大腸埃希氏菌

大腸埃希氏菌第1頁/共27頁大腸埃希菌檢查大腸埃希菌（Escherichiacoil）即大腸桿菌，為腸桿菌科埃希菌屬的模式種。大腸埃希菌是人和溫血動物腸道內(nèi)的棲居菌，隨糞便排出體外。在藥品中檢出大腸埃希菌，表明該樣品受到人和溫血動物糞便的污染，即可能是污染腸道病原體。大腸埃希菌除普通大腸埃希菌外，還有致病性大腸埃希菌，可引起嬰幼兒、成人爆發(fā)性腹瀉。為了保證人體健康，口服給藥制劑必須檢查大腸埃希菌。第2頁/共27頁標(biāo)準(zhǔn)《中國藥典》（2010年版）二部口服給藥制劑細(xì)菌總數(shù)每1ml不得過100cfu霉菌和酵母菌總數(shù)每1ml不得過100cfu大腸埃希菌總數(shù)不得檢出第3頁/共27頁備料單（增菌培養(yǎng)）序號品名規(guī)格數(shù)量備注1錐形瓶250ml42刻度吸管10ml23刻度吸管1ml14燒杯250ml15量筒100ml16膽鹽乳糖培養(yǎng)基100ml3裝錐形瓶7pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液150ml1裝錐形瓶滅菌參數(shù)：121℃、20min第4頁/共27頁操作過程樣品10ml90ml供試液稀釋液陰樣陽10ml10ml10ml菌懸液1mlBL培養(yǎng)基BL培養(yǎng)基BL培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度：36℃培養(yǎng)時間：18~24h（必要時可延長至48h）第5頁/共27頁備料單（快速生化試驗(yàn)）序號品名規(guī)格數(shù)量備注1刻度吸管1ml32試管中43MUG培養(yǎng)基5ml4分裝到試管中4靛基質(zhì)————滅菌參數(shù)：115℃、20min第6頁/共27頁操作過程陰樣陽陰樣陽本底靛基質(zhì)試驗(yàn)紫外熒光0.2ml0.2ml0.2ml培養(yǎng)溫度：36±1℃培養(yǎng)時間：18~24h第7頁/共27頁備料單（分離培養(yǎng)）序號品名規(guī)格數(shù)量備注1EMB或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基60ml1置皿2平皿——3滅菌參數(shù)：121℃、15min第8頁/共27頁操作過程陰樣陽EMB或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基接種環(huán)（四區(qū)劃線法）培養(yǎng)溫度：36±1℃培養(yǎng)時間：18~24h第9頁/共27頁生化試驗(yàn)中MUG在紫外等下顯熒光的原理大腸埃希氏菌是指能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶分解ONPG使培養(yǎng)液呈黃色，能產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶分解MUG使培養(yǎng)液在波長366nm紫外光下產(chǎn)生熒光的細(xì)菌。

第10頁/共27頁BL培養(yǎng)基配方（每升）：胨20.0g提供碳氮源乳糖

5.0g可發(fā)酵的糖類氯化鈉

5.0g維持均衡的滲透壓磷酸氫二鉀4.0g緩沖劑磷酸二氫鉀1.3g去氧膽酸鈉/牛膽鹽0.5g/2.0

g選擇性抑菌劑

第11頁/共27頁使用方法1、稱取本品35.8g，加入蒸餾水或去離子水1

L，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝三角瓶，每瓶100mL，121℃滅菌20min，待冷至常溫后，備用。

2、樣品的處理。略。

3、取膽鹽乳糖增菌液3份，2份分別加入規(guī)定量的供試液，其中一份加入對照菌50～100個作陽性對照，第三份加入與供試液等量的稀釋液作陰性對照。

4、將三角瓶放入30～35℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～24h。必要時可延長至48h。

5、觀察結(jié)果。陽性對照應(yīng)生長良好，陰性對照應(yīng)無菌生長。

質(zhì)量控制：本品質(zhì)控菌株接種后，于36±1℃培養(yǎng)18～24h，培養(yǎng)結(jié)果肉湯呈混濁。第12頁/共27頁MUG培養(yǎng)基配方（每升）：胰蛋白胨

20.0g提供碳氮源3號膽鹽

1.5g抑制革蘭氏陽性菌乳糖5.0g可發(fā)酵的糖類磷酸氫二鉀4.0g緩沖劑磷酸二氫鉀

1.5g氯化鈉5.0g維持均衡的滲透壓MUG0.05g第13頁/共27頁使用方法1、稱取本品37.05g，加入蒸餾水或去離子水1

L，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝于帶有小倒管的試管中，115℃高壓滅菌20min，待冷至常溫，備用。

2、將總大腸菌群多管發(fā)酵法初發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)氣的管進(jìn)行大腸埃希氏菌檢測。用燒灼滅菌的金屬接種環(huán)或無菌棉簽將上述試管中液體接種到EC-MUG肉湯管中。

3、將已接種的EC-MUG管在培養(yǎng)箱或恒溫水浴中44.5±0.5℃培養(yǎng)24h±2h。如使用恒溫水浴，在接種30min內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，水浴箱的液面應(yīng)高于EC-MUG肉湯液面。

4、觀察結(jié)果：將培養(yǎng)基管置366nm紫外燈下約5cm處，以未接種培養(yǎng)物的EC-MUG培養(yǎng)基作空白對照，觀察有無藍(lán)白色熒光?？瞻讓φ展軕?yīng)無藍(lán)白色熒光，試驗(yàn)管出現(xiàn)藍(lán)白色熒光為陽性反應(yīng)。質(zhì)量控制：大腸埃希菌菌株接種后于36±1℃培養(yǎng)18~24h，結(jié)果產(chǎn)氣，紫外燈下顯熒光。第14頁/共27頁EMB瓊脂培養(yǎng)基配方（每升）：胨

10.0g提供氮源、維生素、氨牛肉浸出粉3.0g基酸和碳源氯化鈉5.0g維持均衡的滲透壓乳糖

10.0g可發(fā)酵的糖類瓊脂

14.0g培養(yǎng)基凝固劑曙紅鈉

0.4g抑菌劑（革蘭氏陽性菌）亞甲藍(lán)0.065gpH指示劑在酸性條件下產(chǎn)生沉淀，形成紫黑色菌落或具黑色中心的外圍無色透明的菌落。第15頁/共27頁使用方法1、稱取本品42.5g，加入蒸餾水或去離子水1

L，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝三角瓶，121℃高壓滅菌15min。

2、待培養(yǎng)基冷至50℃左右，以無菌手續(xù)，傾注滅菌平皿，待凝固后，備用。

3、將供試液劃線接種于平板上。

4、將平板翻轉(zhuǎn)，放入恒溫培養(yǎng)箱中，30～35℃培養(yǎng)18～24h。

5、觀察結(jié)果。質(zhì)量控制：本培養(yǎng)基傾注平皿待冷卻后呈紫色，可有細(xì)微沉淀。大腸埃希菌菌株接種后。36±1℃培養(yǎng)18～24h，培養(yǎng)結(jié)果呈黑心，有綠色金屬光澤。第16頁/共27頁麥康凱瓊脂培養(yǎng)基配方（每升）胨

20.0g碳氮源、維生素和生長因子牛膽鹽5.0g抑制革蘭氏陽性菌的生長氯化鈉

5.0g維持均衡的滲透壓瓊脂

14.0g培養(yǎng)基的凝固劑乳糖10.0g可發(fā)酵的糖類中性紅0.03gpH指示劑細(xì)菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸時菌落呈粉紅色并在菌落周圍出現(xiàn)膽鹽沉淀的渾濁圈。

第17頁/共27頁使用方法1、

稱取本品54.0g，加入蒸餾水或去離子水1

L，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝三角瓶，121℃高壓滅菌15min。

2、待培養(yǎng)基冷至50～55℃傾注滅菌平皿，待凝固后，備用。

3、取待檢樣品劃線接種于麥康凱平板。

4、將平板置培養(yǎng)箱于30～35℃培養(yǎng)18～24h。

5、觀察結(jié)果。在做致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)時，觀察結(jié)果不但要注意乳糖發(fā)酵的菌落，同時也要注意不發(fā)酵和遲緩發(fā)酵的菌落。質(zhì)量控制：大腸埃希菌菌株經(jīng)36±1℃培養(yǎng)18~24h菌落特征呈粉紅或紅，周圍有混濁膽鹽沉淀圈。第18頁/共27頁IMViC用來測定菌的生理生化特征的4個實(shí)驗(yàn).I:吲哚試驗(yàn)M:甲基紅試驗(yàn)V:V.P試驗(yàn)C:檸檬酸實(shí)驗(yàn)i是為個好讀加上去的第19頁/共27頁吲哚（indole）實(shí)驗(yàn)原理：有些細(xì)菌如大腸埃希菌、變形桿菌、霍亂弧菌等能分解培養(yǎng)基中的色氨酸生成吲哚（靛基質(zhì)），經(jīng)與試劑中的對二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈紅色，是為吲哚試驗(yàn)陽性。①試驗(yàn)菌用蛋白胨水培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24小時.②在培養(yǎng)液中加入乙醚1ml(使呈明顯的乙醚層)充分振蕩,使吲哚試劑溶于乙醚.靜置片刻,待乙醚浮于培養(yǎng)液上面時沿管壁慢慢加入吲哚試劑10滴.呈玫瑰紅的為陽性,不變色的為陰.(注:加入吲哚試劑后,不可再搖動,否則紅色不明顯)第20頁/共27頁甲基紅試驗(yàn)M:甲基紅試驗(yàn)為腸道細(xì)菌的IMViC四類測試中的M，甲基紅為一種酸性指示劑，根據(jù)腸道細(xì)菌的糖代謝途徑的不同，最終產(chǎn)生酸性產(chǎn)物不一，PH值有所差異，導(dǎo)致甲基紅顯示出不同的顏色，從而用于鑒別腸道細(xì)菌。呈現(xiàn)紅色為陽性；橘紅色為弱陽性；黃色為陰性。①試驗(yàn)菌用葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24小時.②沿管壁加入M.R.(甲基紅)試劑3-4滴.紅的為陽性,黃的為陰性.第21頁/共27頁甲基紅試驗(yàn)原理:某些細(xì)菌在糖代謝過程中，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸可進(jìn)一步分解，產(chǎn)生甲酸、乙酸、乳酸等，使培養(yǎng)基的pH降至4.5以下，當(dāng)加入甲基紅試劑則呈紅色，為甲基紅試驗(yàn)陽性。若細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸量少，或產(chǎn)生的酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)（如醇、酮、醚、氣體和水等），則培養(yǎng)基的酸度仍在pH6.2以上，故加入甲基紅指示劑呈黃色，是為陰性。第22頁/共27頁V.P試驗(yàn)（乙酰甲基甲醇試驗(yàn)）某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)液中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中氧，氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V－P（+）反應(yīng)。①試驗(yàn)菌用葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24小時.②加入40%KOH10-20滴,再加入等量α-茶酚,用力振蕩(拔去棉塞)再放入37℃4h后再觀察,仍無色產(chǎn)生為陰.第23頁/共27頁檸檬酸實(shí)驗(yàn)檸檬酸鹽培養(yǎng)基系一綜合性培養(yǎng)基，其中檸檬酸鈉為碳的唯一來源。而磷酸二氫銨是氮的唯一來源。有的細(xì)菌如產(chǎn)氣桿菌，能利用檸檬酸鈉為碳源，因此能在檸檬酸鹽培養(yǎng)基上生長，并分解檸檬酸鹽后產(chǎn)生碳酸鹽，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性。此時培養(yǎng)基中的溴麝香草酚藍(lán)指示劑由綠色變?yōu)樯钏{(lán)色。不能利用檸檬酸鹽為碳源的細(xì)菌，在該培養(yǎng)基上不生長，培養(yǎng)基不變色。①將試驗(yàn)菌培養(yǎng)在檸檬酸鹽培養(yǎng)基斜面上37℃培養(yǎng)24-28小時.②觀察有無細(xì)菌生長與培養(yǎng)基顏色變化.如