人感染H7N9禽流感采樣與實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)

流感病毒流行性感冒病毒（簡稱流感病毒）：

是一種造成人類及動物患流行性感冒的RNA病毒，在分類學(xué)上，流感病毒屬于正黏液病毒科理化特性：

對熱敏感,56℃30min可滅活；最適pH為7.0～8.0，＜3.0和＞10.0感染力很快被破壞；對紫外線敏感；對乙醚、氯仿、丙酮等有機(jī)溶劑均敏感。

禽流感病毒滅活應(yīng)該是65°30min，或者煮沸100°2min。

第一頁，共25頁。GaoRB,etal,NEJM,2013MorensDMetal,NEJM,2013Dliuetal.,Lancet,2013YiGuanetal,Nature,2013第二頁，共25頁。采樣人員負(fù)責(zé)人感染H7N9禽流感病毒檢測樣本采集的操作人員必須經(jīng)過生物安全培訓(xùn)合格，并具備相應(yīng)的操作技能。樣本采集過程中操作者要加強(qiáng)防護(hù)，應(yīng)穿戴防護(hù)服、眼罩、N95及以上水平的醫(yī)用防護(hù)口罩、帽子、雙層醫(yī)用乳膠手套、鞋套等個體防護(hù)裝備。第三頁，共25頁。標(biāo)本采集對象不明原因肺炎病例。同時具備以下4條的病例:1.發(fā)熱(腋下體溫≥38℃)；2.具有肺炎的影像學(xué)特征；3.發(fā)病早期白細(xì)胞總數(shù)降低或正常,或淋巴細(xì)胞分類計數(shù)減少；4.不能從臨床或?qū)嶒?yàn)室角度診斷為常見病原所致的肺炎。人感染H7N9禽流感疑似病例 第四頁，共25頁?！羯虾粑罉?biāo)本（包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和鼻洗液）；◆下呼吸道標(biāo)本（如氣管吸取物、肺洗液、肺組織標(biāo)本）；◆

血清標(biāo)本；◆

如病人死亡，應(yīng)當(dāng)盡可能說服家屬同意尸檢，及時進(jìn)行尸體解剖，采集組織（如肺組織、氣管、支氣管組織）標(biāo)本；注：應(yīng)當(dāng)盡量采集病例發(fā)病早期的呼吸道標(biāo)本（尤其是下呼吸道標(biāo)本）和發(fā)病7天內(nèi)急性期血清以及間隔2-4周的恢復(fù)期血清。要求呼吸道標(biāo)本：發(fā)病早期采樣，每份不少于3ml血清標(biāo)本每份分為2管，每管不少于0.5ml樣本類型第五頁，共25頁。咽拭子：左手用壓舌板壓住患者舌頭，右手用2根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子同時檫拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，應(yīng)避免接觸舌頭，將拭子頭浸入含3ml采樣液的管中，棄去尾部，旋緊管蓋。樣本采集方法(1)第六頁，共25頁。樣本采集方法(2)鼻拭子：將1根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子輕輕插入鼻道內(nèi)鼻腭處（通常5cm以上），停留片刻后緩慢轉(zhuǎn)動退出；取另1根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子以同樣的方法采集另一側(cè)鼻孔；將上述2根拭子浸入同一含3ml采樣液的管中，棄去尾部，旋緊管蓋?；純焊┡P抬頭，采集者左手托住患兒的下頜部，右手持無菌拭子，將干拭子與上顎平行插入鼻孔（不要向上）直接與鼻咽后壁接觸，深度與到耳導(dǎo)管基本一致，輕輕旋轉(zhuǎn)5秒吸附分泌物，慢慢移出拭子，將拭子頭浸入采樣液中，棄去尾部。第七頁，共25頁。樣本采集方法(3)拭子的要求：

標(biāo)本應(yīng)使用頭部為合成纖維的拭子（例如，聚酯纖維）鋁或塑料做柄，不推薦棉拭子和木柄標(biāo)本采集管應(yīng)包含3毫升病毒采樣液（含有蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，阻止細(xì)菌和真菌生長的抗生素，緩沖液）采樣液中不能加入血清作為蛋白保護(hù)劑，可以加入BSA作為蛋白保護(hù)劑，加入BSA的采樣液應(yīng)-20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ部杉尤肽z（gelatin）作為蛋白保護(hù)劑。使用商品化的無菌采樣液，在分離病毒時需補(bǔ)加抗生素。第八頁，共25頁。樣本采集方法(4)鼻洗液

患者取坐姿，頭微后仰，用移液管將5ml生理鹽水注入一側(cè)鼻孔，囑患者同時發(fā)K音以關(guān)閉咽腔。然后讓患者低頭使生理鹽水流出，用平皿或燒杯收集洗液。重復(fù)此過程洗兩側(cè)鼻孔漱口液

用10ml生理鹽水漱喉。漱時讓患者頭部微后仰，發(fā)“噢”聲，讓生理鹽水在咽部轉(zhuǎn)動。然后，用50ml的無菌螺口塑料管收集洗液。血清標(biāo)本

用真空負(fù)壓采血管采集血液標(biāo)本5ml，室溫靜置30分鐘，1500～2000rpm離心10分鐘，收集血清于2ml無菌螺口塑料管中。第九頁，共25頁。樣本采集方法(5)鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：

用與負(fù)壓泵相連的收集器從鼻咽部抽取粘液或從氣管抽取呼吸道分泌物。先將收集器頭部插入鼻腔或氣管，接通負(fù)壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出；收集抽取的粘液，并用采樣液3ml涮洗收集器1次（可用小孩導(dǎo)尿管接在50ml注射器上來代替收集）。呼吸道灌洗液：

將收集器頭部從鼻孔或氣管插口處插入氣管（約30cm深處），注入5ml生理鹽水，接通負(fù)壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出；收集抽取的粘液，并用采樣液涮洗收集器1次（可用小孩導(dǎo)尿管接在50ml注射器上來代替收集）。第十頁，共25頁。禽流感環(huán)境標(biāo)本采集采集糞便時一定要采集新鮮的（一般較濕潤）糞便，太陳舊（干燥）的糞便對我們的檢測意義不大；在養(yǎng)殖戶家中采集糞便標(biāo)本時，由于多雞鴨混養(yǎng)難以分辨鴨糞和雞糞，最好能找到鴨子剛排泄的新鮮糞便；采樣液中最好已加入抗生素，否則回實(shí)驗(yàn)室要先加入抗生素處理；第十一頁，共25頁。樣本的運(yùn)輸1、病毒培養(yǎng)物按照A類感染性物質(zhì)進(jìn)行包裝運(yùn)輸，其他感染性物質(zhì)按照B類感染性物質(zhì)進(jìn)行包裝運(yùn)輸。2、病例的臨床標(biāo)本采集后，縣級疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)和病例收治的醫(yī)療機(jī)構(gòu)要密切配合，按照生物安全的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行包裝，在24小時內(nèi)送到當(dāng)?shù)亓鞲斜O(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測。第十二頁，共25頁。樣本的分裝與保存樣本的分裝：

采集的呼吸道標(biāo)本每份分為3管，每管不少于1ml。血清標(biāo)本每份分為2管，每管不少于0.5ml。并填寫湖南省不明原因肺炎病例疑似人禽流感病例標(biāo)本送檢單。樣本的保存：

所有呼吸道標(biāo)本應(yīng)保存在4℃，并盡快放置在‐70℃。如果沒有‐70℃度冰箱，標(biāo)本應(yīng)保存在4℃，但不超過24小時。切勿置于-20℃長期保存

。

血清樣本應(yīng)置-20℃長期保存

。注：標(biāo)本運(yùn)送期間應(yīng)避免反復(fù)凍融。第十三頁，共25頁。病原學(xué)檢測（1）甲型流感病毒抗原篩查。呼吸道標(biāo)本甲型流感病毒抗原快速檢測陽性。但僅可作為初篩實(shí)驗(yàn)。（2）核酸檢測。對患者呼吸道標(biāo)本采用realtimePCR（或RT-PCR）檢測H7N9禽流感病毒核酸。（3）病毒分離。從患者呼吸道標(biāo)本中分離H7N9禽流感病毒。（4）動態(tài)檢測雙份血清H7N9禽流感病毒特異性抗體水平呈4倍或以上升高。第十四頁，共25頁。檢測策略不明原因肺炎病例標(biāo)本檢測：

建議各流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室收到不明原因肺炎標(biāo)本后，要在12小時內(nèi)進(jìn)行標(biāo)本處理和核酸檢測，同時進(jìn)行甲型/乙型通用引物，甲型H1N1流感，季節(jié)性H3N2流感，A（H5）、A(H7和N9)亞型流感病毒的檢測。如果H5或H7/N9亞型檢測陽性，在生物安全三級實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行流感病毒的分離鑒定，無病毒分離條件的實(shí)驗(yàn)室，將標(biāo)本在24小時內(nèi)送國家流感中心進(jìn)行復(fù)核鑒定和病毒分離。第十五頁，共25頁。樣品采集/接收對于人禽流感，咽拭子比鼻拭子檢出率高。病毒滴度：氣管吸取物>咽拭子>鼻拭子，糞便中可能可檢出。標(biāo)本送至實(shí)驗(yàn)室后，立即進(jìn)行處理，避免反復(fù)凍融。將原始標(biāo)本分為三份，取一份進(jìn)行檢測，其余保存在－70℃或－70℃以下，短時間保存在4℃，不要保存在－20℃。在生物安全二級實(shí)驗(yàn)室從事相關(guān)實(shí)驗(yàn)室活動時，操作者應(yīng)穿戴眼罩、N95及以上水平的醫(yī)學(xué)防護(hù)口罩、防護(hù)服、帽子、雙層乳膠手套、鞋套等個體防護(hù)裝備；實(shí)驗(yàn)活動應(yīng)當(dāng)有２名以上的工作人員共同進(jìn)行。第十六頁，共25頁。核酸檢測流程1、樣品采集/接收2、核酸提取3、反應(yīng)體系配制4、熒光PCR擴(kuò)增5、結(jié)果判斷第十七頁，共25頁。結(jié)果判斷1.探針/引物的陰性對照反應(yīng)中得到的熒光增長曲線不應(yīng)該超過閾值線，應(yīng)無CT值或?yàn)镃T值為零。如果一個或者多個引物和探針的陰性反應(yīng)出現(xiàn)了假陽性，則樣品可能已經(jīng)被污染。那么整個實(shí)驗(yàn)過程是無效的，嚴(yán)格的按照步驟規(guī)則重新實(shí)驗(yàn)。2.在40個循環(huán)之前，陽性對照反應(yīng)應(yīng)出現(xiàn)陽性結(jié)果，且CT值在20–30之間。如果沒產(chǎn)生預(yù)期的陽性結(jié)果則視為無效，應(yīng)嚴(yán)格遵照操作程序進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。確定PTC反應(yīng)失敗原因，訂正并記錄錯誤原因及更改方案。不再使用沒產(chǎn)生預(yù)期結(jié)果的PTC試劑。3.當(dāng)所有對照成立，檢測標(biāo)本在35個循環(huán)內(nèi)出現(xiàn)熒光信號，則相應(yīng)引物和探針陽性；若CT值在35–40

間，應(yīng)重復(fù)確認(rèn)，如CT值還在40內(nèi)可判斷為陽性；CT值超過40，視該樣本為陰性(A型引物探針以35為閾值，其他分亞型引物探針以38為閾值)。第十八頁，共25頁。結(jié)果判斷4.所有的臨床標(biāo)本RNA檢測都必須為陽性，且CT值在35.0以內(nèi)才足可以證明樣品的質(zhì)量是可接受的。如果臨床標(biāo)本RNA檢測為陰性，則可能是以下原因：4.1臨床樣本核酸提取不正確導(dǎo)致RNA的丟失或臨床標(biāo)本里存在大量的RT-PCR反應(yīng)抑制劑。4.2樣品中人細(xì)胞成分太少，以至于不能檢測到。4.3反應(yīng)液配制錯誤或程序設(shè)置錯誤。第十九頁，共25頁。實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)－避免污染應(yīng)特別注意假陽性產(chǎn)生。推薦以下預(yù)防污染的方法：(a)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備與核酸提取使用獨(dú)立區(qū)域；(b)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備與核酸提取使用專用設(shè)備（如移液器，微量離心機(jī)）和耗材（如微量離心管，吸頭）；(c)實(shí)驗(yàn)開始后穿清潔工作服，并使用新的一次性無粉手套；(d)不同樣本操作之間，以及懷疑可能污染的情況下均更換手套；(e)試劑和反應(yīng)管的蓋子應(yīng)盡量關(guān)閉。第二十頁，共25頁。陽性標(biāo)本送檢要求若當(dāng)?shù)亓鞲斜O(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果為H7亞型禽流感病毒核酸陽性時，應(yīng)當(dāng)于48小時內(nèi)將其中2管呼吸道相關(guān)原始標(biāo)本送省級疾控中心網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室。省級疾控中心網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室在接到醫(yī)療機(jī)構(gòu)和本省網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室送檢的H7和H5亞型陽性的呼吸道標(biāo)本時，未能開展病毒分離的省級疾控中心網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室將陽性病例的原始標(biāo)本48小時內(nèi)送國家流感中心開展病毒分離。

各醫(yī)療機(jī)構(gòu)采集的雙份血清標(biāo)本48小時內(nèi)送當(dāng)?shù)亓鞲斜O(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室，由當(dāng)?shù)鼐W(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室48小時內(nèi)將血清標(biāo)本分別送省級疾控中心和國家流感中心開展相關(guān)抗體檢測，進(jìn)行病例診斷。對于甲型通用引物陽性而不能區(qū)分型別或亞型的毒株和陽性標(biāo)本要求在48小時內(nèi)送至國家流感中心。第二十一頁，共25頁。環(huán)境標(biāo)本檢測送檢要求對人感染H7N9禽流感確診病例可能暴露的禽類飼養(yǎng)或交易等場所，采集禽類糞便、籠具涂拭標(biāo)本和環(huán)境污水等標(biāo)本2周內(nèi)開展甲型流感通用引物、H5、H7和H9亞型檢測。沒有條件開展病毒分離的實(shí)驗(yàn)室在2周內(nèi)將陽性標(biāo)本送國家流感中心。具體技術(shù)要求可參考《職業(yè)暴露人群血清學(xué)和環(huán)境高致病性禽流感監(jiān)測方案（2011年版）》。第二十二頁，共25頁。H7N9禽流感病毒實(shí)驗(yàn)室檢測策略流程圖

甲通陽性H7/H5陰性2周內(nèi)完成血清標(biāo)本及醫(yī)療機(jī)構(gòu)檢測H7陽性標(biāo)本血清標(biāo)本省級CDC實(shí)驗(yàn)室國家流感中心2周內(nèi)完成檢測48h內(nèi)具備條件開展病毒分離毒株陽性未能開展病毒分離48h內(nèi)毒株和標(biāo)本醫(yī)療機(jī)構(gòu)疑似病例雙份血清樣本呼吸道標(biāo)本無條件開展檢測或甲型抗原檢測陽性24h內(nèi)

核酸檢測H7陽性，48h內(nèi)送當(dāng)?shù)谻DC網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)一步送省CDC甲型快速抗原檢測陽性的標(biāo)本醫(yī)療機(jī)構(gòu)未進(jìn)行過檢測的疑似病例標(biāo)本強(qiáng)化監(jiān)測采集的ILI和SARI病例標(biāo)本H5，H7H5/H7陽性陰性檢測結(jié)束停止甲、乙型通用及H5，