實驗血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳

實驗血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳第1頁/共16頁目的學習醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質的原理和方法學習蛋白質染色的方法了解電泳法分離血清蛋白質的臨床意義第2頁/共16頁原理1、電泳（electrophoresis）法

在外電場的作用下，帶電顆粒，例如不處于等電狀態(tài)的蛋白質分子帶電荷的蛋白質，在電場中將向著與其所帶電荷電性相反的電極泳動這種現(xiàn)象稱為電泳。第3頁/共16頁電泳影響因素：蛋白質在電場中移動的速度取決于蛋白質所帶的電荷性質、數(shù)量及質點的大小和形狀；此外還受外界因素的影響如，電場強度、溶液的PH、離子強度及電滲等。常見的有：醋酸纖維膜電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、毛細管電泳第4頁/共16頁醋酸纖維薄膜電泳

醋酸纖維薄膜作為支持介質醋酸纖維薄膜：將纖維素的羥基乙?；癁榇姿狨?，溶于丙酮后制成有均一細密微孔的薄膜，其厚度為0.1～0.15mm

第5頁/共16頁血漿蛋白：(1)清蛋白（Alb）、α1、α2、β、纖維蛋白原和γ-球蛋白;(2)血漿中蛋白質的PI小于7.0，在PH8.6Buffer中解離成負離子，在電場中向正極移動。（3）在同一pH下所帶電荷量多少有差異，各蛋白質的分子大小與分子形狀也不相同，因而在同一電場中泳動速度不同。第6頁/共16頁染色劑：

一般蛋白質染色常使用氨基黑、考馬斯亮藍、麗春紅糖蛋白用甲苯胺藍或過碘酸-Schiff試劑脂蛋白則用蘇丹黑或品紅亞硫酸染色第7頁/共16頁白蛋白a1-球蛋白a2-球蛋白β-球蛋白γ－球蛋白點樣處醋酸纖維薄膜法顯示血清蛋白質從陽極端起依次為白蛋白、a1-球蛋白、a2-球蛋白、β-球蛋白和γ－球蛋白五條區(qū)帶。第8頁/共16頁定量與蛋白質結合的染料可溶解于堿液，溶液顏色深淺與蛋白質量呈正比比色法比較各蛋白質條帶溶于堿后的溶液顏色，可計算出各種蛋白質所占的百分比第9頁/共16頁計算OD總和T＝A+α1+α2+β+γ白蛋白％＝A/T×100％α1球蛋白％＝α1/T×100％α2球蛋白％＝α2/T×100％β球蛋白％＝β/T×100％γ球蛋白％＝γ/T×100％第10頁/共16頁操作1、準備（1）電泳儀的準備（2）薄膜的準備：在薄膜無光澤面標記點樣位置將薄膜置于巴比妥緩沖液中浸泡第11頁/共16頁2、點樣（1）無光澤面朝上，吸去多余Buffer,（2）用蓋玻片蘸取少量血漿，垂直印在劃線處。

注意：不能超出邊緣；不能重復點樣；必須與邊緣平行要適量、均勻和垂直，并避免弄破薄膜。楊1.5cm8cm2cm第12頁/共16頁3、平衡：無光澤面朝下，點樣側位于陰極（5min)4、電泳：打開電源，U＝160V或I＝1.6mAt=45－50min；冬季1小時5、染色：氨基黑10B

染色充分，5－10min6、漂洗：

3－4個漂洗皿，洗去染料至背景無色。第13頁/共16頁臨床意義

血漿蛋白是血漿中最主要的固體成分，含量為60～80g/L，絕大部分由肝臟合成，僅γ球蛋白由漿細胞合成

正常值： 白蛋白57％—72％

α1球蛋白2％—5％

α2球蛋白4％—9％

β球蛋白6.5％—12％

γ球蛋白12％—20％

第14頁/共16頁血漿蛋白的主要功能

維持血漿膠