：?＞5mm以上微徑柱：?<2.1mm柱長：10～25cm，30cm少見柱體：直型優(yōu)質(zhì)不銹鋼柱管當(dāng)前35頁，總共112頁。36色譜柱(裝填)1)方法干法裝柱、勻漿法裝柱2)裝柱要求均勻緊密、不破壞顆粒、不形成裂縫、顆粒粗細(xì)不可分級當(dāng)前36頁，總共112頁。37色譜柱(規(guī)格)填料品牌——選擇性填料粒徑——柱效，dp小，n大。(dp:5um→3um→UPLC1.7um)色譜柱尺寸——流動(dòng)相線速度一致，

分離行為一致。當(dāng)前37頁，總共112頁。38色譜柱的使用與維護(hù)應(yīng)避免壓力、溫度和流動(dòng)相的組成比例急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)如硅膠柱以正己烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗（所有溶劑都必須嚴(yán)格脫水）甲醇能洗去殘留的強(qiáng)極性雜質(zhì)，己烷能使硅膠表面重新活化當(dāng)前38頁，總共112頁。39色譜柱的使用與維護(hù)經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或三氯甲烷）依次沖洗，再以相反順序依次沖洗（如果下一步分析用的流動(dòng)相不含緩沖液，那么可以省略最后用水沖洗這一步）一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質(zhì)在甲醇（乙腈）沖洗時(shí)重復(fù)注射100～200μl四氫呋喃數(shù)次，有助于除去強(qiáng)疏水性雜質(zhì)（類脂）用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脫能除去蛋白質(zhì)污染當(dāng)前39頁，總共112頁。40柱溫箱用于使色譜柱恒溫的裝置，一般其控溫范圍高于室溫，也可低于室溫，通?？刂浦鶞卦?0～40℃。有些柱溫箱還具有柱切換裝置。色譜柱的工作溫度對保留時(shí)間、相對保留時(shí)間、溶劑的溶解能力、色譜柱的性能、流動(dòng)相的粘度都有影響。一般升高柱溫，可增加組分在流動(dòng)相中的溶解度，減小分配系數(shù)K，縮短分析時(shí)間；還可降低流動(dòng)相的黏度，降低柱壓與提高柱效。當(dāng)前40頁，總共112頁。41檢測系統(tǒng)通用型檢測器示差折光檢測器（RID）蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）專屬型檢測器紫外檢測器（UVD）熒光檢測器（FD）電化學(xué)檢測器（ECD）當(dāng)前41頁，總共112頁。42紫外檢測器可變波長紫外檢測器（VWD）當(dāng)前42頁，總共112頁。43紫外檢測器光電二極管陣列檢測器（DAD）當(dāng)前43頁，總共112頁。44紫外檢測器當(dāng)前44頁，總共112頁。45熒光檢測器當(dāng)前45頁，總共112頁。46蒸發(fā)光散射檢測器當(dāng)前46頁，總共112頁。47蒸發(fā)光散射檢測器利用將含有待分離組分的流動(dòng)相霧化、蒸發(fā)形成固體微粒后對光的散射現(xiàn)象來檢測色譜流出組分流動(dòng)相必須是可揮發(fā)的如果流動(dòng)相含有緩沖鹽，則必須使用揮發(fā)性鹽如醋酸銨等，而且濃度要盡可能低當(dāng)前47頁，總共112頁。48蒸發(fā)光散射檢測器優(yōu)點(diǎn)消除了因溶劑和溫度變化而引起的基線漂移，特別適合于梯度洗脫應(yīng)用范圍適用于任何揮發(fā)性小于流動(dòng)相的組分的檢測不適于檢測揮發(fā)和半揮發(fā)性的化合物其他檢測器難以檢測的化合物如磷脂、皂苷、糖類和聚合物等當(dāng)前48頁，總共112頁。49HPLC分析基本操作1．準(zhǔn)備：流動(dòng)相配制、脫氣，樣品制備。2．開機(jī)：依次打開計(jì)算機(jī)、泵、檢測器、柱溫箱電源開關(guān)，儀器自檢。3．裝柱：將吸液頭插入已經(jīng)過濾和脫氣處理的甲醇中，開啟泵，使液體流出，調(diào)流速在0.2mL/min，連接色譜柱（注意方向），待液體流出色譜柱后，再與檢測器連接。當(dāng)前49頁，總共112頁。50HPLC分析基本操作4．平衡：升高流速（常規(guī)分析柱一般至

1mL/min），大約15min后，換上準(zhǔn)備的流動(dòng)相（若流動(dòng)相含鹽或甲醇比例較低，中間需適當(dāng)過渡），待基線走穩(wěn)。5．儀器面板或色譜工作站設(shè)置分析條件，如設(shè)置泵參數(shù)：工作流速、流動(dòng)相比例、高壓限和低壓限；設(shè)置檢測器參數(shù)：如檢測波長（nm）、靈敏度（AUFS）等；編輯樣品名、采集時(shí)間、進(jìn)樣體積等。當(dāng)前50頁，總共112頁。51HPLC分析基本操作6．待基線走穩(wěn)后，進(jìn)樣分析，采集圖譜。7．建立數(shù)據(jù)處理方法，選擇峰寬、積分閾值、處理區(qū)間、指定最小峰面積和峰高等；處理色譜圖，記錄色譜信息（色譜峰面積）。8．沖洗全部測定完畢后，沖洗色譜柱和管路（調(diào)節(jié)溶劑洗脫強(qiáng)度從小到大沖洗柱子）。當(dāng)前51頁，總共112頁。52HPLC分析基本操作9．降流速用面板功能或用色譜管理軟件調(diào)控，流速每次降0.2mL/min，柱壓穩(wěn)定后再降0.2mL/min，降到0.0mL/min為止。10．退出工作站，關(guān)閉工作站后再關(guān)閉計(jì)算機(jī)。關(guān)閉各部件電源。11．登記使用記錄。當(dāng)前52頁，總共112頁。53儀器使用注意事項(xiàng)1．HPLC分析所用水均需純化處理，用新鮮二次蒸餾水或蒸餾水經(jīng)脫離子處理。2．流動(dòng)相需經(jīng)過濾、脫氣后方可使用。樣品需經(jīng)過濾或高速離心后方可進(jìn)樣分析。3．做完實(shí)驗(yàn)后，反相色譜柱需用甲醇沖洗20~30min。若流動(dòng)相中含鹽類或緩沖溶液，應(yīng)先配制相同比例的無鹽流動(dòng)相沖洗，逐漸變化到95%水溶液沖洗，再逐漸變化到用甲醇沖洗，以保護(hù)色譜柱和高壓輸液泵。當(dāng)前53頁，總共112頁。54

HPLC的分類液固色譜液-液色譜鍵合相色譜離子交換色譜體積排阻色譜當(dāng)前54頁，總共112頁。55

當(dāng)前55頁，總共112頁。56HPLC的分類液-液色譜——即分配色譜。固定相是一種機(jī)械吸附在載體上的溶劑，流動(dòng)相是與固定相互不相溶的另一種溶劑。樣品分子根據(jù)在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行分配的差異情況進(jìn)行分離。當(dāng)前56頁，總共112頁。57HPLC的分類鍵合相色譜——吸附＆分配色譜，液-液色譜進(jìn)行改進(jìn)所得的一種色譜方法。固定相是使用一種被化學(xué)共價(jià)鍵結(jié)合到載體顆粒上的有機(jī)固定相，代替在液-液色譜中使用機(jī)械涂敷保持的液相。樣品分子根據(jù)在固定相和流動(dòng)相之間的分配和吸附的差異情況進(jìn)行分離。當(dāng)前57頁，總共112頁。58鍵合相色譜分類正相色譜反相色譜離子對色譜當(dāng)前58頁，總共112頁。59A正相色譜（1）基本概念（2）正相色譜分離原理（3）正相色譜的固定相（4）正相色譜的流動(dòng)相（5）正相色譜的應(yīng)用當(dāng)前59頁，總共112頁。60（1）基本概念正相色譜——固定相為極性基團(tuán)，流動(dòng)相為非極性溶劑。固定相極性大于流動(dòng)相的一種色譜方法。由于固定相極性大于流動(dòng)相，這種相對關(guān)系正好與液-固色譜法相同，因而這種色譜方法被稱為正相色譜法。被共價(jià)結(jié)合在載體上的固定相，是常見的一級氨基和氰基。當(dāng)前60頁，總共112頁。61（2）正相色譜分離原理

正相色譜法的分離原理與液-固色譜法并不一樣，主要根據(jù)所分離化合物在固定相及流動(dòng)相中分配系數(shù)的不同進(jìn)行分離。正相色譜的選擇性特點(diǎn)雖然在某些方面與液-固色譜法有相似之處，但是它不適于分離幾何異構(gòu)體，這一點(diǎn)與液-固色譜法顯然不同。當(dāng)前61頁，總共112頁。62（3）正相色譜的固定相正相色譜的固定相最常見的是被共價(jià)結(jié)合在載體上的一級氨基和氰基，此外還有二醇基、二甲氨基和二氨基。

正相色譜常用固定相結(jié)構(gòu)氰基

-(CH2)3C≡N氨基

-(CH2)nNH2(n=3or4)二醇

-(CH2)3OCH(OH)CH2OH二甲氨基

-(CH2)3N(CH3)2二氨基

-(CH2)3NH(CH2)2NH2當(dāng)前62頁，總共112頁。63（4）正相色譜的流動(dòng)相

正相色譜的流動(dòng)相最常用的是烷烴溶劑。如：正戊烷、正乙烷、正庚烷、環(huán)已烷等。

流動(dòng)相的極性越強(qiáng)洗脫能力越強(qiáng)，也就是強(qiáng)溶劑。反之為弱溶液劑。當(dāng)前63頁，總共112頁。64（5）正相色譜的應(yīng)用

正相色譜適用于分離極性化合物。如：酚類、胺類、多環(huán)化合物、染料、炸藥、羥基化合物、氨基酸和藥物等。這些樣品在正乙烷或其它烷烴溶劑中的溶解度很小，在極性溶劑中的溶解度良好。用正相色譜分離可得到較好的效果。

在使用正相色譜時(shí)一個(gè)值得注意的問題是在用氨基作固定相分離糖時(shí)，一些還原糖容易與固定相的氨基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生席夫堿（Schiffsbase)。當(dāng)前64頁，總共112頁。653)反相色譜（1）基本概念（2）反相色譜分離原理（3）反相色譜的固定相（4）反相色譜的流動(dòng)相（5）流動(dòng)相與固定相之間的關(guān)系（6）實(shí)驗(yàn)條件對分離的影響（7）反相色譜的特點(diǎn)（8）反相色譜的應(yīng)用當(dāng)前65頁，總共112頁。66（1）基本概念反相色譜——固定相為非極性基團(tuán)，流動(dòng)相為極性溶劑。固定相極性小于流動(dòng)相的一種色譜方法。由于固定相極性小于流動(dòng)相，相對關(guān)系正好與液-固色譜法相反，因而這種色譜方法被稱為反相色譜法。被共價(jià)結(jié)合在載體上的固定相是一些直鏈碳?xì)浠衔?，如正辛基等。?dāng)前66頁，總共112頁。67（2）反相色譜分離原理

反相色譜法的分離原理主要根據(jù)所分離化合物疏水性不同在固定相上所滯留的時(shí)間不同而得到分離。當(dāng)水中存在非極性溶質(zhì)時(shí)，溶質(zhì)分子之間的相互作用以及溶質(zhì)分子與水分子間的相互作用遠(yuǎn)小于水分子之間的相互作用，因此溶質(zhì)分子從水中被“擠”了出去，整個(gè)系統(tǒng)的熵增加，自由能降低，使得疏水性強(qiáng)的化合物從流動(dòng)相移出，因而在色譜柱中滯留的時(shí)間延長。當(dāng)前67頁，總共112頁。68（3）反相色譜的固定相

反相色譜的固定相中最常見的是被共價(jià)結(jié)合在硅膠載體上的直鏈飽和烷烴，其鏈長短也不同，最長的是18烷基，也是使用得最多的固定相。

反相色譜常用的微粒鍵合相

官能團(tuán)

載體

顆粒直徑十八烷基

Zorbax3~10mm辛烷基

Nucleosil100A3~10mm苯基

mporasil~7mm二甲硅烷

Lichrosorb3~10mm當(dāng)前68頁，總共112頁。69（4）反相色譜的流動(dòng)相

反相色譜的流動(dòng)相最常用的是水、甲醇、乙腈、丙酮、異丙醇、四氫呋喃等。

反相色譜流動(dòng)相中主要組成是水，它的極性和表面張力最高，因此水是一種最弱的流動(dòng)相，用它洗脫非極性組分時(shí)，表現(xiàn)出的滯留時(shí)間最長。

甲醇和乙腈，是最常用的調(diào)節(jié)劑，主要在于甲醇和乙腈的紫外切點(diǎn)相對較低，而且粘度較小，以及易于提純。當(dāng)前69頁，總共112頁。70（5）流動(dòng)相與固定相之間的關(guān)系注意：緩沖離子不能產(chǎn)生沉淀。溶劑的紫外切點(diǎn)必須小于所使用的檢測波長。避免使用鹵族離子。pH值。當(dāng)前70頁，總共112頁。71（6）實(shí)驗(yàn)條件對分離的影響溫度：反相色譜流動(dòng)相當(dāng)為含有機(jī)溶劑的水溶液時(shí)，粘度較高，最好在較高柱溫下操作，以減少粘度，柱溫一般可高達(dá)50~600C，最高可達(dá)800C。pH值：對于可離解的組分，改變流動(dòng)相pH值，可以改變分離的選擇性，采用一定pH值的緩沖溶液作流動(dòng)相，可以抑制組分的離解。減少峰的拖尾。當(dāng)前71頁，總共112頁。72（7）反相色譜的特點(diǎn)適于分離帶有不同疏水基團(tuán)的化合物?？赏ㄟ^改變?nèi)軇┙M成和pH，來分離不同極性的化合物?？煞蛛x從極性到非極性的寬范圍的化合物。當(dāng)前72頁，總共112頁。73（8）反相色譜的應(yīng)用

可分離極性到非極性的各種化合物。氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)的分離。堿基、核苷和核苷酸的分離。甾體化合物的分離。其它：兒茶酚胺、組胺、糖類、維生素、酶等。

當(dāng)前73頁，總共112頁。744)離子對色譜（1）基本概念（2）分離原理（3）離子對色譜的分類（4）離子對色譜的應(yīng)用當(dāng)前74頁，總共112頁。75（1）基本概念離子對色譜以鍵合相作為固定相，以含有配對離子的溶劑為流動(dòng)相的色譜方法。當(dāng)前75頁，總共112頁。76（1）基本概念一些樣品在水溶液中可以離解為帶電荷的離子。如果在水溶液中加入另一種帶有與分離組分電荷相反的離子，使其成為中性的離子對，可使分離順利進(jìn)行。當(dāng)前76頁，總共112頁。77（2）分離原理（1）離子對形成原理：

組分離子配對離子離子對

A-水相+B+水相A-B+有機(jī)相由于離子對具有疏水性，因而被非極性固定相（即有機(jī)相）提取，組分離子的性質(zhì)不同，它與配對離子形成離子對的能力大小不同，及離子對的疏水性不同，導(dǎo)致各組分在固有定相中滯留時(shí)間不同，因而得以分離。當(dāng)前77頁，總共112頁。78（2）分離原理（1）通過離子鍵相結(jié)合，改變化合物的疏水特性，影響其分配系數(shù)，影響其保留行為。（2）通過配對離子的疏水作用可逆地吸附在柱上，產(chǎn)生動(dòng)態(tài)離子交換，影響保留行為。當(dāng)前78頁，總共112頁。79（3）離子對色譜的分類（1）陽離型配對離子：A親水性配對離子B疏水性配對離子（2）陰離子型配對離子A親水性配對離子B疏水性配對離子當(dāng)前79頁，總共112頁。80（4）離子對色譜法的應(yīng)用一般原則是親水性太強(qiáng)以致滯留時(shí)間過短的化合物，在分離時(shí)可使用疏水性配對離子，以增加滯留時(shí)間，達(dá)到提高分辨率的目的。對于疏水性太強(qiáng)、滯留時(shí)間過長的化合物可以使用親水性配對離子，以減少滯留時(shí)間，并通過選擇特性的改變，來提高分辨率。離子對色譜常用于氨基酸、多肽、生物胺及核苷酸等物質(zhì)的分離。當(dāng)前80頁，總共112頁。81高效液相色譜法分類離子交換色譜：

固定相含有固定的離子基團(tuán)，如-SO3

-，同時(shí)含有相反電荷的反離子（如Na+）。這種反離子也以鹽的形式存在于流動(dòng)相（如NaCl）。具有和反離子同樣電荷的離子型樣品分子（如X-）就可被離子交換劑保留。

X++-SO3-Na+Na++-SO3-X+當(dāng)前81頁，總共112頁。823離子交換色譜法1基本概念2離子交換色譜的固定相3離子交換色譜的流動(dòng)相4離子交換色譜的應(yīng)用當(dāng)前82頁，總共112頁。831)基本概念（1）離子交換色譜：以離交換劑為固定相，借助于樣品中電離組分對固定在交換劑基體上帶相反電荷的離解部位親和力的不同，使用混合物彼此分離的色譜方法。（2）陰離子交換劑：固定相基團(tuán)帶正電荷，可與陽離子交換（3）陽離子交換劑：固定相基團(tuán)帶負(fù)電荷，可與陰離子交換。當(dāng)前83頁，總共112頁。842)離子交換色譜的固定相（1）載體：A樹脂：容量大，pH范圍廣，柱效較低，柱溫高800C。B硅膠：容量小，pH不能超過7.5。柱效高，常溫下分析。當(dāng)前84頁，總共112頁。852)離子交換色譜的固定相（2）陰離子交換柱：A弱陰離子交換劑~NH2-X（氨基）B強(qiáng)陰離子交換劑~NR3-X

（胺基）…...（3）陽離子交換柱：A強(qiáng)陽離子交換劑SO3H（磺酸基）B弱陽離子交換劑COOH（羧基）…...當(dāng)前85頁，總共112頁。863)離子交換色譜的流動(dòng)相（1）改變離子強(qiáng)度：增加緩沖離子強(qiáng)度或在緩沖液中加入其它鹽來提高溶劑強(qiáng)度。離子強(qiáng)度大，洗脫能力強(qiáng)。不影響選擇性。（2）改變pH：A能影響組分的保留時(shí)間。B影響分離的選擇性。（3）增加有機(jī)溶劑：可改變組分的保留作用。有機(jī)溶劑?？刂圃?~10%。當(dāng)前86頁，總共112頁。874)離子交換色譜的應(yīng)用用于離解和可離解的物質(zhì)及某些螯合物的分離，如：核苷酸、各種堿基、核苷、神經(jīng)氨等。分離糖：寡糖和單糖以及一些醇類：甘露糖醇、木糖醇、以至甲醇、乙醇等。以樹脂為載體的離子交換劑“分配作用和排阻作用”比正相色譜分析糖穩(wěn)定，可得到較高的柱效，但要在高溫下進(jìn)行。當(dāng)前87頁，總共112頁。88HPLC法分類體積排阻色譜：即凝膠色譜或分子篩色譜。在該方法中，固定相填料是具有一定孔徑的多孔物質(zhì)。太大的分子被排斥在孔外，而小分子則進(jìn)入大多數(shù)孔隙中。因而大分子能很快地通過柱子，而小分子則被填料保留。通常情況下，體積排阻色譜的分離是嚴(yán)格按分子大小進(jìn)行的。當(dāng)前88頁，總共112頁。894空間排阻色譜1)空間排阻色譜的固定相2)空間排阻色譜的流動(dòng)相3)空間排阻色譜的分離原理4)空間排阻色譜的分類5)空間排阻色譜的特點(diǎn)6)空間排阻色譜的應(yīng)用當(dāng)前89頁，總共112頁。901)空間排阻色譜的固定相又稱為凝膠色譜、分子篩色譜。固定相：為多孔凝膠。當(dāng)前90頁，總共112頁。912)凝膠色譜的流動(dòng)相流動(dòng)相的選擇：在排阻色譜中，常用水作為流動(dòng)相，常用的有機(jī)溶劑有醇類、丙酮。流動(dòng)相不是為了控制分離，而是為了使樣品更好地溶解，或?yàn)榱双@得低粘度來提高柱效率。當(dāng)前91頁，總共112頁。923)空間排阻色譜的分離原理其原理主要是根據(jù)分子的大小和形狀對混合物進(jìn)行分離的方法。當(dāng)前92頁，總共112頁。934)空間排阻色譜的分類（1）凝膠過濾：色譜分離過程在水體系中進(jìn)行。（2）凝膠滲透：色譜分離過程在非水體系中進(jìn)行。當(dāng)前93頁，總共112頁。94當(dāng)前94頁，總共112頁。955)空間排阻色譜的特點(diǎn)（1）分離方法容易掌握。無需考慮流動(dòng)相對分離結(jié)果的影響，更沒必要使用梯度洗脫。（2）分離條件溫和、簡單、快速。是蛋白質(zhì)分析的一個(gè)有力工具。（3）可對分離物的分子量進(jìn)行測定。當(dāng)前95頁，總共112頁。965)空間排阻色譜的應(yīng)用（1）可分析有機(jī)物。（2）可分析無機(jī)物和簡單的小分子。（3）可分離大分子的