實(shí)驗(yàn)五ELISA法檢查乙肝表面抗原

實(shí)驗(yàn)五ELISA法檢查乙肝表面抗原第1頁/共21頁實(shí)驗(yàn)五：ELISA法檢測(cè)乙肝表面抗原（HBsAg）第2頁/共21頁免疫標(biāo)記技術(shù)定義：

將抗原-抗體反應(yīng)與標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，用放射性同位素、酶或熒光素標(biāo)記的已知抗體或抗原，通過檢測(cè)標(biāo)記物，間接測(cè)定未知的抗原或抗體。分類：放射免疫測(cè)定法：131I，32P免疫熒光技術(shù)：FITC，PE免疫酶測(cè)定法：HRP，AP第3頁/共21頁

用標(biāo)記物標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)借以提高免疫學(xué)診斷的敏感性熒光素：異硫氰酸熒光素（黃綠色熒光）、藻紅蛋白、羅丹明（紅色熒光）放射性同位素：125I、131I酶：辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶免疫熒光檢測(cè)法（IFA）放射免疫檢測(cè)法（RIA）酶免疫檢測(cè)法（EIA）免疫標(biāo)記技術(shù)第4頁/共21頁免疫酶測(cè)定法

(EnzymeImmunoAssay,EIA)用酶標(biāo)記的抗原或抗體進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。

辣根過氧化物酶(HRP)，堿性磷酸酶(AP)特點(diǎn)：高度特異性：保持抗原抗體反應(yīng)的特異性高靈敏度：酶催化底物顯色的高效性，pg水平微量檢測(cè)定性定量檢測(cè)：反應(yīng)液顏色深淺或光密度值分類：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)：可溶性抗原或抗體酶免疫組化法：組織中或細(xì)胞表面的抗原。第5頁/共21頁酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

(Enzyme-LinkedImmunoSorbent

Assay,ELISA)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay）,簡(jiǎn)稱ELISA，它是實(shí)驗(yàn)室最常用的檢測(cè)方法，用酶標(biāo)記抗原或抗體檢測(cè)液體（血液、細(xì)胞液）中未知抗體或抗原。

ELISA具有準(zhǔn)確性高、檢測(cè)時(shí)間短、價(jià)格低廉、判斷結(jié)果有客觀標(biāo)準(zhǔn)、結(jié)果便于記錄和保存等優(yōu)點(diǎn)，適合于大批標(biāo)本的檢測(cè)，廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)、醫(yī)療檢測(cè)以及免疫實(shí)驗(yàn)分析等領(lǐng)域。1.簡(jiǎn)介第6頁/共21頁(1).抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，并保持其免疫學(xué)活性。例如：蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與聚苯乙烯表面的疏水基團(tuán)能產(chǎn)生互作用而吸附。(2).抗原或抗體可通過共價(jià)鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性；(3).酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來判定是否有免疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的，由此進(jìn)行定性或定量分析。2、ELISA基本原理第7頁/共21頁3、ELISA基本的實(shí)驗(yàn)過程包被：將已知抗原或抗體通過物理吸附到固相載體表面，使抗原或抗體固相化；抗原抗體反應(yīng)：先后加入被檢標(biāo)本和酶結(jié)合物，使之與固相抗原或抗體發(fā)生免疫反應(yīng)而被結(jié)合固定；酶促反應(yīng)：在反應(yīng)體系中加入酶作用的底物，使發(fā)生酶促反應(yīng)而顯色。第8頁/共21頁

ELISA的試劑ELISA中有3個(gè)是必要的試劑：免疫吸附劑、標(biāo)記物和顯色劑。（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（聚苯乙烯板：具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性）（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）；（3）酶作用的底物（顯色劑）；（4）陰性對(duì)照品和陽性對(duì)照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品；（5）樣品及標(biāo)準(zhǔn)本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）酶反應(yīng)終止液第9頁/共21頁ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體，根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的情況以及檢測(cè)的具體條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法，主要類型有雙抗體夾心法、間接法、競(jìng)爭(zhēng)法、捕獲法等。4、ELISA類別第10頁/共21頁雙抗體夾心法第11頁/共21頁間接法第12頁/共21頁5、操作步驟（以雙抗體夾心法ELISA為例）：用抗體包被固相載體加入抗原Sample(二價(jià)以上)，溫育加入酶標(biāo)抗體，溫育加入底物，顯色清洗清洗清洗終止反應(yīng)，底物顯色深淺與待檢抗原量成正比。利用已知濃度的抗原制成標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋為梯度濃度，對(duì)其最終OD值與濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，那么樣品的濃度可以根據(jù)最終的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出。第13頁/共21頁實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：

雙抗體夾心法測(cè)定乙肝表面抗原（HBsAg）——定性定量檢測(cè)第14頁/共21頁1、掌握ELISA（雙抗體夾心法）的原理2、熟悉ELISA實(shí)驗(yàn)操作方法，并了解其應(yīng)用實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡?5頁/共21頁實(shí)驗(yàn)材料HBsAg酶聯(lián)免疫分析試劑盒HBsAg陽性品，陰性對(duì)照品移液槍，槍頭濕盒酶標(biāo)板，酶標(biāo)儀一次性手套記號(hào)筆計(jì)時(shí)器第16頁/共21頁實(shí)驗(yàn)步驟第17頁/共21頁結(jié)果判定定性測(cè)定定性測(cè)定的結(jié)果判斷作出“有”或“無”的回答，分別用“陽性”、“陰性”表示。在這種半定量測(cè)定中，將標(biāo)本作一系列稀釋后進(jìn)行試驗(yàn)，呈陽性反應(yīng)的最高稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的強(qiáng)弱，這比觀察不稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強(qiáng)陽性、弱陽性更具定量意義。待測(cè)孔（P）與對(duì)照孔（N）的比值（P：N）大于1.5或2者為陽性，N為陰性對(duì)照孔。定量測(cè)定：酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長下的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品抗原的濃度。第18頁/共21頁預(yù)期結(jié)果陽性：顯色為黃色陰性：無色1234陰性陰性陽性陽性第19頁/共21頁ELISA注意事項(xiàng)加樣應(yīng)加在板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，避免產(chǎn)生氣泡并迅速完成；一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多于兩塊板同時(shí)測(cè)定。洗滌必須徹底，防止產(chǎn)生假陽性；溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃等。37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度