分析化學(xué)22 (2)課件

分析化學(xué)第22章

毛細(xì)管電泳法

CapillaryElectrophoresis,CE毛細(xì)管電泳是帶電粒子在電場(chǎng)力的驅(qū)動(dòng)下，在毛細(xì)管中按其淌度或和分配系數(shù)不同進(jìn)行高效、快速分離的電泳新技術(shù)，也稱為高效毛細(xì)管電泳。

20世紀(jì)30－40年代蒂塞利烏斯(A.W.K.Tiselius）建立了移動(dòng)界面電泳，將電泳發(fā)展成分離技術(shù)獲得1948年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

1981年J.W.Jorgenson,K.D.Lukacs實(shí)驗(yàn)上和理論上為毛細(xì)管電泳的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。上一世紀(jì)后二十多年分析化學(xué)領(lǐng)域中發(fā)展最迅速的分離分析方法。

第22章

毛細(xì)管電泳

22－1毛細(xì)管電泳的原理

1裝置

毛細(xì)管數(shù)據(jù)處理電極檢測(cè)器電極試樣緩沖液緩沖液

高壓電源

（可高至30KV）

第22章毛細(xì)管電泳22－1毛細(xì)管電泳的原理

2電泳和電滲

電泳是指在電場(chǎng)作用下，溶液中的帶電粒子作定向移動(dòng)的現(xiàn)象。電滲是指在電場(chǎng)作用下，毛細(xì)管或固相多孔物質(zhì)內(nèi)液體沿固體表面移動(dòng)的現(xiàn)象。第22章

毛細(xì)管電泳22－1毛細(xì)管電泳的原理

2電泳和電滲

電泳行為與特性使用淌度描述

即單位場(chǎng)強(qiáng)(E)下離子的平均電泳速度υ

μep=υ/E實(shí)驗(yàn)中，只發(fā)生電泳時(shí)有效淌度μef=υef﹒

(L/V)=(

l/tm)﹒(L/V)

毛細(xì)管有效長度遷移時(shí)間毛細(xì)管總長度電壓固液兩相間的總電勢(shì)-熱力學(xué)電勢(shì)-φ0Zeta電勢(shì)-ζ

第22章毛細(xì)管電泳22－1毛細(xì)管電泳的原理

2電泳和電滲

電滲流的流型特點(diǎn)電滲流HPLC塞流層流

第22章毛細(xì)管電泳22－1毛細(xì)管電泳的原理

2電泳和電滲

電滲流的表示電滲流的大小可用淌度(μeo)或電滲流系數(shù)表示

μeo=υeo/E=l/(teo﹒E)電滲流速度毛細(xì)管有效長度

電滲流流出時(shí)間

電場(chǎng)強(qiáng)度第22章毛細(xì)管電泳22－1毛細(xì)管電泳的原理

2電泳和電滲

改變電滲流的方法改變外加徑向電場(chǎng)改變緩沖液成分和濃度Zeta電勢(shì)改變緩沖液pH加入添加劑改變溫度

粘度

鹽-離子強(qiáng)度表面活性劑μeo正比于Zeta電勢(shì)和介質(zhì)的介電常數(shù)反比于介質(zhì)的黏度Zeta電勢(shì)正比于雙電層厚度和界面有效電荷密度反比于介質(zhì)的介電常數(shù)表觀電泳淌度

μap

μap=υap/E

υap為離子的表觀遷移速度

υap=υef+υeo

μap=μef+μeo第22章毛細(xì)管電泳22－1毛細(xì)管電泳的原理

2電泳和電滲

第22章毛細(xì)管電泳22－1毛細(xì)管電泳的原理

3分離效率和分離度

分離效率柱效可以用理論塔板數(shù)n表示

n=(μep+μeo)Vl/(2DL)

毛細(xì)管電泳分離的柱效方程

理論塔板高

H=L/n

n=5.54(χ/W?)2實(shí)驗(yàn)上可按上式求出理論塔板數(shù)χ為電泳圖上從起點(diǎn)至電泳峰最大值之間的距離W?為電泳峰的半高峰寬

分離度計(jì)算式Rs=2(tm2-tm1)/(W1+W2)tm1、tm2分別為兩個(gè)組份的遷移時(shí)間W

為峰底的寬度

第22章毛細(xì)管電泳22－1毛細(xì)管電泳的原理

3分離效率和分離度

第22章毛細(xì)管電泳22－1毛細(xì)管電泳的原理

4區(qū)帶寬度及其展寬因素

區(qū)帶寬度

Ws=（Wt﹒l/tm）-Wd

時(shí)間寬度檢測(cè)器的窗口寬度空間寬度第22章毛細(xì)管電泳22－1毛細(xì)管電泳的原理

4區(qū)帶寬度及其展寬因素

區(qū)帶寬度展寬因素

焦耳熱進(jìn)樣電泳擴(kuò)散毛細(xì)管壁對(duì)組分的吸附

進(jìn)樣

試樣導(dǎo)入毛細(xì)管柱時(shí)，總有一定的試樣區(qū)帶長度。細(xì)內(nèi)徑的毛細(xì)管柱時(shí)，進(jìn)樣操作的要求更為嚴(yán)格。一般進(jìn)樣區(qū)帶控制在柱長的1%電泳擴(kuò)散

試樣區(qū)帶中的緩沖溶液濃度或電阻率與毛細(xì)管其它地方的濃度或電阻率不相等時(shí)，因兩個(gè)區(qū)域電場(chǎng)強(qiáng)度的差異，而引起區(qū)帶電分散。μs---μb

峰前展或拖尾？第22章毛細(xì)管電泳22－1毛細(xì)管電泳的原理

4區(qū)帶寬度及其展寬因素

毛細(xì)管壁對(duì)組分的吸附

電泳峰拖尾或變形，甚至消失。抑制吸附作用常用的方法有：●使用極端pH條件●加入中性鹽或兩性離子化合物●對(duì)毛細(xì)管內(nèi)壁進(jìn)行涂層處理

需要注意：方法也會(huì)抑制或改變電滲流

第22章毛細(xì)管電泳22－1毛細(xì)管電泳的原理

4區(qū)帶寬度及其展寬因素

第22章毛細(xì)管電泳

22－2分離模式

1毛細(xì)管區(qū)帶電泳2膠束電動(dòng)色譜3毛細(xì)管凝膠電泳4毛細(xì)管等速電泳5毛細(xì)管等電聚焦6毛細(xì)管電色譜第22章毛細(xì)管電泳22－2分離模式

2膠束電動(dòng)色譜電動(dòng)色譜:是以電滲流驅(qū)動(dòng)的一種色譜技術(shù)膠束電動(dòng)色譜MEKC:是以膠束為假固定相的一種電動(dòng)色譜，是電泳技術(shù)和色譜技術(shù)的結(jié)合加入高于膠束臨界濃度的表面活性劑膠束電動(dòng)色譜的應(yīng)用特點(diǎn):使毛細(xì)管電泳不僅能分離離子化合物，而且還能分離中性化合物.比高效液相色譜更為高效.

HPLC分離柱效為5000－25000理論板數(shù)/mMEKC可達(dá)到50000－500000理論板數(shù)/m比高效液相色譜更為高速.MEKC分離時(shí)間通常小于30min，但達(dá)到相仿效率的毛細(xì)管LC，需要更長的時(shí)間。

第22章毛細(xì)管電泳22－2分離模式

2膠束電動(dòng)色譜第22章毛細(xì)管電泳22－2分離模式

4毛細(xì)管等速電泳分離是建立在試樣中各組分的電泳淌度不同，等速電泳中被分析試樣進(jìn)樣前后分別使用前導(dǎo)電解質(zhì)溶液和終結(jié)電解質(zhì)溶液，分離后的各組分區(qū)帶以相同的電泳遷移速度通過檢測(cè)窗口。

第22章毛細(xì)管電泳22－2分離模式

4毛細(xì)管等速電泳注意:前導(dǎo)電解質(zhì)的電泳淌度應(yīng)高于試樣中各組分的電泳淌度，而終結(jié)電解質(zhì)的電泳淌度則反之。電泳過程中被分離各組分的濃度都將接近前導(dǎo)電解質(zhì)濃度，對(duì)痕量組分在柱上濃縮可達(dá)幾個(gè)數(shù)量級(jí)，成為重要的柱上濃縮技術(shù)之一。第22章毛細(xì)管電泳22－2分離模式

4毛細(xì)管等速電泳第22章毛細(xì)管電泳22－2分離模式

5毛細(xì)管等電聚焦CIEF:建立在不同蛋白質(zhì)或多肽之間等電點(diǎn)（pI值）差異基礎(chǔ)上的分離方法。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI):指蛋白質(zhì)分子的表觀電荷數(shù)為零時(shí)的pH值。

方法:

進(jìn)樣－等電聚焦－檢測(cè)先將脫鹽的試樣（蛋白質(zhì)）以≥1％的濃度與兩性電解質(zhì)溶液混合，用壓力進(jìn)樣充入毛細(xì)管柱(陽極端)，置于陽極電解質(zhì)溶液如H3PO4中，檢測(cè)端為陰極端，置于陰極電解質(zhì)如NaOH中。施加電壓，進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)。兩性電解質(zhì)離子形成pH的位置梯度，而蛋白質(zhì)在遷移時(shí)會(huì)在其等電點(diǎn)的pH區(qū)域內(nèi)停止移動(dòng)。這樣pI不同的蛋白質(zhì)各組分會(huì)在毛細(xì)管內(nèi)很窄的不同pH區(qū)域內(nèi)聚焦.在陽、陰極電解液中加入鹽如NaCI或NaOH,破壞pH梯度，使各組分蛋白質(zhì)重新帶電，在電場(chǎng)力作用下發(fā)生遷移、檢測(cè)，使不同組分的蛋白質(zhì)得到分離。第22章毛細(xì)管電泳22－2分離模式

5毛細(xì)管等電聚焦特點(diǎn):等電聚焦實(shí)際上也是一個(gè)試樣濃縮過程，這一過程可用于濃縮試樣組分。具有極高的分辯率，可以分離等電點(diǎn)相差0.01pH的兩種蛋白質(zhì).注意:電滲流的存在會(huì)破壞聚焦區(qū)帶的穩(wěn)定

第22章毛細(xì)管電泳22－2分離模式

5毛細(xì)管等電聚焦第22章毛細(xì)管電泳22－2分離模式

6毛細(xì)管電色譜CEC:以電滲流驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相，開管和填充兩種比高效液相色譜具有更高的柱效

第22章

毛細(xì)管電泳

22－3進(jìn)樣與檢測(cè)1進(jìn)樣方法電動(dòng)進(jìn)樣

也稱電遷移進(jìn)樣.

方法:將毛細(xì)管的進(jìn)樣端插入裝有試樣溶液的試樣管中，試樣管中插入電極，與檢測(cè)端的緩沖液間施加進(jìn)樣電壓，并維持一定時(shí)間，試樣溶液在電泳和電滲流作用下進(jìn)入毛細(xì)管，然后再將試樣溶液換成載體緩沖液，電泳即可進(jìn)行。

第22章毛細(xì)管電泳22－3進(jìn)樣與檢測(cè)

1進(jìn)樣方法

流體動(dòng)力學(xué)進(jìn)樣也稱為虹吸進(jìn)樣、重力進(jìn)樣、壓差進(jìn)樣方法:毛細(xì)管進(jìn)樣端插入試樣溶液容器，通過進(jìn)樣端加壓，或檢測(cè)端出口減壓，或調(diào)節(jié)進(jìn)樣端試樣溶液液面大于出口端緩沖液液面高度，利用虹吸現(xiàn)象，使進(jìn)樣口端與出口端形成正壓差，并維持一定時(shí)間，試樣在壓差作用下進(jìn)入毛細(xì)管進(jìn)樣端，再把進(jìn)樣端放回緩沖液液槽中，進(jìn)行電泳

第22章毛細(xì)管電泳22－3進(jìn)樣與檢測(cè)

2檢測(cè)方法

紫外吸收檢測(cè)器第二十二章毛細(xì)管電泳22－3進(jìn)樣與檢測(cè)

2檢測(cè)方法

檢測(cè)器檢出限（mol/L）特

點(diǎn)UV－可見吸收10-5－10-6近似通用，常規(guī)應(yīng)用熒光非相干光誘導(dǎo)