高效菌篩選方法及策略

關(guān)于高效菌篩選方法及策略第一頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四第三章高效有機物降解菌的構(gòu)建

技術(shù)及策略

第一節(jié)高效有機物降解菌的構(gòu)建技術(shù)一、傳統(tǒng)分離及馴化技術(shù)二、誘變技術(shù)三、細胞融合技術(shù)四、基因重組技術(shù)五、基因工程第二頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四

第三章高效有機物降解菌的構(gòu)建技

術(shù)和策略

第二節(jié)高效有機物降解菌的構(gòu)建策略一、優(yōu)化污染物的降解途徑1.重組互補代謝途徑2.改變污染物代謝產(chǎn)物流向3.同源基因體外隨機拼接4.拓寬氧化酶的專一性二、提高污染物生物可利用性1.重組表面活性劑編碼基因2.重組污染物跨膜轉(zhuǎn)運基因三、增強細菌的環(huán)境適應(yīng)性1.增強細菌的抗毒能力2.增強細菌的放射線耐受性第三頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四第一節(jié)高效有機物降解菌的構(gòu)建技術(shù)一、傳統(tǒng)分離及馴化技術(shù)不經(jīng)人工誘變，利用微生物的自然突變進行菌種選育的過程稱為自然選育或自然分離。微生物自然突變有兩種原因：(1)自然環(huán)境中存在的低劑量的宇宙射線、各種短波輻射、低濃度的誘變物質(zhì)和微生物自身代謝產(chǎn)生誘變物質(zhì)的作用引起的突變；（2）在DNA的復(fù)制過程中所發(fā)生的錯配。

第四頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四一、傳統(tǒng)分離及馴化技術(shù)來源：土壤、水、空氣、動植物極其腐敗殘體、有機物污染地區(qū)、污水處理系統(tǒng)中。采樣增殖培養(yǎng)純種分離篩選性能鑒定第五頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四第六頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四一、傳統(tǒng)分離及馴化技術(shù)采樣：應(yīng)根據(jù)篩選的目的、微生物分布情況、菌種的主要特征極其生態(tài)關(guān)系等因素，確定具體時間、地點和目標(biāo)物。增殖：為提高分離效率，常以投其所好的原則在培養(yǎng)基中添加特殊的養(yǎng)分，使其所需菌種的數(shù)量相對增加。主要是利用不同微生物的生長繁殖對環(huán)境和培養(yǎng)基的特殊要求進行富集培養(yǎng)和要求，控制這些條件使之有利于某類和某種微生物，而對其它微生物不利，再對培養(yǎng)時間加以控制，可以達到初步的分離和富集目的。

第七頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四一、傳統(tǒng)分離及馴化技術(shù)純化：1.菌落純2.菌株純1.菌落純：從“種”的水平來說是純的，其方法有劃線分離法、涂布分離法和稀釋分離法。2.菌株純：較為精細的單孢子或單細胞分離法。性能鑒定：菌的生長情況、酶活測定、效果測定自然選育是一種簡便易行的選育方法。但自然選育的效率低（10-8—10-10）。第八頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四二、誘變育種誘變育種是人為地利用物理、化學(xué)等因素，使誘變的細胞內(nèi)遺傳物質(zhì)染色體或DNA的片段發(fā)生缺失、易位、倒位、重復(fù)等畸變，或DNA的某一部位發(fā)生改變(又稱點突變)，從而使微生物的遺傳物質(zhì)DNA或其化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，引起微生物的遺傳變異。因此，誘發(fā)突變的頻率遠大于自然突變。第九頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四第十頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四誘變過程出發(fā)菌株的選擇：1.選擇純種作為出發(fā)菌株，借以排除異核體或異質(zhì)體的影響；2.不僅效果好，而且要考慮其它形狀，如生長快、營養(yǎng)要求低等；3.對誘變劑敏感的菌株；4.選擇已經(jīng)誘變過的菌株。誘變劑的選擇（物理：紫外線、X射線等，化學(xué)：堿基類似物，5-氟尿嘧啶；烷化劑，亞硝基胍，甲基磺酸乙酯）要考慮誘變劑本身的特點，如紫外線作用于DNA分子的嘧啶堿基，而亞硝酸主要作用于DNA分子的嘌呤堿基，兩者復(fù)合使用，突變譜寬，效果較好。第十一頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四誘變過程影響誘變效果的因素：菌種的生理狀態(tài)：對分裂中的細胞更有效；細胞懸浮液要求生理狀態(tài)一致，為分散均勻的單細胞或單孢子懸浮液（一方面分散狀態(tài)的細胞可以均勻地接觸誘變劑，另一方面可避免長出不純菌落）。第十二頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四誘變過程

誘變劑的劑量：誘變率隨誘變劑量的增加而提高，但達到一定程度后，再提高劑量，反而會使誘變率下降，使負變異株多，因此，主張用中等劑量，如75%-80%或更低劑量。充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)。復(fù)合處理可以將兩種或多種誘變劑分先后或同時使用，也可以用同一誘變劑重復(fù)使用。復(fù)合處理可擴大突變的位點范圍，使獲得正突變菌株的可能性增大。第十三頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四

篩選過程特點：發(fā)生頻率低；隨機性大過程：先初篩，后復(fù)篩，測突變菌株性能誘變育種的基本篩選程序：出發(fā)菌株→絕大多數(shù)個體死亡，少數(shù)存活（存活率）→少數(shù)突變（突變率）→少數(shù)正變（正變率）→少數(shù)降解酶活增加幅度大（增加率）且要求穩(wěn)定

第十四頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四三.原生質(zhì)體融合

原生質(zhì)體融合(Protoplastfusion)指在一定選擇條件下，使遺傳性狀不同的兩細胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并進而發(fā)生遺傳重組以產(chǎn)生同時帶有雙親性狀的、遺傳性穩(wěn)定的融合子。始于1976年，最早是在動物實驗中發(fā)現(xiàn)的，后來早微生物中得以應(yīng)用。使細胞間基因重組的頻率大大提高了，已大于10-1（而誘變育種一般僅為10-6）。發(fā)生基因重組親本的選擇范圍更大，可以在不同種、屬、科，甚至更遠緣的微生物之間進行。第十五頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四三.原生質(zhì)體融合在有些情況下，兩種或多種微生物在共同存在時才能降解某種污染物，單獨存在時不能降解該污染物，這可能是因為彼此為對方提供了生長所必須的條件或為對方消除了生長的障礙，使得它們在共存的條件下能夠順利降解環(huán)境污染物。在這種情況下，可以采用原生質(zhì)體融合技術(shù)融合這兩種微生物，融合子就會具備兩個親本的基因與優(yōu)點，能夠降解某種環(huán)境污染物，這也是目前污染治理工程菌制備的一個主要途徑。第十六頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四三.原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合特點：1雜交頻率較高2遺傳物質(zhì)體傳遞更為完整3存在著兩株以上親株同時參與融合形成融合子的可能4提高效果的潛力較大第十七頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四三.原生質(zhì)體融合3.1選擇親株：必須選遺傳性狀穩(wěn)定且具有優(yōu)勢互補的兩個親株，而且必須帶有可以識別的遺傳標(biāo)記（多為營養(yǎng)缺陷型或抗藥性標(biāo)記）。3.2原生質(zhì)體制備：去除細胞壁是制備原生質(zhì)體的關(guān)鍵，一般采用酶解法去壁。多酶混合除壁效果較好。影響因素：菌體前處理、菌齡、酶濃度、酶處理溫度、PH、滲透壓穩(wěn)定劑（不僅起保護原生質(zhì)體免于膨裂，而且還有助于酶和底物的結(jié)合。原生質(zhì)體對滲透壓極其敏感，低滲引起細胞破裂。多采用甘露醇、山梨醇、蔗糖等有機物和氯化鉀和氯化鈉等無機物。穩(wěn)定劑的濃度一般均在0.3-0.8mol/L之間。第十八頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四三.原生質(zhì)體融合3.3原生質(zhì)體融合：融合促進劑：聚乙二醇（PEG，濃度為25%－40%）可有效促進原生質(zhì)體融合。另外，紫外線照射和脈沖電場等物理因素處理也能促進原生質(zhì)體融合。3.4原生質(zhì)體再生：是使原生質(zhì)體重新長出細胞壁，恢復(fù)完整的細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。可再生的只占原生質(zhì)體的一部分，細菌再生率為3%~10%；真菌為20%~80%。用再生培養(yǎng)基。提高再生率必須避免因強力動作而使原生質(zhì)體破裂，另外菌液濃度不宜太高。菌齡、再生時的溫度、溶菌酶用量和溶壁時間、細胞壁去除程度等因素都會影響再生。第十九頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四三.原生質(zhì)體融合3.5篩選優(yōu)良性狀融合重組子：原生質(zhì)體融合后，來自兩親代的遺傳物質(zhì)經(jīng)過交換并發(fā)生重組而形成的子代成為融合重組子。這種重組子通過兩親株遺傳標(biāo)記的互補而得以識別。（真正的融合和暫時的融合）融合子生理生化測定。原生質(zhì)體技術(shù)還可用于誘變育種中。第二十頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四四、基因重組技術(shù)

1.轉(zhuǎn)化受體菌直接吸收了來自供體菌的DNA片段，通過交換，把它整合到自己的基因組中，再經(jīng)復(fù)制就使自己變成一個轉(zhuǎn)化子。在原核生物中，轉(zhuǎn)化是一個較普遍的現(xiàn)象。能進行轉(zhuǎn)化的受體細胞必須處于感受態(tài)（受體細胞最易接受外源DNA片段并實現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)）。感受態(tài)因子是一種胞外蛋白?？赡苁羌毎ど系囊环N組成，催化DNA吸收據(jù)推測可能是一種自溶酶第二十一頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四1.轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化因子本質(zhì)：DNA大?。赫技毦巳旧w組的0.3%，含15個基因。轉(zhuǎn)化頻率：0.1%~1%，最高達10%。呈質(zhì)粒形式的轉(zhuǎn)化因子，其轉(zhuǎn)化頻率最高，因為它進入受體菌后，可不必同受體染色體進行交換、整合即可進行復(fù)制和表達，一般認為轉(zhuǎn)化因子都是線狀雙鏈DNA。

第二十二頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四過程：1）雙鏈DNA片段與感受態(tài)受體細胞表面的特異位點結(jié)合；2）在吸附位點上的DNA被核酸內(nèi)切酶分解，形成片段；3）一條單鏈被膜上的另一種核酸酶切除，另一條單鏈逐步進入細胞；4）DNA片段與受體細胞核染色體組上的同源區(qū)段配對，交換、整合和取代，形成雜合DNA片段；5）受體菌染色體復(fù)制，一個為轉(zhuǎn)化子，一個不是。1.轉(zhuǎn)化第二十三頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四2.轉(zhuǎn)導(dǎo)通過轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的媒介，把供體細胞的DNA小片段攜帶到受體細胞中，通過交換與整合，從而使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象。第二十四頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四2.傳導(dǎo)通過完全缺陷噬菌體對供體菌任何DNA小片段的“誤包”，而實現(xiàn)其遺傳性狀傳遞至受體菌的傳導(dǎo)現(xiàn)象。完全缺陷噬菌體：當(dāng)噬菌體在供體菌內(nèi)增殖時，宿主的核染色體組斷裂，待噬菌體成熟與包裝之際，極少數(shù)噬菌體的衣殼與噬菌體頭部DNA芯子相仿的一小段供體菌DNA片段誤包入其中，形成了一個不含噬菌體自身DNA的假噬菌體。進行完全普遍傳導(dǎo)和流產(chǎn)普遍傳導(dǎo)第二十五頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四2.傳導(dǎo)完全普遍傳導(dǎo)：完全缺陷噬菌體將外源DNA導(dǎo)入受體細胞，該片段可與受體細胞核染色體組上的同源區(qū)段配對，再經(jīng)過雙交換而整合到受體菌染色體組上，使后者成為一個遺傳性狀穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。流產(chǎn)普遍傳導(dǎo)：經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)而獲得的供體菌DNA片段的受體菌，如果外源DNA在其內(nèi)不進行交換、整合和復(fù)制，也不迅速消失，而僅進行轉(zhuǎn)錄、翻譯和性狀表達。第二十六頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四第二十七頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四3、接合供體菌（雄）通過其性菌毛與受體菌（雌）相接觸，前者傳遞不同長度的單鏈DNA給后者，并在后者細胞中進行雙鏈化或進一步與核染色體發(fā)生交換、整合，從而使后者獲得供體菌的遺傳性狀的現(xiàn)象。F因子：決定性別的質(zhì)粒第二十八頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四第二十九頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四第三十頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四五.基因工程技術(shù)基因工程是分子水平上在生物體外用人工方法進行ＤＮＡ的重組，以改變生物的性狀創(chuàng)造生物的新品種或新物種的一門新學(xué)科。

對于環(huán)境中難以降解的有毒有害化合物，可通過基因工程的方法，設(shè)計新的代謝途徑，利用相關(guān)的基因構(gòu)建工程菌。這樣不僅提高細胞單一酶的濃度增加代謝途徑中某一限制酶的表達，還能使代謝途徑中所有基因的表達獲得同步增加，從而大大提高降解效率，促使有毒化合物分子進一步降解為無害的末端產(chǎn)物。

第三十一頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四五.基因工程主要過程：獲得特定的目標(biāo)基因目標(biāo)基因片段

DNA重組載體DNA進入受體細胞并擴增、表達具目標(biāo)基因表達功能重組體第三十二頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四黏性末端黏性末端1、限制性核酸內(nèi)切酶限制酶是在生物體(主要是微生物)內(nèi)的一種酶，一種限制性內(nèi)切酶只能識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開（切割DNA分子）來源：主要從原核細胞分離作用：

作用結(jié)果：EcoRI基因工程的“專用工具”平未端及粘性未端第三十三頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四什么叫黏性末端？被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端。第三十四頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個切口？可產(chǎn)生幾個黏性末端？要切兩個切口，產(chǎn)生四個黏性末端。如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會怎樣呢？會產(chǎn)生相同的黏性末端，然后讓兩者的黏性末端黏合起來，就似乎可以合成重組的DNA分子了。第三十五頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四第三十六頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四基因的針線：DNA連接酶G

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G同種限制酶切割第三十七頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四基因的針線——DNA連接酶

DNA連接酶可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，即把梯子兩邊扶手的斷口連接起來(形成磷酸二酯鍵)，這樣一個重組的DNA分子就形成了。第三十八頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四導(dǎo)入過程需要運輸工具——運載體。運載體的作用有哪些？作用一：作為運載工具，將外源基因轉(zhuǎn)移到受體細胞中去。作用二：利用運載體在受體細胞內(nèi)，對外源基因進行大量復(fù)制。第三十九頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四（一）載體基因克隆載體條件：（1）具有能使外源DNA片段組入的克隆位點。（2）能攜帶外源DNA進入受體細胞或游離在細胞質(zhì)中進行自我復(fù)制，或整合到染色體DNA上隨DNA復(fù)制而復(fù)制。（3）必須具有遺傳標(biāo)記，承載外源DNA的載體進入受體細胞后，以便篩選克隆子。第四十頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四常用的運載體主要有兩類：

1）質(zhì)粒

2）噬菌體或某些動植物病毒第四十一頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四質(zhì)粒1.質(zhì)粒的定義：一般來說符合以下3條標(biāo)準(zhǔn)的染色體外的DNA或RNA分子都可以稱之為質(zhì)粒：(1)質(zhì)粒是染色體外能自主復(fù)制的遺傳因子；(2)不具備胞外期的感染性；(3)它對宿主來說不是必需的。構(gòu)建質(zhì)粒載體一般選用分子小和松弛型復(fù)制的質(zhì)粒。松弛型質(zhì)粒在宿主細胞內(nèi)可含10－200個拷貝，而且不受宿主細胞蛋白質(zhì)合成的影響，當(dāng)宿主細胞蛋白質(zhì)合成停止時，質(zhì)粒DNA的復(fù)制仍可以繼續(xù)進行，甚至可以將拷貝數(shù)增加至數(shù)千個。細菌對環(huán)境中的特異性限制因子的應(yīng)答能力一般是由質(zhì)粒控制的，因此，質(zhì)粒在為宿主細胞提供遺傳多樣性及其利用大范圍生態(tài)位的適應(yīng)中起著非常重要的作用。

第四十二頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四大腸桿菌的質(zhì)粒：

最常用的質(zhì)粒是大腸桿菌的質(zhì)粒，其中常含有抗藥基因，如抗四環(huán)素的標(biāo)記基因。質(zhì)粒的存在與否對宿主細胞生存沒有決定性作用，但復(fù)制只能在宿主細胞內(nèi)完成。第四十三頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四質(zhì)粒的生物學(xué)特性質(zhì)粒的存在形式有超螺旋、開環(huán)雙螺旋和線狀雙螺旋三種，雙螺旋共價閉合環(huán)（SC構(gòu)型）開環(huán)雙螺旋（OC構(gòu)型）線狀雙螺旋（L構(gòu)型）第四十四頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四五.基因工程

質(zhì)粒的大小一般為染色體的0.05%~20%或更多，長度為1~20kb，有時細菌中含有大小不同的質(zhì)粒。質(zhì)粒可以以不同的方式在細菌的種群中傳遞，轉(zhuǎn)移的頻率大到10－2,而染色體的轉(zhuǎn)移頻率卻只有10－6~10－8。假單胞菌中，發(fā)現(xiàn)有分解功能的質(zhì)粒，帶有這些質(zhì)粒的菌表現(xiàn)為具有降解非正常碳源，如樟腦、辛烷、水楊酸等的能力。質(zhì)粒的消除試驗則是鑒定質(zhì)粒功能的又一重要手段，通過消除質(zhì)粒來觀察寄主細胞是否喪失某些性狀。

第四十五頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四五.基因工程2.質(zhì)粒的基本性質(zhì)1）細菌質(zhì)粒是雙股的共價閉合環(huán)狀DNA分子，即cccDNA。2）每一種質(zhì)粒有自己特定的核苷酸序列，所以每一種限制酶對每一種質(zhì)粒都有固定的切點數(shù)和切點位置。3）質(zhì)粒都有自主復(fù)制功能。4）不僅能自主復(fù)制，而且能平均分配到兩個子細胞中，從而使質(zhì)粒能穩(wěn)定遺傳。5）具有不相容性。6）都具有一定寄主范圍。第四十六頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四五.基因工程2.質(zhì)粒的基本性質(zhì)7）對寄主細胞是非必須的。8）質(zhì)粒DNA能通過轉(zhuǎn)化作用引入到細菌細胞。9）某些質(zhì)粒為一些特殊的表型編碼，可稱抗性質(zhì)粒、代謝質(zhì)粒和毒素質(zhì)粒等。10）分子量大的質(zhì)粒一般具有接合功能，即借助于細胞間接觸，供體菌的質(zhì)粒可以轉(zhuǎn)移至受體菌中。11）有些質(zhì)?？梢砸杂坞x于寄主染色體和與染色體整合兩種狀態(tài)存在。12）質(zhì)?？捎米骰蜉d體。第四十七頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四質(zhì)粒pBR322pBR3224363結(jié)構(gòu)：（1）氨芐青霉素抗性基因（ampr或Apr）3種限制酶單一識別位點。（2）四環(huán)素抗性基因（tetr或Tcr）內(nèi)部有7種，啟動區(qū)內(nèi)有2種限制酶單一識別位點。（3）DNA復(fù)制起點（ori）第四十八頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四pBR322質(zhì)粒的優(yōu)點：（1）具有較小的分子量。

4363bp，2.6×106Da，（2）具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號。（3）具較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過氯霉素擴增之后,每個細胞中可累積1000～3000個拷貝。（4）對多種常見的限制性內(nèi)切核酸酶只含有一個能切割的位點。

pBR3224363第四十九頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四五.基因工程3.質(zhì)粒的生態(tài)遺傳學(xué)意義質(zhì)粒有著重要的生態(tài)遺傳學(xué)意義，它們作為“微染色體”能從一個細胞中方便地分離出來，并方便地轉(zhuǎn)入到另一個細胞中去，這一特征為現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展提供了重要的工具和手段。在DNA克隆方法學(xué)的發(fā)展進程中，質(zhì)粒起著至關(guān)重要的作用，以質(zhì)粒作為運載體在細菌中擴增和表達許多外源基因的方法和技術(shù)，在工、農(nóng)、醫(yī)各個領(lǐng)域中都得到了廣泛的應(yīng)用，并極大地拓展了人們對質(zhì)粒微生物學(xué)認識的視野。第五十頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四五.基因工程4、載體和目的基因重組4.1以質(zhì)粒為載體的ＤＮＡ重組質(zhì)粒是最常用的載體。優(yōu)點：分子量小，可自主或半自主復(fù)制，有多個選擇性標(biāo)記，多個酶切位點，拷貝數(shù)多，性能穩(wěn)定。可隆的最大DNA片段一般在10kb左右。4.2以噬菌體為載體的ＤＮＡ重組先把降解性基因克隆進λ噬菌體內(nèi)，將重組ＤＮＡ經(jīng)體外包裝成成熟噬菌體顆粒，從而能夠按照正常的噬菌體感染過程導(dǎo)入寄主細胞。其優(yōu)點在于克隆效率較高，降解性基因整合進寄主染色體后比較穩(wěn)定。缺點是包裝限制問題，對于ＤＮＡ片段大于23ｋｂ降解性基因則不能成功地被克隆。

第五十一頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四四個基本步驟：（三）基因操作的基本步驟1）提取目的基因2）目的基因與運載體結(jié)合3）將目的基因?qū)胧荏w細胞4）目的基因的檢測和表達第五十二頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四目的基因是人們所需要轉(zhuǎn)移或改造的基因。如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因，還有植物的抗?。共《?、抗細菌）基因、降解有機物的降解基因等。目的基因：包括轉(zhuǎn)錄的啟動區(qū)、基因編碼區(qū)和終止區(qū)的全功能基因。步驟一：目的基因的提取第五十三頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四目的基因的提取方法直接分離基因人工合成基因反轉(zhuǎn)錄法根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA：鳥槍法

在獲取真核細胞中的目的基因時,一般用人工合成基因的方法.第五十四頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四哪些新技術(shù)能大大簡化基因工程的操作技術(shù)？1）DNA序列自動測序儀：2）PCR技術(shù)：對提取出來的基因進行核苷酸序列分析。使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增。第五十五頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四步驟二：目的基因與運載體重組

1）用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出黏性末端。

2）用同一種限制酶切斷目的基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端。

3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個重組DNA分子（重組質(zhì)粒）目的基因與運載體的結(jié)合過程，實際上是不同來源的基因重組的過程。第五十六頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四基因操作的基本步驟目的基因?qū)胧荏w細胞的方法1、將細菌用CaCl2處理，以增大細菌細胞壁的通透性。2、使含有目的基因的重組質(zhì)粒進入受體細胞。3、目的基因在受體細胞內(nèi)，隨其繁殖而復(fù)制，由于細菌繁殖的速度非常快，在很短的時間內(nèi)就能獲得大量的目的基因。第五十七頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四常用的受體細胞：有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細胞等。將目的基因?qū)胧荏w細胞的原理借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。步驟三：目的基因?qū)胧荏w細胞第五十八頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞導(dǎo)入擴增第五十九頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四導(dǎo)入過程：運載體為質(zhì)粒，受體細胞為細菌受體細胞：細菌細胞壁的通透性增大重組質(zhì)粒進入受體細胞目的基因隨受體細胞的繁殖而復(fù)制氯化鈣大量的目的基因第六十頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四步驟四克隆子的篩選和鑒定目的基因?qū)胧荏w細胞后，真正獲得目的基因并能有效表達的克隆子只是一小部分。1利用克隆載體攜帶的選擇標(biāo)記基因篩選克隆子。A利用抗菌素抗性基因進行篩選Ampr（抗氨芐青霉素）Cmpr（抗氯霉素）kanr（抗卡那霉素）Tetr（抗四環(huán)素）Strr（抗鏈霉素）。當(dāng)含任何一種抗菌素抗性基因的載體處理不具這種抗性基因的受體細胞，并在含相應(yīng)抗菌素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，只有獲得載體的受體細胞才能繼續(xù)生長，這樣便可篩選出含克隆載體的克隆子。第六十一頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四外源DNApBR3224363PstI酶切PstI酶切黏性末端黏性末端連接酶重組子(ampstetr)空載體(amprtetr)

野生型的E.coli(ampstets)

導(dǎo)入涂布在含Tc的平板上重組子轉(zhuǎn)化子(ampstetr)空載體轉(zhuǎn)化子(amprtetr)影印在含Ap的平板上空載體轉(zhuǎn)化子(amprtetr)因插入外源DNA而導(dǎo)致基因失活的現(xiàn)象稱之為插入失活效應(yīng)對比兩個平板上的菌落，凡在Tc平板上生長而在Ap平板上不能生長的菌落則是重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子克隆，挑選陽性克隆，分離出重組質(zhì)粒。第六十二頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四克隆子篩選與鑒定B利用乳糖操縱子lacZ’

基因篩選克隆子具有完整乳糖操縱子的菌體能翻譯β-半乳糖苷酶（Z）、透性酶（Y）和乙?；D(zhuǎn)移酶（A），當(dāng)培養(yǎng)基中含有X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）和IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）時，可產(chǎn)生藍色沉淀物，使菌落成藍色。當(dāng)目的基因插入后lacZ’

基因不能表達，因此，帶有目的基因的重組子菌落呈白色，而沒有轉(zhuǎn)入目的基因的菌落呈蘭色。第六十三頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四克隆子篩選與鑒定2克隆子的進一步鑒定用上述方法篩選的克隆子，難免得到一些假克隆子，為進一步鑒定克隆子的真假，可采用限制性內(nèi)切酶分析、分子雜交、PCR擴增和DNA測序、目的基因轉(zhuǎn)錄及翻譯產(chǎn)物檢測等方法。第六十四頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四第二節(jié)基因工程菌構(gòu)建策略

自1973年Jackson等人首次提出基因可以人工重組，并能在細菌中復(fù)制以來，基因工程作為一個新興的研究領(lǐng)域得到了迅速發(fā)展，取得了喜人的成績。因各種環(huán)境條件和生物因子的限制，細菌的進化是相當(dāng)緩慢的而且沒有一定的方向，因此通過基因工程促進細菌的遺傳進化以滿足生物修復(fù)工程的需要。第六十五頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四1.優(yōu)化污染物的降解途徑

（1）重組互補代謝途徑：

系列酶（不同菌共代謝）有機污染物小分子化合物缺點：降解速率慢，因為污染物代謝產(chǎn)物在不同降解菌間的跨膜轉(zhuǎn)運是耗能過程，對細菌來說這是一種不經(jīng)濟的營養(yǎng)方式。另外，某些污染物的中間代謝產(chǎn)物可能具有毒性或?qū)Υx活性有抑制作用，如不能被迅速代謝利用，積累后將對整個代謝過程產(chǎn)生抑制作用。因此對這些細菌的降解基因進行重組，將分屬于不同細菌個體中的污染物代謝途徑組合起來來構(gòu)建具有特殊降解功能的超級降解菌，可以有效的提高微生物降解能力，從而提高生物修復(fù)效率。

第六十六頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四抑制劑

脫氯

ohb

脫鹵素基因聯(lián)苯雙加氧酶（bphA）氯代苯甲酸(CBA)多氯聯(lián)苯（PCBs）O2

異戊二烯酸重組體Bph:ohbCO2+H2O

進一步降解第六十七頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四硝基芳香化合物，如炸藥，即2，4，6-三硝基甲苯（簡稱TNT）

引入甲苯完整降解質(zhì)粒pWWO-Km

假單胞菌甲苯TNT氨基甲苯硝基甲苯

構(gòu)建微生物可以利用TNT為唯一碳源和氮源生長

第六十八頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四1.優(yōu)化污染物的降解途徑

（2）改變污染物代謝產(chǎn)物流向污染物降解過程中由于抑制性中間代謝產(chǎn)物的生成或中間產(chǎn)物進入截止式代謝產(chǎn)物途徑而抑制了污染物降解酶活性，使得污染物降解效率不高或降解不徹底。因此可以考慮將細菌對污染物的中間代謝產(chǎn)物流向進行某些改進，使抑制性中間產(chǎn)物不產(chǎn)生或盡量轉(zhuǎn)化，從而提高污染物降解速率。

第六十九頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四第七十頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期四1.優(yōu)化污染物的降解途徑（3）拓寬酶的專一性許多有毒有害有機物，如芳香烴、多氯聯(lián)苯、氯化烴等，其代謝反應(yīng)由多組分氧化酶催化進行。這些關(guān)鍵酶的底物專一性阻礙了有機物代謝，如多氯聯(lián)苯異構(gòu)體等，如何拓寬這些酶的底物范圍，是研究的方向。多氯聯(lián)苯—聯(lián)苯降解菌：不能氧化甲苯甲苯—苯降解菌：不能利用聯(lián)苯為碳源生長兩者雙氧合酶編碼基因的遺傳結(jié)構(gòu)、大小和同源性相似，將兩種酶不同組分的編碼基因“混