實(shí)驗(yàn)二染色體組型分析

實(shí)驗(yàn)二染色體組型分析第1頁(yè)/共42頁(yè)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)之——

染色體組型分析廈門(mén)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院第2頁(yè)/共42頁(yè)

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆杖旧w組型分析的各種數(shù)據(jù)指標(biāo)學(xué)習(xí)染色體組型分析的基本方法第3頁(yè)/共42頁(yè)實(shí)驗(yàn)原理定義：染色體組型又稱核型，是指將動(dòng)物、植物、真菌等的某一個(gè)體或某一分類群（亞種、種、屬等）的體細(xì)胞內(nèi)的整套染色體，按它們相對(duì)恒定的特征排列起來(lái)的圖像。核型模式圖是指將一個(gè)染色體組的全部染色體逐個(gè)按其特征繪制下來(lái)，再按長(zhǎng)短、形態(tài)等特征排列起來(lái)的圖像。第4頁(yè)/共42頁(yè)發(fā)展歷史1920年提出三項(xiàng)技術(shù)促進(jìn)：低滲處理秋水仙素應(yīng)用植物凝激素應(yīng)用染色體分帶技術(shù)：Q帶、G帶、C帶、R帶、T帶、N帶等FISH技術(shù)第5頁(yè)/共42頁(yè)染色體的特征數(shù)目（2n=？）長(zhǎng)度（絕對(duì)長(zhǎng)度、相對(duì)長(zhǎng)度）著絲粒位置（M\SM\ST\T）隨體與次溢痕的數(shù)目、大小和位置帶型分析第6頁(yè)/共42頁(yè)各類常用實(shí)驗(yàn)生物和人細(xì)胞DNA含量與染色體數(shù)目物

種染色體數(shù)目DNA含量（bp）MS2λ噬菌體T4枯草桿菌大腸桿菌啤酒酵母果蠅海膽蛙小雞小鼠玉米人111113485226784020463×1035×1045×1052×1064.2×1061.4×1071.4×1081.6×1094.5×1092.1×1094.7×1093×1093.2×109第7頁(yè)/共42頁(yè)染色體超螺旋第8頁(yè)/共42頁(yè)染色體的大小第9頁(yè)/共42頁(yè)燈刷染色體（光鏡觀察）第10頁(yè)/共42頁(yè)染色體觀察及核型分析第11頁(yè)/共42頁(yè)應(yīng)用意義染色體組型分析——染色體水平上的表型可確定物種的特征，確定種屬親緣關(guān)系分析生物物種的變異和進(jìn)化過(guò)程識(shí)別單條染色體、基因定位臨床應(yīng)用（染色體疾病、產(chǎn)前診斷）第12頁(yè)/共42頁(yè)人類23對(duì)染色體第13頁(yè)/共42頁(yè)組型分析實(shí)驗(yàn)方法染色體數(shù)目確定染色體形態(tài)特征：長(zhǎng)度：絕對(duì)、相對(duì)相對(duì)長(zhǎng)度=每條染色體的長(zhǎng)度/全套染色體長(zhǎng)度臂比=長(zhǎng)臂/短臂著絲點(diǎn)指數(shù)=短臂/（長(zhǎng)+短臂）隨體的有無(wú)第14頁(yè)/共42頁(yè)分組排隊(duì)原則著絲粒類型相同，相對(duì)長(zhǎng)度相近的分一組同一組的按染色體長(zhǎng)短順序配對(duì)排列各指數(shù)相同的染色體配為一對(duì)可根據(jù)隨體的有無(wú)進(jìn)行配對(duì)將染色體按長(zhǎng)短排隊(duì)，短臂向上第15頁(yè)/共42頁(yè)實(shí)驗(yàn)用品毫米尺、剪刀、膠水、計(jì)算器、白紙人染色體放大照片第16頁(yè)/共42頁(yè)第17頁(yè)/共42頁(yè)染色體編號(hào)(人X染色體)記述一特定帶時(shí)，需要寫(xiě)明4個(gè)內(nèi)容：染色體號(hào)，長(zhǎng)短臂，區(qū)的號(hào)序和帶的號(hào)序。這些內(nèi)容按順序?qū)?，不用間隔或加標(biāo)點(diǎn)。如果某一帶被再細(xì)分，在原帶號(hào)數(shù)后加一小數(shù)點(diǎn)，編號(hào)原則仍按從著絲粒往臂端序貫編號(hào)。如1p31.2代表一號(hào)染色體短臂3區(qū)1帶第2亞帶第18頁(yè)/共42頁(yè)核型描述首先列出染色體總數(shù)，然后是性染色體組成，接著列出異常的染色體數(shù)目或形態(tài)。下列統(tǒng)一的命名符號(hào)：A-G染色體組的名稱1-22染色體編號(hào)X,Y性染色體del缺失der結(jié)構(gòu)重排的染色體dup重復(fù)inv倒位t易位+/-在染色體符號(hào)前表示染色體增加或減少，在染色體符號(hào)后表示染色體多出或缺少一部分第19頁(yè)/共42頁(yè)實(shí)驗(yàn)步驟計(jì)數(shù)，沿邊緣剪下染色體，編號(hào)初步目測(cè)配對(duì)，分組測(cè)量長(zhǎng)度，計(jì)算相對(duì)長(zhǎng)度、著絲粒指數(shù)、臂比，相同的染色體間配對(duì)將配對(duì)好的染色體排列并粘貼在紙上，每一組下面畫(huà)一橫線，在兩端注明起止號(hào)，并在橫線下的中部寫(xiě)明A-G組號(hào)，染色體從大到小編為1-22號(hào)，性染色體單獨(dú)列為一組第20頁(yè)/共42頁(yè)思考題請(qǐng)描述核型：

45，XY,der(14;21)(q21;q14)47，XY,+21第21頁(yè)/共42頁(yè)生命科學(xué)中的“釣魚(yú)”（FISH）技術(shù)

遺傳及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)新技術(shù)新方法系列講座第22頁(yè)/共42頁(yè)發(fā)展歷史熒光原位雜交技術(shù)(fluorescenceinsituHybridization,FISH)問(wèn)世于70年代后期,其曾多用于染色體異常的研究,近年來(lái)隨著FISH所應(yīng)用的探針?lè)N類的不斷增多,特別是全COSMID探針及染色體原位抑制雜交技術(shù)的出現(xiàn),使FISH技術(shù)不僅在細(xì)胞遺傳學(xué)方面,而且還廣泛應(yīng)用于腫瘤學(xué)研究,如診斷、基因定位等第23頁(yè)/共42頁(yè)放射性同位素原位雜交技術(shù)原有的放射性同位素原位雜交技術(shù)存在著較多缺點(diǎn)，諸如每次檢驗(yàn)需重新標(biāo)記、已標(biāo)記的探針表現(xiàn)出明顯的不穩(wěn)定性、需要較長(zhǎng)時(shí)間的曝光時(shí)間和對(duì)環(huán)境的污染等。在觀察結(jié)果時(shí)，需要較多的分裂相進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。此外，由于放射性銀粒和染色體聚集的不同平面，可能引起計(jì)數(shù)上的誤差等。第24頁(yè)/共42頁(yè)FISH的基本原理很簡(jiǎn)單,就是標(biāo)記了熒光的單鏈DNA(探針)和與其互補(bǔ)的DNA(玻片上的標(biāo)本)退火雜交,通過(guò)觀察熒光信號(hào)在染色體上的位置來(lái)反映相應(yīng)基因的情況.第25頁(yè)/共42頁(yè)熒光原位雜交（FISH）

FISH技術(shù)是常規(guī)染色體分析的輔助手段。它是用熒光素標(biāo)記特異探針，與染色體做雜交后，根據(jù)特異的熒光信號(hào)來(lái)判斷結(jié)果。它可用于標(biāo)記染色體的識(shí)別、特異融合基因的檢測(cè)、新基因定位，用全染色體涂抹探針識(shí)別復(fù)雜的染色體結(jié)構(gòu)異常。第26頁(yè)/共42頁(yè)FISH具有其不可比擬的優(yōu)點(diǎn)：1.操作簡(jiǎn)便，探針標(biāo)記后穩(wěn)定，一次標(biāo)記后可使用二年。2.方法敏感，能迅速得到結(jié)果。3.在同一標(biāo)本上，可同時(shí)幾種不同探針。4.不僅可用于分裂細(xì)胞染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)變化的研究，而且還可用于靜止期細(xì)胞的染色體數(shù)量及基因改變的研究。第27頁(yè)/共42頁(yè)FISH的技術(shù)特點(diǎn)：FISH選用的標(biāo)本可以是分裂期細(xì)胞染色體也可以是間期細(xì)胞。間期細(xì)胞可以是冰凍切片，也可以是細(xì)胞滴片或印片。生物素（Biotin）地高辛（digoxigenin）,

dinitrophenyl(DNP)，aminoacetyl

fluorene(AAF)均可用于探針標(biāo)記。第28頁(yè)/共42頁(yè)直接標(biāo)記和間接標(biāo)記用生物素或地高辛標(biāo)記稱為間接標(biāo)記,雜交后需要通過(guò)免疫熒光抗體檢測(cè)方能看到熒光信號(hào),因而

步驟較多,操作麻煩,其優(yōu)點(diǎn)是在信號(hào)較弱或較小時(shí)可經(jīng)抗原抗體反應(yīng)擴(kuò)大直接用熒光素標(biāo)記DNA的方法稱為直接標(biāo)記.由于直接標(biāo)記的探針雜交后可馬上觀察到熒光信號(hào),省去了煩瑣的免疫熒光反應(yīng),不再需要購(gòu)買(mǎi)熒光抗

體,也由于近年來(lái)熒光素的亮度和抗淬滅性的不斷改進(jìn)和提高,直接標(biāo)記的熒光探針越來(lái)越成為首選,并采用多種不同顏色的熒光,方便在同一標(biāo)本上同時(shí)檢測(cè)多種異常.其熒光強(qiáng)度

和信號(hào)大小都易于在普通熒光顯微鏡下觀察,使FISH過(guò)程變得簡(jiǎn)便而易于操作.第29頁(yè)/共42頁(yè)探針標(biāo)記在已知探針DNA結(jié)構(gòu)及序列情況下可采用PCR或RNA逆轉(zhuǎn)錄法標(biāo)探針。通常用Biotin標(biāo)記的探針應(yīng)大于100bp，較小的探針可采用PCR技術(shù)來(lái)標(biāo)記。近年來(lái)，VYSIS公司成功的生產(chǎn)了大片段的DNA探針（100─400kb）。由于探針較長(zhǎng)，故可將熒光物質(zhì)直接標(biāo)記在核苷酸上，這不僅使雜交過(guò)程進(jìn)一步簡(jiǎn)化面且雜交信號(hào)增強(qiáng)。第30頁(yè)/共42頁(yè)染色體著絲粒熒光第31頁(yè)/共42頁(yè)染色體端粒熒光第32頁(yè)/共42頁(yè)多色信號(hào)采集常規(guī)的熒光顯微鏡的熒光顯微鏡的照像，彩色膠片不易多次曝光，限制了這種聯(lián)合標(biāo)記探針的應(yīng)用，使用CCD照像系統(tǒng)，先分別多次攝取灰色的影像關(guān)儲(chǔ)存在計(jì)算機(jī)內(nèi)，而后冠以人為的顏色，運(yùn)用軟件系統(tǒng)融合各次得到的影像，最終形成一個(gè)復(fù)合的多顏色的圖像。第33頁(yè)/共42頁(yè)FISH和G顯帶技術(shù)結(jié)合對(duì)已做過(guò)G顯帶的染色體片子用75%的乙醇或甲醇褪色后，可使FISH更清晰的辨認(rèn)各條染色體及染色體結(jié)構(gòu)異常（包括某些復(fù)雜的易位，插入，倒位等）,不僅可以用新近G帶外理過(guò)的片子，而且還可用陳舊的G帶片子。因此，F(xiàn)ISH技術(shù)可成功的幫助細(xì)胞遺傳學(xué)家做出回顧性分析。第34頁(yè)/共42頁(yè)FISH技術(shù)和其他技術(shù)的結(jié)合FISH技術(shù)和RFLP結(jié)合，可以精確地描述原屬于染色本長(zhǎng)短臂等結(jié)構(gòu)改變和染色體核形或復(fù)雜片段的性質(zhì)。FISH和細(xì)胞免疫化學(xué)技術(shù)結(jié)合，可以同時(shí)用多種顏色反應(yīng)不同的核苷酸鏈和蛋白質(zhì)，這樣可以在單個(gè)細(xì)胞內(nèi)同時(shí)找到基因的位點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄和翻譯和產(chǎn)物，有助了解核苷酸結(jié)構(gòu)功能以及表達(dá)產(chǎn)物之間關(guān)系的研究。第35頁(yè)/共42頁(yè)多色熒光原位雜交（M-FISH）M-FISH相當(dāng)于在一次雜交中給每一條染色體都涂上了不同的顏色,因而很容易就可看到多條染色體間的復(fù)雜易位情況和確定標(biāo)志染色體的來(lái)源.M-FISH是1996年才建立的一種新技術(shù)。使用5種熒光染料按比例標(biāo)記探針，雜交后形成24條染色體上24種特異的熒光色彩以供核型分析。它為人們提供了既豐富又完善的細(xì)胞遺傳學(xué)信息，包括確定標(biāo)記染色體的來(lái)源、檢測(cè)微小的染色體易位和檢測(cè)復(fù)雜的染色體易位。第36頁(yè)/共42頁(yè)多色熒光染色體顯帶（Rx-FISH）

能否讓每條區(qū)帶也雜交上不同的顏色呢?這一想法導(dǎo)致了彩色核型分析(Rx-FISH)的誕生.Rx-FISH技術(shù)是采用多種熒光素標(biāo)記與人類DNA有高度同原性猿的DNA作為探針，雜交后使人類的24條染色體上呈現(xiàn)特異的帶型。這樣便可根據(jù)彩色的熒光條帶進(jìn)行核型分析。第37頁(yè)/共42頁(yè)比較基因組雜交（CGH）CGH不需要制備患者的染色體標(biāo)本,只需采用腫瘤患者的基因組DNA和正常人的基因組DNA作為探針，與正常人的中期染色體分裂相進(jìn)行雜交。比較兩種探針?biāo)鶚?biāo)的熒光信號(hào)的強(qiáng)度比率來(lái)判斷腫瘤患者的DNA是否存在缺失、增加或復(fù)制。因而CGH最適合于檢測(cè)實(shí)體瘤,淋巴瘤等不易得到高質(zhì)量染色體標(biāo)本的疾病.CGH另一無(wú)法替代的優(yōu)點(diǎn)是,它可在一次雜交中檢測(cè)整個(gè)基因遺傳物質(zhì)的增加或減少,但精度有限,對(duì)微小的擴(kuò)增或缺失檢測(cè)不出,僅適用于對(duì)整個(gè)基因組進(jìn)行篩查.CGH也無(wú)法發(fā)現(xiàn)平衡染色體易位.第38頁(yè)/共42頁(yè)FISH的臨床運(yùn)用在細(xì)胞遺傳學(xué)檢查中，重復(fù)序列的探針應(yīng)用最多，它們是α衛(wèi)星DNA、β衛(wèi)星DNA和經(jīng)典衛(wèi)星DNA探針。α衛(wèi)星DNA探針主要檢測(cè)人染色體的著絲粒。β衛(wèi)星DNA位于頂端著絲粒染色體及染色體的異染色質(zhì)周?chē)＝?jīng)典衛(wèi)星DNA有著AATGG短片段，位于染色體1、9、15、16和Y染色體長(zhǎng)臂異染色質(zhì)周?chē)髢商幪结槼丝捎糜谌旧w數(shù)目檢查外，還可用于上述部位精細(xì)改變的檢查。第39頁(yè)/共42頁(yè)FISH的臨床運(yùn)用白血病檢測(cè)中常用的FISH探針有單一序列探針,著絲粒探針,整條染色體探針,常用方法有單標(biāo)記FISH,雙

標(biāo)記FISH,比較基因組雜交(CGH),M-FISH和Rx-FISH等.各種FISH探針及方法均在白血病的診斷,治療監(jiān)測(cè),預(yù)后估計(jì)和微小殘留病檢測(cè)中起重要作用

第40頁(yè)/共42頁(yè)應(yīng)用實(shí)例常規(guī)的染色體核型分析已廣泛用于各類急、慢性白血病患者的骨髓染色體檢查。如M3型的t（15；17）、M2b型的t（8；21）、CML和部分ALL的Ph染色體等。

FISH技術(shù)已成功地用于t（1