手性分析條件的建立和優(yōu)化-手性分析中的注意事項(xiàng)完美版

1/79大賽璐（中國(guó)）手性事業(yè)部手性分析中的注意事項(xiàng)手性分析條件的建立和優(yōu)化2/79內(nèi)容提綱1.手性HPLC分析條件的建立和優(yōu)化

1-1正相色譜

2-2反相色譜2.手性色譜柱的自動(dòng)篩選3.

手性分析中的注意事項(xiàng)3/79Daicel手性色譜柱一覽表正相直鏈淀粉衍生物

CHIRALPAK?

AD/AD-H

CHIRALPAK?

AS/AS-H纖維素衍生物

CHIRALCEL?

OD/OD-H

CHIRALCEL?OJ/OJ-H

CHIRALCEL?

OA,OB,OC

CHIRALCEL?

OF,OG,OK

CHIRALCEL?

CA-1反相

CHIRALPAK?

AD-RH

CHIRALPAK?

AS-RHCHIRALCEL?

OD-RH

CHIRALCEL?

OJ-RH其它

CROWNPAK?

CR(＋),(－)

CHIRALPAK?

OT(＋),OP(＋)

CHIRALPAK?

WH,MA(＋)CHIRALPAK

?

QD-AXCHIRALPAK?

QN-AX共價(jià)鍵合型－新產(chǎn)品

CHIRALPAK?

IA

CHIRALPAK?

IB5/79堿性樣品添加物在分離中的作用mVMinutes0.01.02.03.04.05.06.07.002468101214161820222410.7413.96Hex/IPA/DEA=90/10/0.1流量：1.0mi/min.溫度：25℃、檢測(cè)波長(zhǎng)：ＵＶ（254ｎｍ）流動(dòng)相

Hex/IPA=90/10Hex/IPA/AcOH=90/10/0.1流動(dòng)相

Hex/IPA=90/10-0.10-0.050.000.050.100.150.200.250.300.35mV024681012141618202224262830Minutes10.940.40流量：1.0mi/min.溫度：40℃、檢測(cè)波長(zhǎng)：ＵＶ（254ｎｍ）05101520253035mV0123456789101112131415Minutes6.667.52Minutes0.00.20.40.60.81.01.21.41.6mV0510152025303540酸性樣品（沒(méi)出峰

)（無(wú)法分離

)6/79添加物的種類和用量樣品酸堿性添加物種類添加量中性不需要堿性乙二胺

(DEA)(n-丁胺*1)(乙醇胺*2)≦0.5％通常0.1％酸性三氟乙酸

(TFA)醋酸≦0.5％通常0.1％*1主要用于1級(jí)胺*2主要用于1級(jí)氨基醇7/79分析條件優(yōu)化流程圖(2)保留時(shí)間?長(zhǎng)適宜的分析時(shí)間(10-30min.)短增加

異丙醇增加正已烷2.配制好流動(dòng)相選擇合適的手性柱分析9/79篩選結(jié)果0510152025303540455055600123456789101112131415Minutes4.684.82OB15mV1234567891011121314Minutes6.716.87OD05101520253035404550556065mV0-505101520253035mV0123456789101112131415Minutes6.667.52AD05101520253035404550556065mV0123456789101112131415OJmV01020304050607080mV012345678910111213144.7090AS1501020304050607080901000123456789101112131415Minutes4.70OCMinutes1020304050607080mV0123456789101112131415Minutes4.3615OGMinutes001020304050607080mV01234567891011121314Minutes4.36OF色譜條件流動(dòng)相：

Hex./IPA/AcOH=90/10/0.1流量 ：1.0ml/min.溫度 ：40℃檢測(cè)波長(zhǎng) ：UV254nm樣品 ：先擇效果最好的手性柱,然后繼續(xù)優(yōu)化分析條件10/79分析條件優(yōu)化流程圖（4-A）部分分離A.降低異丙醇濃度

B.調(diào)整溫度C.更換醇類4.分析條件繼續(xù)優(yōu)化11/79醇濃度的影響05101520253035mV0123456789101112131415Minutes6.667.52在多數(shù)情況下，降低醇的濃度可延長(zhǎng)保持時(shí)間，改善分離度Column：AD,Temp.：40℃,Flowrate：1.0ml/min.Hex./IPA/AcOH=90/10/0.1Hex./IPA/AcOH=100/1/0.1-0.50.00.51.01.52.02.53.03.5mV051015202530354045505560Minutes35.7743.71Sample：Flurbiprofen13/79溫度的影響Column：CHIRALPAKADMobilephase：Hex./IPA/AcOH=90/10/0.1,Flowrate：1.0ml/min.25℃40℃Temp.：

5℃降低柱溫會(huì)使峰形變寬，但可增大α值升高柱溫會(huì)使峰形鋒利，但α值卻變小-0.50.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.00123456789101112131415Minutes8.7212.13α:1.59mVMinutes0510152025303501234567891011121314156.667.52α:1.23mV01234567890123456789101112131415Minutes7.669.12α:1.3214/79部分分離C.更換醇類B.調(diào)整溫度4.分析條件繼續(xù)優(yōu)化A.降低異丙醇濃度分析條件優(yōu)化流程圖（4-C）15/79醇種類的影響Hex./IPA/AcOH=90/10/0.1IPA和EtOH有時(shí)會(huì)使峰形和α值發(fā)生明顯變化Column：CHIRALPAKAD

Temp.：40℃,Flowrate：1.0ml/min.Sample：Flurbiprofen05101520253035mV0123456789101112131415Minutes6.667.52a=1.2305101520253001234567891011121314157.589.64a=1.45mVMinutesHex./EtOH/AcOH=95/5/0.117/791.

手性色譜柱分析條件的建立和優(yōu)化

2-1正相色譜

2-2反相色譜手性色譜柱的自動(dòng)篩選3.

手性分析中的有關(guān)注意事項(xiàng)內(nèi)容提綱18/79RH系列（反相用）的規(guī)格流動(dòng)相耐壓(MPa)溫度范圍(℃)pH范圍OD-RH水溶液/有機(jī)溶劑*1=90/10~0/100105～402～7OJ-RHAS-RH5～40*22～9*2,3AD-RH*1有機(jī)溶液：醇（甲醇，乙醇，異丙醇）或乙腈*2pH＞7使用時(shí)，溫度在5～25℃*3pH超過(guò)8時(shí)，使用硼酸緩沖液19/79根據(jù)樣品性質(zhì)選擇流動(dòng)相樣品性質(zhì)OD-RH、OJ-RHAD-RH、AS-RH中性水/乙腈酸性磷酸水溶液(pH2)/乙腈0.1M磷酸緩沖液(pH2)/乙腈堿性0.1MKPF6

水溶液/乙腈0.1MNaPF6水溶液/乙腈20mM硼酸緩沖液(pH9)/乙腈20mM磷酸緩沖液(pH8)/乙腈21/79有機(jī)溶劑種類對(duì)分離的影響水/乙腈=50/50水/乙醇=35/65水/甲醇=25/752-Methyl-1-tetralone2-Phenyl-2-butanol

手性柱：CHIRALPAKAD-RH、流速：0.5ml/min、溫度：25℃22/79反相柱分析條件優(yōu)化的總結(jié)根據(jù)樣品性質(zhì)選擇流動(dòng)相※中性，酸性樣品對(duì)4種反相柱可使用相同的流動(dòng)相。但是，堿性樣品對(duì)OD-RH、OJ-RH組和AD-RH、AS-RH使用的流動(dòng)相是不同的。探索適當(dāng)?shù)谋Ａ魰r(shí)間和流動(dòng)相組成其它優(yōu)化條件水溶液和有機(jī)溶液比例多數(shù)情況下降低有機(jī)溶液的濃度可改善分離性能，但將延長(zhǎng)分析時(shí)間。色譜柱溫度升高色譜柱溫度會(huì)使峰形變得鋒利，但會(huì)降低α值。有機(jī)溶劑的種類有機(jī)溶劑的種類不同，其洗脫強(qiáng)度也不同。有時(shí)其分離效果也發(fā)生一些變化23/79內(nèi)容提綱1.手性色譜柱分析條件的建立和優(yōu)化

2-1正相色譜2-2反相色譜2.手性色譜柱的自動(dòng)篩選3.

手性分析中的注意事項(xiàng)25/79為何選用AD-H,AS-H,OD-H,OJ-H這4種柱子？２０００～２００４年

客戶樣品分析６６０個(gè)樣品的分析結(jié)果達(dá)到基線分離的手性柱比例：基線分離79%（524）部分分離10%（63）不分離11%（73）AD系列、OD系列、AS系列、OJ系列92%（482樣品）其他8%（42樣品）26/79手性柱：AD-H(25cmL)

流動(dòng)相：Hex/IPA=9/1

流速：1.0mL/min.

溫度：25℃UV波長(zhǎng)：254nm標(biāo)準(zhǔn)條件手性柱：AD-H(15cmL)

流動(dòng)相：Hex/IPA=9/1

流速：3.0mL/min.

溫度：25℃UV波長(zhǎng)：254nm篩選條件柱長(zhǎng)（15／25）×流速（1／3）＝分析時(shí)間短縮為（1／5）為何選用15cm長(zhǎng)度手性色譜柱呢？29/791.用UV檢測(cè)器只出現(xiàn)“１峰”的時(shí)候

→應(yīng)用旋光檢測(cè)器可確認(rèn)其分離狀況2.可確認(rèn)其洗脫順序串聯(lián)旋光檢測(cè)器的好處30/79組合篩選設(shè)備的程序編制約6小時(shí)可獲得16條件的色譜圖?1色譜圖平均約20分鐘31/79篩選結(jié)果示例

樣品：32/79信息１:

判別具有分離可能性的色譜柱33/79信息2:色譜柱和洗脫順序AD-HvsOD-H、OJ-H的洗脫順序相反34/79信息3:醇的種類對(duì)分離的影響OD-H和OJ-H，用每種流動(dòng)相均可分離。

AD-H，只有用乙醇才可分離。35/79分析條件的選擇選擇條件的要點(diǎn)洗脫時(shí)間峰形對(duì)映體的洗脫順序36/79樣品制備時(shí)???選擇條件的要點(diǎn)樣品的溶解度洗脫順序37/79若篩選沒(méi)得到理想的分析條件時(shí)選擇最接近基線分離的條件調(diào)整流動(dòng)相中醇的比例調(diào)整流速調(diào)整溫度變更為同種類長(zhǎng)度為25cm的色譜柱。嘗試其他的色譜柱38/79應(yīng)用組合篩選設(shè)備探索分析條件總結(jié)使用具有廣普分離能力的的4種手性色譜柱使用適合高流速的15cm的手性色譜柱組合應(yīng)用2種醇，考察其分離情況和旋光檢測(cè)器并用，可一次性獲得更多的判斷信息39/79內(nèi)容提綱1.手性HPLC分析條件的建立和優(yōu)化

2-1正相色譜2-2反相色譜2.手性色譜柱的自動(dòng)篩選3.

手性分析中的注意事項(xiàng)40/79Daicel大部分手性柱是涂敷型產(chǎn)品，在市場(chǎng)上具有著獨(dú)特性。若導(dǎo)入錯(cuò)誤的溶劑，涂敷型柱子便會(huì)馬上被破壞掉。當(dāng)導(dǎo)入錯(cuò)誤的溶劑時(shí)，柱壓會(huì)出現(xiàn)明顯上升。當(dāng)用戶出現(xiàn)柱壓劇增或分離突然變差時(shí)，最常見(jiàn)的原因是錯(cuò)誤地使用了溶劑。一旦錯(cuò)誤地使用了溶劑，重新恢復(fù)柱子性能的可能性很低。若您遇到此類分析故障時(shí)，請(qǐng)對(duì)出廠報(bào)告重新確認(rèn)柱子的性能或與大賽璐聯(lián)系最常見(jiàn)的使用故障=溶劑錯(cuò)誤41/79將手性柱接入液相色譜儀之前1.用異丙醇