實驗二馬立克氏病瓊脂擴散實驗

實驗二馬立克氏病瓊脂擴散實驗第1頁/共20頁

雞馬立克氏病是由雞馬立克氏病病毒（MDV）引起的雞的一種腫瘤性傳染病。臨床上以消瘦、麻痹、皮膚和內(nèi)臟出現(xiàn)腫瘤為主要特征?？稍斐蓢乐氐慕?jīng)濟損失，是世界養(yǎng)雞業(yè)的主要疾病之一。

雞馬立克氏病引起的劈叉姿勢第2頁/共20頁

流行病學臨床癥狀病理組織學檢查病毒分離鑒定血清學試驗:①瓊脂擴散實驗(OIE推薦的替代試驗方法)馬立克氏病診斷主要根據(jù)②酶聯(lián)免疫吸附實驗AGP可用于20日齡以上馬立克氏病雞羽髓抗原檢測和1月齡以上雞血清抗體檢測。

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目的要求

了解瓊脂擴散試驗進行疾病診斷的操作和結(jié)果判定方法

儀器與材料器材：瓊脂打孔器、微量移液器或帶膠乳頭滴管、平皿等。試劑：馬立克氏病標準抗原、標準陽性血清和標準陰性血清。

實驗類型單向單擴散、單向雙擴散、雙向單擴散、雙向雙擴散

實驗?zāi)康囊?、類型、儀器與材料第4頁/共20頁

利用可溶性抗原和抗體在半固體凝膠中進行相向擴散反應(yīng)，當抗原抗體分子相遇并達到適當比例時，就會互相結(jié)合、凝集，在兩孔之間比例最合適的位置上出現(xiàn)白色沉淀帶，從而判定相應(yīng)的抗體和抗原?？捎糜?0日齡以上馬立克氏病雞羽髓抗原檢測和1月齡以上雞血清抗體檢測。

實驗原理第5頁/共20頁

實驗原理瓊脂糖的疏散網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有利于大分子的自由遷移；合適比例的抗原抗體結(jié)合后聚集形成沉淀；沉淀的產(chǎn)生阻止抗原抗體復(fù)合物的自由運動；沉淀帶一經(jīng)形成，就像一道特異性的屏障一樣，繼續(xù)擴散而來的相同的抗原抗體，只能是沉淀帶加濃加厚，而不能再向外擴散，但對其他抗原抗體系統(tǒng)則無屏障作用。第6頁/共20頁沉淀線的特征與位置：

1抗原、抗體的特異性和濃度

2抗原、抗體分子的大小

3擴散率

實驗原理第7頁/共20頁a.如抗原抗體的濃度基本平衡時，此沉淀帶的位置主要決定于兩者的擴散系數(shù)。b.如果抗原過多，則沉淀帶向抗體偏移，反之亦然。

實驗原理第8頁/共20頁

實驗原理抗原分子量>抗體分子量抗原分子量=抗體分子量抗原分子量<抗體分子量c.第9頁/共20頁1%瓊脂粉0.01MPBS

封底1／萬硫柳汞水浴加熱融化實驗步驟瓊脂平板制備第10頁/共20頁

雞群馬立克氏病感染情況的監(jiān)測通常采用瓊脂擴散試驗，檢測對象包括：血清中馬立克氏病病毒特異抗體或感染雞羽髓中馬立克氏病病毒抗原。其操作方法如下：1．瓊脂糖平板制備用0.01MpH7.4的PBS配制1％瓊脂糖溶液，水浴加溫充分溶化后，加入培養(yǎng)皿，制成厚度約2～3mm厚的瓊脂糖凝膠板；置于室溫下冷卻凝固后，用7孔（梅花孔）打孔器準確打孔，加熱封底。

實驗步驟第11頁/共20頁2．檢測血清抗體時，中央孔內(nèi)滴加馬立克氏病病毒標準瓊擴抗原，周邊孔滴加待檢血清，但至少一孔加陽性血清，抗原和血清的加入量以加滿而不溢出為度。樣品加畢后，將瓊脂平皿加蓋后平放于加蓋的濕盒內(nèi)，37℃溫箱中孵育8～24h，觀察并記錄結(jié)果。測定抗體效價時可倍比稀釋血清，以出現(xiàn)沉淀帶的血清最大稀釋度為抗體效價。

實驗步驟第12頁/共20頁3．檢測抗原時，中央孔加馬立克氏病標準陽性血清，周邊1、4孔加馬立克氏病標準瓊擴抗原，周邊2、3、5、6孔加待檢羽髓浸液，即在試管內(nèi)加入1～2滴PBS然后將羽髓在其中擠壓而成。加樣后將瓊脂平皿置濕盒內(nèi)，于37℃溫箱孵育，8～24h內(nèi)觀察結(jié)果。

實驗步驟第13頁/共20頁1、切勿劇烈振蕩融化后的瓊脂糖，防止氣泡的出現(xiàn)。2、反應(yīng)時間要適宜，時間過長，沉淀線可解離而導(dǎo)致假陰性、不出現(xiàn)或不清楚。3、加樣時，注意不要產(chǎn)生氣泡，以加滿為度。4、每加完不同的樣后要更換槍頭，以免造成污染。

注意事項

第14頁/共20頁實驗步驟抗原檢測Ab+Ag+32Ag+65檢測羽髓抗原2，3，5，6孔分別加入倍比稀釋的待檢羽髓浸液Ag+432165檢測待檢血清1~5孔分別加入倍比稀釋的待測效價的血清，6孔加PBS抗體檢測第15頁/共20頁

當被檢樣品孔與中心孔之間形成清晰的沉淀線，并與周邊已知抗原孔的沉淀線互相融合時判為陽性；不出現(xiàn)沉淀線者判為陰性

結(jié)果判定第16頁/共20頁

已知抗原與陽性血清之間所產(chǎn)生的沉淀線末端彎向被檢樣品孔內(nèi)側(cè)時，則該被檢樣品判為弱陽性。

結(jié)果判定Ag+Ab+待檢血清第17頁/共20頁

被檢材料可能出現(xiàn)兩條以上沉淀線，其中一條與已知抗原和陽性血清的沉淀線融合者判為陽性。當抗原存在多種成分時，將呈現(xiàn)多條沉淀線以至交叉反應(yīng)線，因此可用來檢查抗原和免疫血清的特異性、純度或濃度，比較抗