酶的定向進化

酶的定向進化第一頁，共十四頁，2022年，8月28日酶分子的定向進化（directedevolution）：模擬自然進化過程（隨機突變和自然選擇），在體外進行酶基因的人工隨機突變，建立突變基因文庫，在人工控制條件的特殊環(huán)境下，定向選擇得到具有優(yōu)良催化特性的酶的突變體的技術過程。

屬于蛋白質的非合理設計，它不需事先了解酶的空間結構和催化機制。第二頁，共十四頁，2022年，8月28日4.6.1定向進化的特點適應面廣；目的性強；效果顯著。第三頁，共十四頁，2022年，8月28日4.6.2定向進化的原理以很低的比率向目的基因中隨機引入突變，構建突變庫，憑借定向的選擇方法，選出所需性質的優(yōu)化酶(或蛋白質)，從而排除其他突變體。定向進化的基本規(guī)則是“獲取你所篩選的突變體”。定向進化=隨機突變+定向選擇。第四頁，共十四頁，2022年，8月28日第五頁，共十四頁，2022年，8月28日4.6.3酶基因的隨機突變1、易錯PCR技術為代表的無性進化

無性突變：向單一酶分子基因內隨機引入突變，制造突變酶庫以便篩選。

易錯PCR：從酶的單一基因出發(fā)，在改變反應條件的情況下進行聚合酶鏈反應，使擴增得到的基因出現堿基配對錯誤，從而引起基因突變的技術過程。

反應條件：提高Mg2+濃度；添加Mn2+；改變四種底物濃度比等。第六頁，共十四頁，2022年，8月28日易錯PCR技術特點：操作簡便，隨機突變豐富。缺點：正突變基因少，需多次PCR。注意：控制好基因突變頻率。適用：較小基因的定向進化。第七頁，共十四頁，2022年，8月28日2、DNA重排技術為代表的有性進化

DNA重排技術：又稱DNA改組技術，有性PCR（sexualPCR）。從正突變基因文庫中分離得到的同源DNA，用酶切割成隨機片段，經過不加引物的多次PCR循環(huán)，使DNA的堿基序列重新排布而引起基因突變的技術過程。第八頁，共十四頁，2022年，8月28日DNA改組原理第九頁，共十四頁，2022年，8月28日DNA改組技術特點：正突變頻率高，進化速度快。注意：需多次進行。第十頁，共十四頁，2022年，8月28日3、基因家族之間的同源重組

從自然界中存在的基因家族出發(fā)，利用它們之間的同源順序進行DNA改組實現同源重組。

如：Stemmer等從4種微生物中選擇編碼頭孢菌素酶的4個同源基因，對它們進行單獨進化或同源重組進化。結果對單基因進化得到的突變酶中，對頭孢羥羧氧胺的抗性最高的增加了8倍，而用家族同源重組進化的方法使抗性比其中兩種微生物來源的天然酶提高270倍，比另外兩種酶提高了540倍。第十一頁，共十四頁，2022年，8月28日1、突變基因文庫的構建定義：將各種不同突變基因與載體重組，再轉入適宜的細胞或包裝成重組λ噬菌體的技術過程。質量要求：文庫包容性和文庫完整性過程：載體選擇基因重組形成基因文庫質粒噬菌體DNA黏粒載體噬菌粒載體轉化轉導第十二頁，共十四頁，2022年，8月28日2、突變基因的篩選（1）定向選擇環(huán)境條件的設定（2）高通量篩選技