實驗七植物細(xì)胞骨架的觀察

實驗七植物細(xì)胞骨架的觀察第1頁/共17頁

植物細(xì)胞骨架微絲的光學(xué)顯微觀察細(xì)胞生物學(xué)實驗七第2頁/共17頁實驗?zāi)康膶嶒炘韺嶒炗闷穼嶒灧椒▽嶒瀳蟾嫦乱淮螌嶒烆A(yù)告第3頁/共17頁實驗?zāi)康恼莆湛捡R斯亮藍(lán)(coomassiebrilliantblue)R250染色植物細(xì)胞內(nèi)微絲的方法通過對洋蔥內(nèi)皮細(xì)胞的處理，掌握植物細(xì)胞內(nèi)微絲的顯微形態(tài)第4頁/共17頁實驗原理細(xì)胞骨架(cytoskeleton)是指真核細(xì)胞中縱橫交錯的蛋白纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，廣義的細(xì)胞骨架包括細(xì)胞核骨架，細(xì)胞質(zhì)骨架，細(xì)胞膜骨架和細(xì)胞外基質(zhì)。狹義的細(xì)胞骨架是指細(xì)胞質(zhì)骨架。細(xì)胞質(zhì)骨架按蛋白質(zhì)纖維的直徑大小、組成成分和組裝結(jié)構(gòu)的不同可分為微管（24nm）、微絲（7nm）和中間纖維(10nm)。它們對細(xì)胞形態(tài)的維持、細(xì)胞的生長、運(yùn)動、分裂、分化和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)绕鹬匾饔?。?頁/共17頁考馬斯亮藍(lán)R250是一種普通的蛋白質(zhì)染料，它可以使各種細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)著色，并非特異地顯示微絲，但是由于有些細(xì)胞骨架纖維在該實驗條件下不夠穩(wěn)定，例如微管；還有些類型的纖維太細(xì)，在光學(xué)顯微鏡下無法分辨，因此我們看到的主要是微絲組成的張力纖維。張力纖維形態(tài)長而直，常常與細(xì)胞的長軸平行并貫穿細(xì)胞全長。染色時用的M-緩沖液，其中咪唑是緩沖劑，EGTA和EDTA螯合Ca2+離子，溶液中并提供Mg2+離子，在此低鈣條件下，骨架纖維保持聚合狀態(tài)并且較為舒張。

Mg2+

高濃度Na+K+誘導(dǎo)

G-actinF-actin

含ATPCa2+低Na+K+第6頁/共17頁植物細(xì)胞用適當(dāng)濃度的TritonX—100處理后，可破壞和溶解質(zhì)膜結(jié)構(gòu)中及細(xì)胞內(nèi)許多蛋白質(zhì)，但細(xì)胞骨架系統(tǒng)的蛋白質(zhì)卻保護(hù)完好。細(xì)胞骨架蛋白經(jīng)考馬斯亮藍(lán)著色后，可使細(xì)胞骨架蛋白著色，而胞質(zhì)背景著色弱，可以在光學(xué)顯微鏡下觀察微絲的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。實驗原理第7頁/共17頁ExpressionpatternofaGFPfusiontotheperoxisomalmultifunctionalprotein(MFP)inonionepidermalcells.microtubulebindingactivityofMFPinthecytosolThepunctatestructuresrepresentperoxisomes,andthefilamentousstructuresaremicrotubules.Insetisaconfocalimage(usingOpenlabsoftware)showingasmallerregionofaGFP-MFPexpressingcell.Bars,20μmand3μm(inset).ModifiedfromBMCCellBiology2005,6:40.第8頁/共17頁F-actincytoskeletonina2Dculturedbovinearticularchondrocyte,labelledusingphalloidin-FITCcytoskeleton-amicroscopicnetworkofactinfilaments,intermediatefilamentsandmicrotubulesinthecytoplasmofmanylivingcellsthatgivesthecellshapeandcoherenceNature408,423(2000)第9頁/共17頁實驗用品1.材料：新鮮洋蔥鱗莖(葉)的內(nèi)表皮

第10頁/共17頁2.試劑0.01Mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS）

M－緩沖液1％TritonX-100（用M-緩沖液配）

0.2%考馬斯亮藍(lán)R250

3%戊二醛-PB溶液（用0.2mol/L磷酸鹽緩沖液配制）

3.器材

顯微鏡，玻璃滴管，載玻片，蓋玻片，濾紙，鑷子第11頁/共17頁實驗步驟取洋蔥內(nèi)皮1cm2左右，放入盛PBS緩沖液中，使其下沉;濕潤后，吸去PBS,加2mlTritonX-100處理15min;除去TritonX-100，用M緩沖液洗3次，每次約5min；加3%戊二醛-PB溶液，固定15min

加PBS洗滌3次，吸干加0.2%考馬斯亮藍(lán)R250，染色15min用蒸餾水洗數(shù)遍，降低背景。顯微鏡觀察并繪圖第12頁/共17頁實驗結(jié)果將制好的片子置于光鏡的低倍鏡下，可見到規(guī)則排列的長方形洋蔥表皮細(xì)胞輪廓，細(xì)胞內(nèi)可見到被染成蘭色的的分枝狀結(jié)構(gòu)，粗細(xì)不等，這便是細(xì)胞骨架。轉(zhuǎn)高倍鏡繼續(xù)觀察，調(diào)節(jié)細(xì)螺旋可見到細(xì)胞骨架的立體結(jié)構(gòu)。第13頁/共17頁10X第14頁/共17頁4