地中海貧血實驗室檢測應(yīng)用及臨床課件

地中海貧血的實驗室檢測及臨床應(yīng)用深圳益生堂生物企業(yè)有限公司1精品課件主要內(nèi)容地中海貧血的遺傳學基礎(chǔ)地中海貧血的實驗室檢測及應(yīng)用少見型地中海貧血應(yīng)用范例技術(shù)服務(wù)簡介2精品課件紅細胞血液中數(shù)量最多的一種紅細胞運送氧氣功能紅細胞中含有血紅蛋白，因而使血液呈紅色。血紅蛋白合成不足或不能合成，引起貧血。3精品課件血紅蛋白成人血紅蛋白HbA由兩條α珠蛋白鏈和兩條β珠蛋白鏈組成，每條肽鏈有一個包含鐵原子的環(huán)狀血紅素4精品課件血紅蛋白病概念

由編碼珠蛋白的基因突變引起珠蛋白肽鏈異常所致的疾病統(tǒng)稱血紅蛋白病。分為兩種情況：1、異常血紅蛋白?。夯蛲蛔儗е轮榈鞍纂逆溄Y(jié)構(gòu)發(fā)生改變。（珠蛋白的一級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的血紅蛋白）

2、地中海貧血：基因突變導致珠蛋白肽鏈合成量減少。地中海貧血是血紅蛋白病的重要類型之一

5精品課件血紅蛋白病的分類6精品課件地中海貧血概念地中海貧血是由于珠蛋白基因的缺失或缺陷使某種蛋白鏈合成受到抑制而引起的溶血性貧血，為單基因遺傳病。典型的常染色體隱性遺傳病。主要有兩種類型：α-地中海貧血

β-地中海貧血7精品課件地中海貧血臨床特征（中、重度）小細胞低色素性溶血性貧血黃疸肝脾腫大（脾大明顯）骨髓增生生長發(fā)育遲緩合并感染Bart’s水腫胎輸血依賴性8精品課件地中海貧血的遺傳學基礎(chǔ)9精品課件地中海貧血的遺傳規(guī)律10精品課件人體不同發(fā)育時期的血紅蛋白及其組成11精品課件人體不同發(fā)育時期的珠蛋白表達規(guī)律12精品課件蛋白鏈發(fā)育階段特異性的臨床意義胎兒血紅蛋白為α2γ2

所以α地貧的純合子(α基因不表達）,由于不能合成α肽鏈，出現(xiàn)HbBarts水腫胎,宮內(nèi)發(fā)生嚴重貧血。

（孕婦可發(fā)生妊娠高血壓綜合征、巨大胎盤、產(chǎn)后出血等并發(fā)癥）胎兒期的β鏈是低水平表達，以γ鏈表達為主，所以β鏈的減少對胎兒期無影響，出生后頭幾個月γ鏈逐漸被β鏈取代，故重型β地貧一般在出生幾個月才出現(xiàn)貧血。（貧血逐漸加重，肝脾大，反復(fù)輸血和去鐵治療）13精品課件胎兒重型α地貧和成人HbH病的病理

生理學機制14精品課件中國南方α和β地貧的人群攜帶率15精品課件非缺失型α地貧廣西地區(qū)5789例樣本中異常血紅蛋篩查結(jié)果

類型攜帶率

αWS1.55%αQS0.36%αCS1.21%

16精品課件

α和β病理學機制和臨床分類17精品課件主要內(nèi)容地中海貧血的遺傳學基礎(chǔ)地中海貧血的實驗室檢測及應(yīng)用少見型地中海貧血應(yīng)用范例技術(shù)服務(wù)簡介18精品課件

α-地貧的概念由于α

珠蛋白基因缺失或點突變，使α鏈合成受到抑制而引起的貧血。α

-基因缺陷α

-鏈不足α

-地貧

16p13

正常人共有4個α基因

(每條16號染色體上有2個)正常人共有4個α基因

(每條16號染色體上有2個)有4個α基因

(每條16號染色體上有2個)19精品課件α地貧分子基礎(chǔ)有兩種分子機制引起α地貧：缺失型α地貧，占α地貧的95%以上，由α基因缺失引起。非缺失型α地貧，占α地貧約5%，由α基因點突變引起。20精品課件17種引起α珠蛋白表達降低的常見缺失突變21精品課件

中國南方人群12種非缺失型α地中海貧血的突變譜22精品課件

α-地貧的分類靜止型α地貧輕型α地貧HbH病HbBart’s巴氏胎兒水腫綜合癥

23精品課件靜止型α地貧基因型：一個α-珠蛋白基因缺失或突變。表示為：-α/αα或αTα/αα(αT表示突變型）臨床表現(xiàn)：無癥狀，血常規(guī)正常Hb電泳分析：新生兒：HbBart’s0.5%?1%。成人：Hb電泳難以檢出

24精品課件

靜止型α地貧

地貧篩查常發(fā)現(xiàn)不了，需要作基因檢測，但若和α0地中海貧血雜合子通婚后則有

可能生育較嚴重的HbH病患兒。常見有：-α3.7/αα、-ɑ4.2/αα、ααWS/αα25精品課件輕型α地貧基因型：2個α-珠蛋白基因缺失或每條染色體上各有一個

基因缺失或缺陷表示為：--/αα或-α/-α或-α/αTα臨床表現(xiàn)：無明顯癥狀；紅細胞脆性降低（<60%）；MCV<80fl；MCH<27pg；Hb正?；蜉p度下降亨氏小體可能陽性血象：小細胞低色素性貧血Hb電泳分析：新生兒：HbBart’s1%?10%成年人：HbA2≤2.5%26精品課件HbH病基因型：3個α-珠蛋白基因缺失或突變表示為：--/-α（--/αTα）臨床表現(xiàn)：

α鏈的合成受到嚴重影響，大量的β-珠蛋白鏈過剩而聚合為β四聚體—HbH（β4），使紅細胞受損，導致慢性溶血性貧血。

有輕度或中度貧血，部分患者伴肝脾腫大及輕度黃疸，較重者亦需輸血治療。感染和服用氧化性藥物及妊娠均可使貧血加重。27精品課件HbH病28精品課件2類HbH病的血液學參數(shù)比較29精品課件α地貧疾病嚴重程度的單倍型順序α2約占基因表達量的2/3,α1基因占1/330精品課件

HbBart’s胎兒水腫綜合征

基因型：四個α-珠蛋白基因缺失或突變表示為：--/--臨床表現(xiàn)：

α鏈不能合成，γ鏈聚合成HbBart’s(γ4)，氧親和力高，造成組織缺氧壞死，導致早產(chǎn)、死胎，個別能活到足月，也會于出生幾小時內(nèi)死亡。

胎兒有蒼白、水腫、肝脾腫大，胸腹腔積液，大胎盤。孕婦容易合并妊娠高血壓綜合征及產(chǎn)后出血等并發(fā)癥。Hb電泳分析：HbBart’s70~80%Hbportland（ζ2γ2）7~25%HbA0HbF031精品課件胎兒水腫（一）32精品課件胎兒水腫（二）33精品課件中國人常見的缺失型α地貧α0地貧：一條染色體上缺失兩個連鎖的α基因，即α1和α2基因都缺失，如--SEA/，又稱東南亞缺失型;--THAI/,又稱泰國型缺失。α+地貧：是一條染色體上缺失1個α基因（α1或α2），分兩種：-α3.7（右側(cè)缺失）：缺失α2的3`端和α1的5`端，缺失片段約3.7kb。-α4.2（左側(cè)缺失）：α2基因完全缺失，α1基因完整，缺失片段為4.2kb。由于α2基因的表達水平占整個α基因表達量的70%左右，理論上左缺失型比右缺失型對α基因表達的影響大。

34精品課件實驗室檢測診斷技術(shù)篩查+基因檢測：1、血細胞自動分析技術(shù)：獲取數(shù)據(jù)：RBC、HGB，MCV

MCH等數(shù)據(jù)。2、血紅蛋白分析：獲取數(shù)據(jù)：HbA、HbA2、HbF以及一些異常血紅蛋白3、Gap-PCR：獲取數(shù)據(jù)：缺失型α、缺失型β4、反向點雜交（RDB)）：非缺失型α、β35精品課件α缺失型地貧的診斷（Gap-PCR法）

益生堂檢測中國人群常見4種α-地中海貧血缺失型：--SEA

，-α3.7，-a4.2

和--THAI

；國內(nèi)唯一獲得CFDA批準檢測泰國型缺失的試劑，擴大了檢測范圍，減少漏診風險;。

可用于抗凝外周血樣本、羊水樣本或胎絨毛樣本等。靈敏度高。單管多重PCR，檢測流程簡便、快速，結(jié)果準確、可靠。36精品課件Gap-PCR檢測缺失型α地中海貧血基因37精品課件非缺失型α的診斷（PCR探針法）益生堂檢測中國人群中常見的3種α2基因點突變:

αCS

、αQS、αWS檢測非缺失型α和β地貧基因時各項控制參數(shù)相同，可同機擴增、同管雜交、洗滌、顯色雜交時間靈活（可雜交2-18小時），便于合理安排實驗時間38精品課件

非缺失型α地貧基因檢測（RDB法）3種非缺失型α地貧突變位點

(αWSα,CAC?CAG;αQSα,CTG?CCG;αCSα,TAA?CAA)39精品課件α地貧的遺傳咨詢（一）40精品課件α地貧的遺傳咨詢（二）41精品課件α地貧的遺傳咨詢（三）42精品課件α地貧產(chǎn)前診斷指征（一）夫婦雙方都攜帶--SEA/αα

夫婦雙方都攜帶--THAI/αα

夫婦一方為--SEA/αα

另一方為--THAI/αα有1/4的機會生育HbBart?s水腫胎，需要產(chǎn)前診斷。43精品課件α地貧產(chǎn)前診斷指征（二）一方為--SEA/αα

或--THAI/αα,其配偶為αTα非缺失型α突變（突變型為CS、QS）,需要產(chǎn)前診斷。44精品課件α地貧診斷小結(jié)首先夫婦雙方做地貧篩查（血常規(guī)+Hb分析）篩查提示α-地貧時，雙方做α-基因檢查（注意同時檢查缺失及非缺失α基因）若基因結(jié)果出現(xiàn)α-地貧產(chǎn)前診斷指征，需要做產(chǎn)前診斷根據(jù)具體情況選擇產(chǎn)前診斷方法胎兒為HbBarts水腫胎時，建議終止妊娠；為HbH病時，根據(jù)病人意愿處理45精品課件β地貧分子基礎(chǔ)大部分β基因點突變和少部β基因缺失46精品課件β地貧的概念由于β珠蛋白基因的突變，引起血紅蛋白β鏈合成的減少或缺乏而形成的溶血性貧血。β-基因缺陷β鏈不足β地貧β基因在11號染色體上（11p15），每條染色體上有1個基因。47精品課件β珠蛋白基因突變及其對基因功能的影響β0

:β珠蛋白鏈不能合成

β+:β珠蛋白鏈合成減少48精品課件中國南方人群46種β地貧點突變譜及其功能影響49精品課件β珠蛋白基因突變及其對基因功能的影響50精品課件β地貧常見的基因缺失突變51精品課件β地貧病臨床表現(xiàn)及分型52精品課件β地貧病臨床表現(xiàn)及分型注：根據(jù)人體不同發(fā)育時期的血紅蛋白及其組成，胎兒發(fā)育直至出生時β基因低水平表達，導致β地中海貧血的突變對基因的抑制作用在出生時難以顯示，因此重型β地貧患兒出生時不會表現(xiàn)出疾病類型。出生后幾個月發(fā)?。?周歲內(nèi)）

基因確診！53精品課件β地貧基因型與表型的關(guān)系54精品課件夫婦雙方均為β地貧攜帶者（β0或β+），有1/4的機會生育中、重型β患兒。55精品課件β地貧的實驗室檢測1、篩查：篩查指標（與前述α-地貧一樣）：血常規(guī)+Hb分析儀器：紅細胞計數(shù)儀、Hb電泳儀或高效液相分析儀篩查陽性：MCV〈80fL，MCH<27pg

HbA2>3.5%

HbA2升高對判斷β-地貧至關(guān)重要，幾乎可篩

查出所有β-地貧基因攜帶者。56精品課件β地貧的實驗室檢測2、β地貧的基因檢測PCR-RDB法注意：大部分所用基因檢測方法只檢測常見的17個β基因點突變，不能檢查少見或罕見的點突變。當檢測陰性時，應(yīng)結(jié)合HbA2值判斷。57精品課件β地中海貧血基因檢測試劑盒（PCR探針法）（益生堂）起始樣本為抗凝人全血，羊水或胎絨毛。檢測高通量，一份標本只需做一管PCR即可鑒別臨床意義重大的17種β點突變。全過程大約6-8小時。寡核苷酸探針雜交，特異性高，操作簡便，重復(fù)性、穩(wěn)定性良好易于推廣應(yīng)用，凡能開展PCR實驗的單位(有PCR儀和分子雜交爐/恒溫水浴搖床)均能采用本試劑盒。與非缺失α-地中海貧血基因檢測試劑盒擴增條件相同。采用相同的擴增和雜交參數(shù)，一臺PCR儀同時擴增，同管雜交，且同一份雜交物可經(jīng)過1-2次的重新雜交，可進行結(jié)果的復(fù)核與驗證。58精品課件檢測原理(PCR-RDB用于檢測α和β點突變)59精品課件重型β地貧：β0突變雙重雜合子60精品課件β地貧復(fù)合α地貧指同時攜帶有β地貧和α地貧，因為是不同類型的地貧，患者一般無癥狀。地貧篩查的表現(xiàn)同β地貧（MCV↓,HbA2↑），因此無法與單純的β地貧區(qū)別開。檢查β地貧攜帶者的α地貧基因是唯一的區(qū)別方法。61精品課件β地貧復(fù)合α地貧因此，當夫婦雙方的一方是α地貧，另一方是β地貧時，β地貧攜帶者應(yīng)檢查α地貧基因。若是β地貧復(fù)合α地貧，則根據(jù)情況產(chǎn)前診斷。62精品課件β地貧復(fù)合α地貧示例63精品課件β地貧復(fù)合α地貧示例64精品課件基因診斷方法Gap-PCR技術(shù)，缺失型α-地中海貧血基因檢測的首選方法PCR-探針法(RDB)技術(shù)，β-地中海貧血突變基因檢測、非缺失型α-地中海貧血突變基因檢測的首選方法MLPA(缺失型α、β分子診斷技術(shù)）DHPLC（β地中海貧血突變分析）DNA序列測定法（directsequencing,DS）基因突變檢測方法的金標準高分辨熔解曲線分析系統(tǒng)（HRM或HRMA）:DNA序列突變的檢測65精品課件主要內(nèi)容地中海貧血的遺傳學基礎(chǔ)地中海貧血的實驗室檢測及應(yīng)用少見型地中海貧血應(yīng)用范例技術(shù)服務(wù)簡介66精品課件少見型地貧基因檢測指征及流程67精品課件示例一：β地貧的基因診斷（基因測序）試劑盒檢測范圍只包括17個β基因點突變，不能檢測少見或罕見的點突變，當檢測到陰性時，應(yīng)結(jié)合HbA2值綜合判斷。68精品課件β地貧的基因診斷(基因測序）7195測序結(jié)果：

在nt397處出現(xiàn)雙峰，G＞A，對應(yīng)于CD37(TGG＞TAG)，已知文獻報道與β-地貧有關(guān)。69精品課件示例一中β地貧的基因診斷(基因測序）70精品課件示例二：β地貧的基因診斷（基因測序）2015年11月深圳市醫(yī)院，1孕婦遺傳咨詢父親41-42M雜合子母親未檢出17種β突變先證者（？歲）夫妻倆第一個孩子檢出41-42M雜合子但每月需定期輸血！母親可能存在試劑盒檢測范圍外的突變，先證者、母親均進行β測序母親：CD8-9(+G)突變，已知文獻報道與β-地貧有關(guān)先證者：

CD8-9(+G)和CD41-42（

-TCTT）突變胎兒：未檢出β突變（測序結(jié)果有效范圍：β珠蛋白基因-90至IVS-2-100、IVS-2-500至3，PolyA部分，包含了?地中海貧血預(yù)防控制操作指南?中報道的46種中國南方人群β-地中海貧血突變位點及在此區(qū)域內(nèi)的未知突變位點。）71精品課件示例二中先證者測序圖72精品課件示例二中先證者測序圖73精品課件示例三：β地貧基因檢測（缺失型β）父親：

--SEA/αα

27-28M/27-28M母親：

--SEA/αα

βN/

βN胎兒(臍血）：

αα/αα

βN/

βN小孩未遺傳到父親的27-28M位點突變，不符合遺傳規(guī)律父親是否有缺失β（無篩查指標）74精品課件示例三：β地貧基因檢測（缺失型β）75精品課件示例四：少見α缺失女，39歲，福建永泰人，漢族，2015年4月進行孕期檢查。查體：貧血面容。HGB96g／L、(MCV)52.4fl、(MCH)15.2Pg、HbA21.5％，常規(guī)地貧基因檢測檢出東南亞型α地貧缺失片段(--SEA/--SEA)，提示懷疑存在其他缺失片段。

確認基因型：-α27.6/--SEA76精