內蒙古農業(yè)大學生物化學與分子生物學實驗教學中心

DNA重組實驗原理實驗儀器實驗步驟實驗試劑注意事項實驗原理

外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA連接酶還有一種大腸桿菌連接酶沒有的特性，即能使兩個平末端的雙鏈DNA分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接效率低，一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。重組質粒轉化宿主細胞后，還需對轉化菌落進行篩選鑒定。利用α互補現(xiàn)象進行篩選是最常用的一種鑒定方法?，F(xiàn)在使用的許多載體諸懼有一段大腸桿菌β半乳糖苷酶的啟動子及其編碼。膚鏈的DNA序列，此結構稱為lacZ'基因。lacZ'基因編碼的α肽鏈是β半乳糖苷酶的氨基端的短片段（146個氨基酸）。宿主和質粒編碼的片段各自都不具有酶活性，但它們可以通過片段互補的機制形成具有功能活性的β半乳糖苷酶分子。lacZ'基因編碼的α肽鏈與失去了正常氨基端的β半乳糖苷酶突變體互補，這種現(xiàn)象稱為α互補。由α互補而形成的有功能活性的β半乳糖苷酶，可以用X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷）顯色測定出來，它能將無色的化合物X-gal切割成半乳糖和深藍色的底物(5-溴-4-靛藍。因此，任何攜帶著lacZ'基因的質粒載體轉化了染色體基因組存在著此種β半乳糖苷酶突變的大腸桿菌細胞后，便會產生出有功能活性的β半乳糖苷酶，在IPTG（異丙基硫代β半乳糖苷）誘導后，在含有X-gal的培養(yǎng)基平板上形成藍色菌落。而當有外源DNA片段插人到位于lacZ'中的多克隆位點后，就會破壞α肽鏈的閱讀框，從而不能合成與受體菌內突變的β半乳糖苷酶相互補的活性α肽，而導致不能形成有功能活性的β半乳糖苷酶，因此含有重組質粒載體的克隆往往是白色菌落。實驗儀器

1．恒溫水浴器2．恒溫培養(yǎng)箱3．臺式離心機4．低溫離心機實驗試劑１．KAc：10g２．X-Gal（20mg/ml）5ml：需X-Gal0.1g、5mlN,N-二甲基甲酰胺、錫箔紙數(shù)張３．IPTG(50mg/ml)2ml：需IPTG0.1g４．LB培養(yǎng)基（1000ml液體＋2000ml固體）：胰蛋白胨30g酵母提取物15gNaCl30g瓊脂粉30g0.1NNaOH（調pH）需固體NaOH2g（四）轉化1．在200μL新制備的感受態(tài)細胞中，加人5μL連接產物，混勻，冰上放置30min。同時做兩個對照管。受體菌對照：200μL感受態(tài)細胞+2μL無菌雙蒸水。質粒對照：200μL0.1mol/LCaC12溶液+2μLpUC19質粒DNA溶液。2．將管放到42℃水浴，1-2min。3．冰上放置l-2min4．每管加800μLLB液體培養(yǎng)基（輕輕混勻）,37℃溫育45min，慢搖。5．在預制的LB瓊脂平板上，加40μL20mg/mLXgal和4μL200mg/mLIPTG溶液，并用滅菌玻璃推之（酒精燈上燒后冷卻），均勻涂布于瓊脂凝膠表面。6．將適當體積（200μL）已轉化的感受態(tài)細胞均勻涂在上面的培養(yǎng)皿上。將平皿放置37℃溫箱30min，至液體被吸收。7．倒置平皿37℃培養(yǎng)12-16h，出現(xiàn)菌落。其中白色菌落為重組DNA

注意事項

1．根據(jù)試驗目的和外源片段的不同可選用不同的載體，采用不同粘性末端的雙酶切可實現(xiàn)外源片段的定向克隆。2．克隆中用到的幾種工具酶：（1）限制性內切酶限制性內切酶的一個活性單位（1U）：指在50l反應體系中，37℃下，經過1小時的反應將1gDNA完全切割所需要的酶量。限制性內切酶的star活性：限制酶在某些條件下使用時對DNA切割的位點特異性可能降低，即可以切割與原來識別的特定DNA序列不同的堿基序列，這種現(xiàn)象叫限制酶的star活性。它的出現(xiàn)與限制酶、底物DNA以及反應條件有關。

（2）堿性磷酸酶細菌堿性磷酸酶（BAP）和牛小腸堿性磷酸酶（CIAP）都能催化水解DNA、RNA、dNTP和NTP上的5’－磷酸殘基。比較而言，CIAP更常用，其可在70℃10’內加熱滅活或通過苯酚抽提而變性失活，同時CIAP的活性比BAP的高10－20倍。它主要用于：（1）克隆時去除載體的5’-P，以防載體自連；（2）在用Kinase進行5’末端標記前，去除DNA的5’-P。（3）連接酶體外催化磷酸二酯鍵的形成可使用兩種酶：大腸桿菌連接酶和T4噬菌體連接酶，但幾乎在所有的克隆中T4噬菌體連接酶都是首