免疫學(xué)應(yīng)用第15YE

教學(xué)目標(biāo)了解：免疫學(xué)診斷的原理、常用的免疫功能檢測指標(biāo)免疫治療制劑的類型和作用機(jī)制理解：抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)的特點(diǎn)及影響因素

免疫細(xì)胞的檢測方法及原理免疫分子的檢測方法及原理以抗體、細(xì)胞和細(xì)胞因子為基礎(chǔ)的免疫治療掌握：基于抗原–抗體反應(yīng)的檢測方法及其原理人工（自然）主動(dòng)免疫的概念人工（自然）被動(dòng)免疫的概念第一頁，共92頁。教學(xué)重點(diǎn)與難點(diǎn)：重點(diǎn)：基于抗原–抗體反應(yīng)的檢測方法人工（自然）主動(dòng)免疫的概念人工（自然）被動(dòng)免疫的概念難點(diǎn)：抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)的特點(diǎn)及影響因素免疫分子的檢測原理

教學(xué)對(duì)象：臨床醫(yī)學(xué)五年制本科第二頁，共92頁。使用教材：《醫(yī)學(xué)免疫學(xué)》（第二版），龔非力主編，

科學(xué)出版社，2007年。參考教材：《醫(yī)學(xué)免疫學(xué)》（第五版），金伯泉主編，

人民衛(wèi)生出版社，2008年；

《基礎(chǔ)免疫學(xué)》，W.E.保羅編著，吳玉章等譯，

科學(xué)出版社，2003年。推薦網(wǎng)站：免疫教研室網(wǎng)絡(luò)教學(xué)；

中國免疫學(xué)信息網(wǎng)：第三頁，共92頁?！叭眴栴}導(dǎo)入式教學(xué)法教學(xué)設(shè)計(jì)理念作用機(jī)制前沿?zé)狳c(diǎn)臨床案例第四頁，共92頁。第五頁，共92頁。乙肝三對(duì)檢查及其臨床意義第六頁，共92頁。主要內(nèi)容基于抗原-抗體反應(yīng)的檢測方法免疫細(xì)胞的檢測免疫分子的檢測免疫學(xué)診斷與監(jiān)測免疫學(xué)預(yù)防第七頁，共92頁。第一節(jié)基于抗原-抗體反應(yīng)的檢測方法第八頁，共92頁。

抗原抗體反應(yīng):

指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)

物質(zhì)基礎(chǔ):

抗原表位與抗體高變區(qū)間的互補(bǔ)結(jié)合抗原表位與抗體高變區(qū)的溝槽分子表面的結(jié)合抗原抗體之間的結(jié)合力

一、抗原抗體反應(yīng)的原理第九頁，共92頁。靜電引力（electrostaticforces）范德華引力:作用最?。╲anderWaalsinteractions）氫鍵:最具特異性（hydrogenbond）疏水作用力:作用最大（hydrophobicinteractions）

抗原抗體結(jié)合力示意圖1、抗原抗體結(jié)合力第十頁，共92頁?？贵w分子上一個(gè)抗原結(jié)合點(diǎn)與對(duì)應(yīng)的抗原決定簇之間相適應(yīng)而存在著的引力，是抗原抗體間固有的結(jié)合力親和力(affinity)抗原抗體親和力示意圖2、抗原抗體的親和力和親合力第十一頁，共92頁?？贵w結(jié)合部位與抗原表位之間結(jié)合的強(qiáng)度親合力(avidity)抗原抗體親合力示意圖第十二頁，共92頁。二、抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)特異性可逆性比例性階段性難點(diǎn)內(nèi)容第十三頁，共92頁。特異性：抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的專一性抗原抗體反應(yīng)特異性示意圖分子基礎(chǔ):抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間空間構(gòu)型的互補(bǔ)性1、特異性第十四頁，共92頁。兩種不同的抗原分子具有部分相同或類似結(jié)構(gòu)的抗原表位，可與彼此相應(yīng)的抗血清發(fā)生反應(yīng)交叉反應(yīng)（crossreactions）抗原抗體交叉反應(yīng)示意圖第十五頁，共92頁。2、可逆性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合成復(fù)合物后，在一定條件下又可解離為游離抗原與抗體的特性影響因素：

抗體對(duì)相應(yīng)抗原的親合力－親合力越高，結(jié)合越牢固，越不易解離環(huán)境因素對(duì)復(fù)合物的影響－pH、離子強(qiáng)度

第十六頁，共92頁。前帶(prezone)：抗體過量后帶(postzone)：抗原過量等帶(equivalencezone)：

抗原抗體比例合適

抗原抗體反應(yīng)比例性示意圖抗原與抗體發(fā)生可見反應(yīng)需遵循一定的量比關(guān)系3、比例性第十七頁，共92頁。第一階段：特異性結(jié)合階段，反應(yīng)快，不可見第二階段：反應(yīng)可見階段，反應(yīng)慢，出現(xiàn)凝集、沉淀和細(xì)胞溶解等現(xiàn)象4、階段性第十八頁，共92頁。三、影響抗原抗體反應(yīng)的因素1、反應(yīng)物自身因素抗原:理化性狀、表位種類和數(shù)目抗體:來源、特異性、親和性、效價(jià)難點(diǎn)內(nèi)容第十九頁，共92頁。PH和Na+濃度曲線2、環(huán)境因素電解質(zhì):生理鹽水或緩沖液酸堿度:pH6～pH9溫度:15℃～40℃，37℃最適第二十頁，共92頁。四、基于抗原抗體反應(yīng)的檢測方法根據(jù)抗原與抗體特異性結(jié)合反應(yīng)的特性，用肉眼觀察或借助儀器檢測抗原抗體反應(yīng)的結(jié)果，由此對(duì)樣品中的抗原或抗體進(jìn)行定性、定量或定位分析★免疫學(xué)檢測技術(shù)的核心基礎(chǔ)重點(diǎn)內(nèi)容第二十一頁，共92頁。反應(yīng)類型實(shí)驗(yàn)技術(shù)結(jié)果判斷凝集反應(yīng)直接凝集試驗(yàn)觀察凝集現(xiàn)象間接凝集試驗(yàn)同上抗球蛋白試驗(yàn)同上沉淀反應(yīng)液相沉淀試驗(yàn)觀察沉淀，檢測濁度免疫電泳技術(shù)觀察掃描沉淀峰、沉淀弧補(bǔ)體參與的反應(yīng)補(bǔ)體溶血試驗(yàn)觀察測定溶血現(xiàn)象補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)同上第二十二頁，共92頁。反應(yīng)類型實(shí)驗(yàn)技術(shù)結(jié)果判斷中和反應(yīng)病毒中和試驗(yàn)檢測病毒感染性毒素中和試驗(yàn)檢測外毒素毒性標(biāo)記免疫反應(yīng)熒光免疫技術(shù)檢測熒光現(xiàn)象放射免疫技術(shù)檢測放射性強(qiáng)度酶免疫技術(shù)檢測酶底物顯色發(fā)光免疫技術(shù)檢測發(fā)光強(qiáng)度金免疫技術(shù)檢測金顆粒沉淀第二十三頁，共92頁。

細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后，在一定條件下出現(xiàn)肉眼可見的凝集物。直接凝集間接凝集間接凝集抑制試驗(yàn)1、凝集反應(yīng)（Agglutination）第二十四頁，共92頁。細(xì)菌或紅細(xì)胞與相應(yīng)抗體直接反應(yīng)，可出現(xiàn)細(xì)菌或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。直接凝集反應(yīng)產(chǎn)生的抗原抗體復(fù)合物（1）直接凝集第二十五頁，共92頁。AutoimmuneHemolyticAnemia

直接凝集反應(yīng)示意圖第二十六頁，共92頁。（2）間接凝集

將可溶性抗原或抗體包被在與免疫無關(guān)的載體顆粒表面，再與相應(yīng)抗體或抗原進(jìn)行特異性反應(yīng)，出現(xiàn)顆粒物凝集反應(yīng)。第二十七頁，共92頁。間接凝集反應(yīng)產(chǎn)生的抗原抗體復(fù)合物：第二十八頁，共92頁。（3）間接凝集抑制試驗(yàn)：將待測抗原（或抗體）與特異性抗體（或抗原）先行混合，再加入相應(yīng)致敏載體懸液，若待測抗原抗體反應(yīng)，則隨后加入的相應(yīng)致敏載體顆粒不再被凝集。第二十九頁，共92頁。2、沉淀反應(yīng)(precipitation)

可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后，在一定條件下出現(xiàn)肉眼可見的沉淀，稱為沉淀反應(yīng)。該反應(yīng)多用半固體瓊脂凝膠作為介質(zhì)進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散或免疫擴(kuò)散，即可溶性抗原與抗體在凝膠中擴(kuò)散，在比例合適處相遇即形成可見的白色沉淀。第三十頁，共92頁。（1）單向免疫擴(kuò)散(singleimmunodiffusion)第三十一頁，共92頁。（2）雙向免疫擴(kuò)散(doubleimmunodiffusion)第三十二頁，共92頁。雙向免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)結(jié)果第三十三頁，共92頁。（3）免疫電泳(immunoelectrophoresis)第三十四頁，共92頁。免疫電泳實(shí)驗(yàn)過程動(dòng)畫演示第三十五頁，共92頁。（4）免疫比濁(immunonephelometry)

在一定量抗體中分別加入遞增量的抗原，所形成的免疫復(fù)合物致液體混濁，濁度與復(fù)合物的量呈正相關(guān)，可用濁度計(jì)測量，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線二推算出樣品中抗原含量。第三十六頁，共92頁。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)3、補(bǔ)體參與的反應(yīng)（complementfixationtest,CFT）第三十七頁，共92頁。酶、熒光素、放射性核素或膠體金等標(biāo)記抗體或抗原，進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)的檢測酶免疫測定(enzymeimmunoassay,EIA)免疫熒光法(immunofluorescence,IF)免疫組化技術(shù)（immunohitochemistrytechenique）放射免疫測定法(radioimmunoassay,RIA)化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescenceimmunoassay)免疫印跡法(immunoblotting)4、免疫標(biāo)記技術(shù)（Immunolabellingtechnique）第三十八頁，共92頁。（1）酶免疫測定(EIA)常用的方法如下：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)

(enzymelinkedimmunospotassay，ELISPOT)第三十九頁，共92頁。酶標(biāo)抗體的工作原理酶標(biāo)抗體工作原理示意圖第四十頁，共92頁。①ELISA第四十一頁，共92頁。ELISA反應(yīng)過程動(dòng)畫演示第四十二頁，共92頁。如何測定HBV的S抗原？ELISA原理示意圖乙肝五項(xiàng)及檢測試劑盒第四十三頁，共92頁。如何測定HBV的S抗原？ELISA法測定HBV的S抗原示意圖第四十四頁，共92頁。②酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)ELISpot試驗(yàn)流程圖（1）第四十五頁，共92頁。ELISpot試驗(yàn)流程圖（2）第四十六頁，共92頁。ELISpot試驗(yàn)流程圖（3）第四十七頁，共92頁。典型ElispotPlateLayoutElispot實(shí)驗(yàn)結(jié)果知識(shí)拓展第四十八頁，共92頁。（2）免疫熒光法(immunofluorescence,IF)免疫熒光法試驗(yàn)原理示意圖免疫熒光法示意圖熒光素與抗體連接成熒光抗體

第四十九頁，共92頁。免疫熒光法分類免疫熒光法示意圖第五十頁，共92頁。1、Laminin-green-fluorescentQdot?565IgG

2、CD31-red-fluorescentQdot?655IgG

3、Nuclei-blue-fluorescentHoechst33342Mousekidneysection第五十一頁，共92頁。（3）免疫組化技術(shù)

應(yīng)用標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞抗原發(fā)生反應(yīng)，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，對(duì)組織或細(xì)胞表面抗原進(jìn)行定性、定量、定位。常用技術(shù)包括酶免疫組化（辣根過氧化物酶標(biāo)記）、免疫金組化（膠體金顆粒標(biāo)記）、免疫電鏡技術(shù)（鐵蛋白、膠體金、過氧化物酶標(biāo)記）等。第五十二頁，共92頁。H&Estaining1、11周HBx轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠肝臟組織的HE染色2、HBx轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟內(nèi)有中性脂類聚集第五十三頁，共92頁。

用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體進(jìn)行免疫學(xué)檢測。該法兼有放射性核素的高靈敏度和抗原-抗體反應(yīng)的特異性，檢測靈敏度達(dá)pg水平。常用于標(biāo)記的放射性核素為125I和131I，分為液相和固相兩種方法。該法常用于測定微量物質(zhì)，如胰島素、生長激素、甲狀腺素、孕酮等激素，嗎啡、地高辛、IgE等。（4）放射免疫測定法

(radioimmunoassay,RIA)第五十四頁，共92頁。

將發(fā)光物質(zhì)（如吖啶酯、魯米諾等）標(biāo)記抗原或抗體，發(fā)光物質(zhì)在反應(yīng)劑（如過氧化陰離子）激發(fā)下發(fā)射光子，通過自動(dòng)發(fā)光分析儀測定光子產(chǎn)量，可反映待檢樣品中抗體或抗原含量。該法靈敏度高，常用于檢測血清超微量活性物質(zhì)（甲狀腺素等激素）。（5）化學(xué)發(fā)光免疫分析第五十五頁，共92頁。（6）免疫印跡法第五十六頁，共92頁。第二節(jié)免疫細(xì)胞檢測免疫細(xì)胞分離免疫細(xì)胞亞群分析免疫細(xì)胞功能分析第五十七頁，共92頁。一、免疫細(xì)胞分離免疫細(xì)胞分類示意圖第五十八頁，共92頁。1、葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法BloodPlasmaMononulearcellsRedcells400gCentrifuge30MinutesLymphoprep1.071密度梯度法分離淋巴細(xì)胞示意圖第五十九頁，共92頁。2、流式細(xì)胞儀分選細(xì)胞分選示意圖BDAria流式細(xì)胞儀第六十頁，共92頁。3、磁珠分選磁珠陰性分選原理示意圖第六十一頁，共92頁。二、免疫細(xì)胞及其亞類分析流式細(xì)胞儀工作原理示意圖知識(shí)拓展第六十二頁，共92頁。流式細(xì)胞儀工作原理示意圖流式細(xì)胞儀結(jié)果圖淋巴細(xì)胞中CD8+細(xì)胞頻率知識(shí)拓展第六十三頁，共92頁。流式細(xì)胞儀熒光標(biāo)記與波長對(duì)照?qǐng)D知識(shí)拓展第六十四頁，共92頁。三、淋巴細(xì)胞功能的測定

1、淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)第六十五頁，共92頁。

2、T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)：51Cr釋放法51Cr釋放法細(xì)胞毒試驗(yàn)第六十六頁，共92頁。第三節(jié)免疫分子檢測免疫球蛋白的測定補(bǔ)體測定細(xì)胞因子檢測CD分子、表面受體和黏附分子的檢測HLA型別分析難點(diǎn)內(nèi)容第六十七頁，共92頁。在體外用已知抗原檢測相應(yīng)抗體用已知抗體對(duì)各類免疫球蛋白作定性、定量測定檢測血清含量高的IgG、IgA、IgM時(shí)，可用免疫比濁法；檢測IgD、IgE選用ELISA、RIA等靈敏度高的方法；診斷免疫球蛋白異常性疾?。ㄈ绻撬枇觯?，可用免疫電泳等方法。一、免疫球蛋白的測定第六十八頁，共92頁。了解體內(nèi)補(bǔ)體激活狀況，輔助有關(guān)疾病的診斷血清含量高的C3、C4、B因子等，可用免疫比濁法其他含量低的成分則借助ELISA、RIA等方法血清總補(bǔ)體活性測定常采用50%補(bǔ)體溶血法（50%complementhaemolyticactivity,CH50）二、補(bǔ)體測定第六十九頁，共92頁。CH50原理是：用SRBC和兔抗SRBC作為抗原抗體復(fù)合物，通過經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體而溶解SRBC。通常以50%溶血所需的最小補(bǔ)體量表示總補(bǔ)體活性。第七十頁，共92頁。

1、免疫學(xué)測定法用特異性抗體進(jìn)行定量或半定量檢測（ng/ml）分泌性細(xì)胞因子：雙抗體夾心法、ELISA、RIA、ELISPOT、免疫印跡法等方法胞內(nèi)細(xì)胞因子：FCM免疫熒光技術(shù)或者ELISPOT三、細(xì)胞因子檢測第七十一頁，共92頁。2、生物活性測定法

根據(jù)細(xì)胞因子特定的生物學(xué)活性，借助相應(yīng)指示系統(tǒng)，如選用各種依賴性細(xì)胞株或靶細(xì)胞，同時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照測定，從而得知樣品中細(xì)胞因子活性水平，一般以活性單位（U/ml）表示。

3、分子生物學(xué)測定法

具體方法為聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、實(shí)時(shí)定量PCR等。第七十二頁，共92頁。用已知抗CD分子表面受體和黏附分子的抗體可鑒定細(xì)胞表面相應(yīng)膜分子。膜分子：間接免疫熒光法、流式細(xì)胞術(shù)等可溶性分子：ELISA等四、CD分子、表面受體和黏附分子檢測第七十三頁，共92頁。指紋圖譜技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性寡核苷酸探針(PCR-SSOP)聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物（PCR-SSP）單核苷酸多態(tài)性分析（SNP）五、HLA型別分析——基因分型第七十四頁，共92頁。第四節(jié)免疫診斷與監(jiān)測（自學(xué)）用免疫學(xué)方法確定疾病相關(guān)因子、監(jiān)測疾病過程、判斷療效和預(yù)后。疾病相關(guān)因子檢測：腫瘤抗原、紅細(xì)胞血型抗原、自身抗體、變應(yīng)原抗體等；免疫功能檢測：CD4+T細(xì)胞數(shù)目減少用于艾滋病輔助診斷等；免疫學(xué)檢測：乙肝病毒抗原與抗體的消長等。第七十五頁，共92頁。第五節(jié)免疫預(yù)防免疫學(xué)預(yù)防（immunoprophylaxis）：即人工免疫，通過人工輸入抗原物質(zhì)刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫效應(yīng)，或直接輸入免疫效應(yīng)物質(zhì)，從而特異性清除致病因子，達(dá)到預(yù)防疾病的目的。第七十六頁，共92頁。自然免疫機(jī)體感染病原體后建立的特異免疫（自然主動(dòng)免疫），包括胎兒或者新生兒經(jīng)胎盤或乳汁從母體獲得抗體（自然被動(dòng)免疫）。人工免疫（artificialimmunization）即免疫學(xué)預(yù)防，指采用人工方法，將疫苗、類毒素或含特異性抗體和細(xì)胞的免疫制劑接種于人體，以增強(qiáng)宿主的抗病能力。人工主動(dòng)免疫人工被動(dòng)免疫一、基本概念第七十七頁，共92頁。人工主動(dòng)免疫(artificialactiveimmunization)

是指給機(jī)體接種抗原性物質(zhì)如疫苗、類毒素等，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性免疫力的方法。

Definition:Artificialactiveimmunizationisinoculationwithantigenicsubstancessuchasvaccinestoprovidespecificimmunitymainlyforprevention.第七十八頁，共92頁。人工被動(dòng)免疫(artificialpassiveimmunization)

是給人體注射含特異性抗體的免疫血清或細(xì)胞因子等制劑,使受者迅速獲得特異性免疫力的方法。

Definition:Injectionofspecificantibodiesorotherbiologicalstoprovidebodieswithcorrespondingimmunity,mainlyforemergentprophylaxisortherapy.第七十九頁，共92頁。人工自動(dòng)免疫與人工被動(dòng)免疫的比較

人工自動(dòng)免疫人工被動(dòng)免疫產(chǎn)生免疫力的物質(zhì)抗原（疫苗、類毒素、瘤苗等）抗體、活化的淋巴細(xì)胞、細(xì)胞因子等發(fā)揮作用的潛伏期較長，約12~4周短，無需誘導(dǎo)期、立即發(fā)揮作用免疫力維持時(shí)間較長，約半年~數(shù)年較短，數(shù)周~數(shù)月主要用途預(yù)防傳染性疾病治療腫瘤傳染性疾病的治療或緊急預(yù)防，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，治療腫瘤第八十頁，共92頁。二、疫苗的種類及其作用機(jī)制以完整病原體和毒素制備的疫苗死疫苗（滅活疫苗）、活疫苗（減毒活疫苗）、類毒素新型疫苗亞單位疫苗、結(jié)合疫苗、合成肽疫苗、基因工程疫苗核酸疫苗第八十一頁，共92頁。（一）以完整病原體和毒素制備的疫苗區(qū)別要點(diǎn)死疫苗活疫苗制劑殺死的病原體活的、弱的或無毒的病原體接種劑量及次數(shù)量大，2-3次量小，多為1次副作用大小免疫效果較差，6月-2年較好，3-5年細(xì)胞免疫效果不產(chǎn)生產(chǎn)生穩(wěn)定性穩(wěn)定、易保存，有效期約1年不穩(wěn)定，難保存，4℃冰箱保存數(shù)周常用疫苗霍亂、傷寒、百日咳、流腦、狂犬病、甲肝及乙肝BCG、腮腺炎、麻疹、脊髓灰質(zhì)炎、風(fēng)疹及水痘第八十二頁，共92頁。類毒素（toxoid）細(xì)菌外毒素經(jīng)0.3-0.4%甲醛溶液處理失去毒性而保留其免疫原性誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗外毒素抗體，即抗毒素常用的類毒素：破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素用于主動(dòng)免疫或者接種動(dòng)物制備抗血清第八十三頁，共92頁。（二）新型疫苗亞單位疫苗（subunitvaccine）去除病原體中與誘導(dǎo)保護(hù)性免疫無關(guān)、甚至有害的組分，僅用其有效免疫原成分制備副作用明顯減少，保護(hù)效果相同如：無細(xì)胞百日咳疫苗、流感病毒血凝素和神經(jīng)氨酸酶制備流感疫苗第八十四頁，共92頁。結(jié)合疫苗（conjugatevaccine）將細(xì)菌莢膜多糖的水解物或脂多糖與蛋白載體交聯(lián)，使之成為TD-Ag，從而