生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)-酵母RNA的分離、組分鑒定及含量分析

酵母RNA的分離、組分鑒定及含量測(cè)定編輯ppt1、掌握稀堿法分離酵母RNA的原理與操作過(guò)程。2、了解RNA的組分并掌握定性鑒定的具體方法。3、學(xué)習(xí)紫外分光光度法測(cè)定核酸含量的原理和操作方法。[實(shí)驗(yàn)?zāi)康腯編輯ppt為何選用酵母為材料提取RNA?酵母核酸中主要是RNA(2.67-10.0%），DNA含量很少，且菌體易收集，RNA易分離。從酵母中提取RNA常用方法稀堿法:利用稀堿使細(xì)胞壁溶解,時(shí)間短，但RNA易分解。濃鹽法:加熱條件下，利用高濃度鹽改變細(xì)胞膜的通透性，使RNA釋放出來(lái)，產(chǎn)品色澤較好。本實(shí)驗(yàn)用0.2%NaOH使酵母裂解，然后用酸中和，除去蛋白質(zhì)和菌體后的上清液用乙醇沉淀RNA。1.核酸分離[原理]編輯ppt酶促水解化學(xué)水解:

酸水解:堿基、核糖/脫氧核糖和磷酸

堿水解:RNA存在2′-OH，磷酸二酯鍵不穩(wěn)定，得單核苷酸核酸水解方法2.組分鑒定RNA是由核糖、嘌呤/嘧啶堿和磷酸組成，提取得的RNA中加10%硫酸煮沸即可得到這些組分的混合溶液（$），分別進(jìn)行定性鑒定，以證明提取物是否為核酸。[原理]編輯ppt磷酸與鉬酸銨試劑作用產(chǎn)生黃色的磷鉬酸銨沉淀(1mL$+1mL定磷試劑)：

(NH4)2MoO4+H3PO4→(NH4)3PO4·12MoO3↓(黃色)Mo6+

SnCL2Mo4+Mo(MoO4)2(蘭色)編輯ppt嘌呤堿與硝酸銀作用產(chǎn)生白色的嘌呤銀化合物(1mL$+過(guò)量氨水+1mL0.1M的AgNO3)。②核糖與地衣酚(orcin)試劑反應(yīng)呈鮮綠色(1mL$+1mLFeCl3+2mLorcin→水浴加熱)編輯ppt3.RNA含量測(cè)定核酸（DNA和RNA）堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫外區(qū)有較強(qiáng)吸收，吸收高峰在260nm波長(zhǎng)處，蛋白質(zhì)則在280nm波長(zhǎng)處。當(dāng)OD260＝1時(shí)，dsDNA濃度約為50μg/mlssDNA濃度約為37μg/mlRNA濃度約為40μg/ml純DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白質(zhì)、酚等污染）純RNA：1.7＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7時(shí)表明有蛋白質(zhì)或酚污染,可以增加酚/氯仿抽提）編輯pptOD260/OD280的比值用于估計(jì)核酸的純度,OD260/OD230估計(jì)去鹽的程度。

對(duì)于RNA純制品，其OD260/OD280≈2.0，OD260/OD230應(yīng)大于2。OD260/OD230<2說(shuō)明去鹽不充分,可以再次沉淀和70%乙醇洗滌。濃度計(jì)算：DNA樣品的濃度（μg/μl）:OD260×稀釋倍數(shù)×50/1000RNA樣品的濃度（μg/μl）：OD260×稀釋倍數(shù)×40/1000編輯ppt1．提取稱取干酵母粉0.4g，放入試管中，加入0.2%NaOH3mL，然后放入沸水浴中提取15min。2．分離用自來(lái)水冷卻,滴加1-4滴醋酸，調(diào)pH至6.0（沉淀蛋白質(zhì)），裝入離心管配平，3000r/min離心3min，（使提取液與菌體殘?jiān)蛛x）。3．抽提收集上清液，加等體積的氯仿，震蕩混勻，3500r/min離心5min。4．沉淀RNA收集上清，平均分裝入兩支離心管中，各加2倍體積無(wú)水乙醇，邊加邊攪拌，配平，3500r/min離心5min，得到RNA沉淀。棄去上清液（棄凈），一支離心管加5mL蒸餾水回溶，以備濃度測(cè)定；另一支離心管加入5mL10%的H2SO4,然后轉(zhuǎn)入50mL三角瓶中，待用。[操作步驟]注意配平、對(duì)稱放置離心管編輯ppt編輯ppt編輯ppt①RNA的酸解將裝有待測(cè)RNA的三角瓶，在電爐上加熱，至溶液透明為止，得到RNA的水解液，期間不?；蝿?dòng)，以使受熱均勻。[注意]RNA加熱酸解時(shí)，一定注意觀察，本步很容易加熱過(guò)度，使透明溶液變成黑褐色，而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。5.RNA的組分鑒定編輯ppt.檢驗(yàn)項(xiàng)目嘌呤核糖磷酸水解液1mL1mL1mL試劑NH3·H2O2mLAgNO31mL苔黑-FeCl31mL定磷試劑1mLSnCl21-2滴反應(yīng)條件不振動(dòng)觀察現(xiàn)象沸水浴約10min振蕩混勻室溫放置現(xiàn)象白色絮狀沉淀鮮綠色蘭色②組分鑒定加蒸餾水將水解液稀釋至5mL，然后按下表檢驗(yàn)項(xiàng)目所需的量分裝三支試管中，進(jìn)行組分鑒定。編輯ppt待測(cè)樣品適當(dāng)稀釋（如量取100μLRNA水溶液，加2900μL蒸餾水混勻），用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定其230nm、260nm和280nm的吸光度值?？筛鶕?jù)自己的樣品濃度調(diào)整稀釋倍數(shù)。黑體－透射調(diào)零蒸餾水－透射調(diào)100％吸收調(diào)零.6.RNA含量測(cè)定注意保護(hù)石英比色皿，輕拿輕放！編輯ppt配平：含液離心管與外套鐵管在一起兩組配平（先選兩個(gè)外套鐵管重量接近）對(duì)稱放于離心機(jī)的鐵套中。設(shè)置：閉蓋，選離心機(jī)設(shè)置鍵（“亮點(diǎn)”在轉(zhuǎn)速和時(shí)間的選擇上：可通過(guò)三角符號(hào)移位，然后再增減），設(shè)置數(shù)都完成后再按確認(rèn)鍵。啟動(dòng)：使“亮點(diǎn)”回到測(cè)定位置，按啟動(dòng)鍵。轉(zhuǎn)動(dòng)期間蓋子打不開(kāi)。若聲音很大異常。立即按停止鍵。離心機(jī)的使用編輯ppt通過(guò)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象說(shuō)明鑒定的結(jié)果，由結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明你的提取物是什么？計(jì)算RNA溶液濃度及酵母RNA得率，并判斷樣品純度。將組分定性鑒