基礎(chǔ)學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)高錳酸鉀吸收曲線繪制雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)

（優(yōu)選）基礎(chǔ)學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)高錳酸鉀吸收曲線繪制雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有27頁(yè)\編輯于星期五此實(shí)驗(yàn)共包括如下三個(gè)部分

1.第一部分：高錳酸鉀吸收曲線繪制

2.第二部分：雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)

3.第三部分：蛋白質(zhì)各種定量方法優(yōu)缺點(diǎn)的比較現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有27頁(yè)\編輯于星期五試劑使用規(guī)則使用試劑前應(yīng)該仔細(xì)辨認(rèn)標(biāo)簽，看清名稱及濃度，是否為本實(shí)驗(yàn)所需。取出試劑后，立即將瓶塞蓋好，放回原位；未用完的試劑決不可倒回原瓶。取標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，應(yīng)該將標(biāo)準(zhǔn)溶液倒入干試管中，再用干凈吸管吸取標(biāo)準(zhǔn)液，以免污染瓶中的標(biāo)準(zhǔn)液體。使用滴管時(shí)，滴管尖端朝下，避免試劑流入橡皮帽內(nèi)。使用有毒試劑及強(qiáng)酸強(qiáng)堿時(shí)，盡可能用量筒取，若用吸管只能用吸耳球取，切勿用嘴吸取，以免造成意外?，F(xiàn)在是3頁(yè)\一共有27頁(yè)\編輯于星期五吸量管的使用正確拿法：中指和拇指拿住吸管上端，食指頂住吸量管頂端。移液管的使用：使用時(shí)應(yīng)根據(jù)需量取的液體體積，選用能一次吸取即可的最小規(guī)格的移液管，以減少誤差，如用5ml移液管吸取4.5ml蒸餾水，用0.5ml的移液管吸取0.5ml0.0125%的高錳酸鉀溶液。取液：用吸耳球吸取液體至刻度上，眼睛看著液面上升；吸完后用食指頂住吸量管上端。調(diào)刻度：吸量管與地面保持垂直，下口與試劑瓶接觸，并成一角度；用食指控制液體下降至最上一刻度處；液體凹面、刻度和視線應(yīng)在一水平面上。放液：吸量管移入準(zhǔn)備接受溶液的容器中，使其出口尖端接觸器壁，并成一角度，吸量管仍保持垂直。放開食指，使液體自動(dòng)流出。吸量管應(yīng)最后靠壁15秒?，F(xiàn)在是4頁(yè)\一共有27頁(yè)\編輯于星期五吸量管上端標(biāo)有“吹”字。將所量液體全部放出后，還需要吹出殘留于管尖的溶液。此類吸量管為“吹出式”，未標(biāo)“吹”字的吸量管，則不必吹出管尖的殘留液體，0.5ml以下的都要吹。吸量管尖應(yīng)接觸受器內(nèi)壁，但不應(yīng)插入受器內(nèi)的原有液體之中，以免污染吸量管及試劑。吸取血液、尿、組織樣品、粘稠試劑或有顏色的吸量管，用后應(yīng)及時(shí)用自來(lái)水沖洗干凈。如果吸取一般試劑的吸量管可不必馬上沖洗，待實(shí)驗(yàn)完畢后，用自來(lái)水沖洗干凈，晾干備用。

吸量管的使用注意事項(xiàng)現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有27頁(yè)\編輯于星期五一般玻璃儀器：如試管、燒杯、錐形瓶等，先用自來(lái)水洗刷后，用洗衣粉刷洗，再用自來(lái)水反復(fù)沖洗，最后用蒸餾水淋洗2～3次，干燥備用。容量分析儀器：吸量管、滴定管、容量瓶等，先用自來(lái)水沖洗，待晾干后，再用鉻酸洗液浸泡數(shù)小時(shí)，然后用自來(lái)水充分沖洗，最后用蒸餾水淋洗2～3次，干燥備用。比色杯：用畢立即用自來(lái)水反復(fù)沖洗。洗不凈時(shí)，用鹽酸或適當(dāng)溶劑沖洗，再用自來(lái)水沖洗。避免用堿液或強(qiáng)氧化劑清洗，切忌用試管刷或粗糙布(紙)擦拭。上述所有玻璃器材洗凈(以倒置后器壁不掛水珠為干凈的標(biāo)準(zhǔn))后，根據(jù)需要晾干或烘干。玻璃器皿的清洗方法現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有27頁(yè)\編輯于星期五分光光度法光是一種電磁波，通常用頻率和波長(zhǎng)來(lái)描述光。人的視覺所能感覺到的光稱為可見光，波長(zhǎng)范圍在400～760nm，人的眼睛感覺不到的還有紅外光（波長(zhǎng)大于760-5000000nm）、紫外光（波長(zhǎng)200-400nm）、X射線等。在可見光區(qū)，不同波長(zhǎng)的光呈不同的顏色，但各種有色光之間并沒(méi)有嚴(yán)格的界線，而是由一種顏色逐漸過(guò)渡到另一種顏色。溶液的顏色與吸收光顏色的關(guān)系現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有27頁(yè)\編輯于星期五Beer-Lambert定律－吸收光譜法基本定律描述物質(zhì)對(duì)單色光吸收強(qiáng)弱與厚度和待測(cè)物濃度的關(guān)系。含義：一束單色光通過(guò)溶液時(shí)，光能被吸收的程度與溶液的濃度和液層厚度成正比。A＝KCL或lgI0/I=KCLA為溶液對(duì)光的吸光度，反映了物質(zhì)對(duì)光的吸收程度；C為溶液濃度；L為溶液厚度；I0為照射待測(cè)物質(zhì)的單色光強(qiáng)度，I為透過(guò)待測(cè)物質(zhì)光線的光強(qiáng)度，透光度T=I/I0即溶液透過(guò)光的強(qiáng)度與入射光的強(qiáng)度之比；K為吸光系數(shù)，是物質(zhì)在單位濃度和單位厚度的條件下對(duì)入射光的吸光度。實(shí)驗(yàn)中溶液厚度不變，則A＝KC現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有27頁(yè)\編輯于星期五光吸收示意圖I0IbC現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有27頁(yè)\編輯于星期五吸收光譜和物質(zhì)的定性分析物質(zhì)的吸收光譜與物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。吸收光譜曲線是物質(zhì)的特征曲線。用各種不同波長(zhǎng)的光線作為入射光測(cè)定物質(zhì)的吸光度（Absorbance），然后以波長(zhǎng)（λ）為橫軸，相應(yīng)的吸光度（A）為縱軸，按結(jié)果作圖，可得到該物質(zhì)的吸收光譜曲線，這種曲線體現(xiàn)了物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)的光的吸收能力。在一定的溫度、pH值等條件下吸收光譜的曲線形狀是一定的。在吸收光譜中，往往可找到一個(gè)或幾個(gè)吸收最大值，該處的波長(zhǎng)稱為最大吸收波長(zhǎng)（λmax）。物質(zhì)不同，它們的最大吸收波長(zhǎng)也往往不同。現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有27頁(yè)\編輯于星期五不同濃度的VitB12溶液對(duì)相同波長(zhǎng)的光的不同吸收μg/mlAλ＝550nm現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有27頁(yè)\編輯于星期五原理：根據(jù)物質(zhì)對(duì)于入射光的特征吸收，可應(yīng)用于物質(zhì)溶液的定性檢測(cè)比較吸收光譜曲線：在相同的條件下，吸收光譜曲線不同，表明物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同。比較最大吸收波長(zhǎng)：不同物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)不同；化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)最大吸收波長(zhǎng)相同，吸收系數(shù)不同。比較吸光度的比值：多用于檢測(cè)物質(zhì)的純度（DNAA260/A280=1.8純度鑒定)物質(zhì)定性分析常用方法現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有27頁(yè)\編輯于星期五物質(zhì)的定量分析標(biāo)準(zhǔn)曲線法配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用選定的顯色劑顯色。選用合適波長(zhǎng)的入射光。測(cè)定時(shí)先以空白溶液調(diào)節(jié)透光率100%，然后分別測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)作圖得到一條通過(guò)原點(diǎn)的直線，叫做標(biāo)準(zhǔn)曲線（或稱A-C曲線）。標(biāo)準(zhǔn)管法對(duì)個(gè)別樣品進(jìn)行測(cè)定，且A-C曲線線性良好直接比較測(cè)定結(jié)果。

A標(biāo)=K標(biāo)c標(biāo)b標(biāo)

A測(cè)=K測(cè)

c測(cè)

b測(cè)

c測(cè)=A測(cè)

/A標(biāo)×c標(biāo)現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有27頁(yè)\編輯于星期五分光光度計(jì)的基本構(gòu)造儀器中光源經(jīng)過(guò)單色器中的單色原件（如棱鏡），所得到的單色光（入射光）進(jìn)入樣品室，透出的光被受光器（光電池或光電色）產(chǎn)生光電流，放大后在測(cè)量?jī)x上顯示出吸光度（A）或透光度（T）。光源單色器樣品室受光器測(cè)量器現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有27頁(yè)\編輯于星期五722分光光度計(jì)使用方法接通電源，打開儀器電源開關(guān)，打開樣品室蓋，預(yù)熱10min;將空白液或?qū)φ找杭皽y(cè)定液分別裝入比色杯3/4體積并用擦鏡紙擦凈外壁，放入樣品室內(nèi),空白液一般放于最外格，樣品比色杯放入位置與試管位置對(duì)應(yīng);調(diào)好波長(zhǎng);調(diào)節(jié)按鈕開蓋時(shí)，調(diào)T

參數(shù)調(diào)為100合上蓋，調(diào)A參數(shù)調(diào)為0;逐步拉出樣品室拉桿（聽到“咔”一聲），讀取吸光度值(A）;讀數(shù)完打開樣品室蓋，再將讀數(shù)寫入記錄本。

現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有27頁(yè)\編輯于星期五722分光光度計(jì)使用注意事項(xiàng)樣品室蓋應(yīng)輕開輕放；比色皿拿其磨砂面，液體裝入約3/4高度，并用擦鏡紙擦凈外壁，每次用完后自來(lái)水沖洗干凈，倒置于濾紙上；倒取試劑時(shí)不能在儀器表面上方操作，儀器上請(qǐng)勿放任何物品；每調(diào)換一次波長(zhǎng)，都應(yīng)將空白溶液的吸光度調(diào)至“0”?，F(xiàn)在是16頁(yè)\一共有27頁(yè)\編輯于星期五第一部分高錳酸鉀吸收曲線的繪制實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆辗止夤舛扔?jì)的原理、操作和應(yīng)用能夠熟練使用移液管現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有27頁(yè)\編輯于星期五實(shí)驗(yàn)原理高錳酸鉀水溶液對(duì)不同波長(zhǎng)的光線可有不同的吸收程度。用722型分光光度計(jì)測(cè)定相應(yīng)波長(zhǎng)下的高錳酸鉀吸光度并作圖可得吸收曲線，分析高錳酸鉀溶液的最大吸收波長(zhǎng)?，F(xiàn)在是18頁(yè)\一共有27頁(yè)\編輯于星期五實(shí)驗(yàn)操作取0.0125％高錳酸鉀溶液0.5m1，加蒸餾水4.5ml，作為測(cè)定管;另用蒸餾水作為空白管；用722型分光光度計(jì)測(cè)定不同波長(zhǎng)的吸光度，從450nm至500nm，每隔10nm；502nm至538nm，每隔2nm；540nm至560nm，每隔10nm；在座標(biāo)紙上以吸光度(A)為縱座標(biāo)，波長(zhǎng)(nm)為橫座標(biāo)，繪制吸收曲線，并指出最大吸收波長(zhǎng)；熟練722分光光度計(jì)的操作，在不進(jìn)行測(cè)量時(shí)樣品室蓋應(yīng)打開；兩人合作，一人操作分光光度計(jì)，一人記錄數(shù)據(jù)。現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有27頁(yè)\編輯于星期五第二部分雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私夂驼莆针p縮脲測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理和方法?，F(xiàn)在是20頁(yè)\一共有27頁(yè)\編輯于星期五蛋白質(zhì)在強(qiáng)堿性溶液中與稀硫酸銅溶液作用產(chǎn)生顏色反應(yīng)，生成紫紅色化合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。具有兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的化合物皆有雙縮脲反應(yīng)，蛋白質(zhì)在堿性溶液中，能與Cu2+形成紫紅色絡(luò)合物，顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，故可以用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。在一定的濃度范圍內(nèi)，顏色的深淺與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系。因此可用比色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。實(shí)驗(yàn)原理現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有27頁(yè)\編輯于星期五蛋白含量檢測(cè)的臨床應(yīng)用現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有27頁(yè)\編輯于星期五紫紅色銅雙縮脲復(fù)合物分子結(jié)構(gòu)現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有27頁(yè)\編輯于星期五在分光光度法中，許多不吸收光的無(wú)色物質(zhì)可以用顯色反應(yīng)變成有色物質(zhì)，使之能進(jìn)行比色測(cè)定，并能提高測(cè)定的靈敏度和選擇性。在比色分析或分光光度分析中，將待測(cè)組分轉(zhuǎn)變成有色化合物的反應(yīng)叫做顯色反應(yīng)，與待測(cè)組分反應(yīng)生成有色化合物的試劑叫顯色劑。在實(shí)際分析中，同一待測(cè)組分可與多種顯色劑發(fā)生顯色反應(yīng)，生成不同的有色物質(zhì)。為了保證測(cè)定的靈敏度和準(zhǔn)確度，在分析時(shí)常需對(duì)顯色反應(yīng)進(jìn)行選擇，選擇原則如下：1.選擇性好，干擾少或干擾易消除；2.靈敏度要高；3.生成有色化合物的組成恒定，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定；4.生成的有色化合物與顯色劑之間的顏色須有明顯的差別，最大吸收波長(zhǎng)之差大于60nm。顯色劑與顯色反應(yīng)現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有27頁(yè)\編輯于星期五管號(hào)試劑0123456牛血清標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（ml）2mg/ml—0.61.21.82.43.00待測(cè)蛋白液（ml）——————3.0蒸餾水（ml）32.41.81.20.600蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）00.40.81.21.62.0未知實(shí)驗(yàn)步驟1.按下