酶的催化機(jī)制

酶的催化機(jī)制第一頁，共三十七頁，2022年，8月28日酶的高效率、高度專一性和酶活可調(diào)節(jié)等催化特性，都與酶蛋白本身的結(jié)構(gòu)直接相關(guān)，酶蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定酶的空間構(gòu)象，而酶的特定空間構(gòu)象是其生物功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。人們只有更深入地認(rèn)識(shí)酶、才能更好地控制酶和應(yīng)用酶，即在不斷研究酶的結(jié)構(gòu)和功能的具體關(guān)系和催化機(jī)理的基礎(chǔ)上，才能研制新的酶類，開發(fā)出更廣泛的用途。第二頁，共三十七頁，2022年，8月28日第一節(jié)酶的活性部位（活性中心）酶的活性部位是指酶分子中結(jié)合底物并催化底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的區(qū)域?；钚圆课话ǖ孜锏慕Y(jié)合部位和催化部位。參與底物結(jié)合的氨基酸殘基稱為結(jié)合基團(tuán)，直接參與催化過程的基團(tuán)稱為催化基團(tuán)，這些氨基酸殘基在一級(jí)結(jié)構(gòu)可能相距很遠(yuǎn)，但在空間結(jié)構(gòu)中卻相距很近，處于酶分子的表面并組成一個(gè)裂隙和流水口袋。

第三頁，共三十七頁，2022年，8月28日一、活性部位在整個(gè)酶分子中只占很小一部分酶與其他蛋白質(zhì)一樣，是一個(gè)結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜的大分子，而參與底物結(jié)合和催化的基團(tuán)，則只是少數(shù)幾個(gè)氨基酸殘基。作為活性部位的裂隙只占酶分子中很小的一部分。

第四頁，共三十七頁，2022年，8月28日二、活性部位是具有三維結(jié)構(gòu)的裂隙

酶的活性部位具有復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)的形態(tài)，構(gòu)成活性部位的氨基酸殘基處于酶分子一級(jí)結(jié)構(gòu)上的不同部位，有的殘基相距很遠(yuǎn)，然而在空間結(jié)構(gòu)上卻相距很近，可協(xié)同結(jié)合和催化底物。例如溶菌酶分子中有129個(gè)氨基酸殘基，活性部位的重要基團(tuán)則是由Glu35，Asp52，Trp62，Trp63和Asp101殘基提供的。第五頁，共三十七頁，2022年，8月28日三、底物與酶活性部位是通過次級(jí)鍵結(jié)合的

酶與底物的復(fù)合物ES的平衡常數(shù)在10-2～10-8mol／L的范圍內(nèi)，其相互作用的自由能變化相當(dāng)于-3～-12kcal／mol的范圍。我們知道，共價(jià)鍵的自由能變化在-50～-110kcal／mol的范圍內(nèi)，相比之下，底物與酶的結(jié)合力是很弱的。第六頁，共三十七頁，2022年，8月28日四、活性部位的裂隙具有高度疏水性

在已知結(jié)構(gòu)的酶分子中，與底物分子結(jié)合的活性部位裂隙，通常水分子是進(jìn)不去的，除非水分子本身是底物分子。裂隙中也含有幾個(gè)對(duì)結(jié)合和催化來說是必需的極性殘基，但并不影響整個(gè)裂隙的疏水性，因此有人將活性部位形象地稱之為“疏水口袋”，活性部位的疏水性增進(jìn)了底物的結(jié)合，是酶具有高效率的原因之一。參與底物結(jié)合的基團(tuán)總和稱為結(jié)合部位，參與催化過程的基團(tuán)總和稱為催化部位。實(shí)際上這兩個(gè)部位的幾何位置并不截然分開，采用這兩個(gè)名稱只是為了便于說明作用的機(jī)制。第七頁，共三十七頁，2022年，8月28日五、活性部位構(gòu)象上的柔性

酶催化的專一性取決于酶分子活性部位必需基團(tuán)各原子的空間排布以及酶與底物之間的多點(diǎn)結(jié)合。1890年Fisher曾提出酶和底物相互作用的鎖一匙模型，然而后來研究結(jié)果表明，酶的活性部位并不是剛性不變的，在結(jié)合底物時(shí)酶分子的活性部位構(gòu)象發(fā)生了改變，這個(gè)過程是個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，稱為誘導(dǎo)契合。近年來，基于大量的在去折疊過程中失活與構(gòu)象變化的比較研究的重要事實(shí)，我國科學(xué)家鄒承魯提出了酶分子的活性部位柔性的理論，并指出這種柔性是酶催化作用所必需的。也就是說，酶分子的活性部位構(gòu)象上相對(duì)的柔性是酶催化所必需的。第八頁，共三十七頁，2022年，8月28日第二節(jié)酶的活性部位的研究方法一、發(fā)現(xiàn)與證實(shí)ChT（胰凝乳蛋白酶）241個(gè)氨基酸，分子量25700。此酶可水解芳香族氨基酸的羧基端形成的肽鍵；可水解芳香族氨基酸的羧基端形成的酯鍵。設(shè)計(jì)人造底物——乙酰酪氨酸乙酯。由于底物很小，故它與酶只是點(diǎn)接觸，而酶又能使其水解，說明酶分子直接參與酶催化的部位只不過是一小部分。第九頁，共三十七頁，2022年，8月28日溶菌酶129個(gè)氨基酸，分子量14600。水解細(xì)胞壁（多糖）而溶菌酶直接接觸的只是六個(gè)六碳糖，也說明酶分子只有小部分參與作用。第十頁，共三十七頁，2022年，8月28日I（抑制劑）→二異丙基氟磷（DFP）ChT+DEP→活性喪失經(jīng)測(cè)定DEP與ChT的195位Ser結(jié)合，而ChT有27個(gè)Ser，只與195-Ser結(jié)合，可見此Ser與其它Ser性質(zhì)不同，可能處于特殊部位。ChT酶原與ChT結(jié)構(gòu)很相近，但DEP+ChT酶原→不結(jié)合不結(jié)合者無酶活，可以推測(cè)抑制劑結(jié)合的部位可能是活性中心第十一頁，共三十七頁，2022年，8月28日二、活性部位含義

酶的活性部位是酶分子的一小部分，是酶分子中與底物結(jié)合并催化反應(yīng)的場(chǎng)所?；钚圆课皇怯蓭讉€(gè)氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)組成（包括輔酶、金屬離子等），它們?cè)谝患?jí)結(jié)構(gòu)中位置可能很遠(yuǎn)，但形成空間結(jié)構(gòu)后位置很近，活性部位實(shí)質(zhì)上是某一空間區(qū)域而不是一個(gè)點(diǎn)或面。酶的活性部位包括底物結(jié)合部位、催化部位。羧肽酶A（全酶）活性部位：Tyr，Arg，Glu；Zn++。第十二頁，共三十七頁，2022年，8月28日三、催化部位和結(jié)合部位

催化部位是催化反應(yīng)中直接參與電子授受關(guān)系的部位，經(jīng)研究ChT的催化部位已清楚，其電荷傳遞系統(tǒng)為Asp102——His57——Ser195（*一級(jí)結(jié)構(gòu)較遠(yuǎn)但空間位置較近）而T（胰蛋白酶）具有與ChT相同的催化部位。ChTGly障礙小，故芳香族氨基酸易進(jìn)入，因此水解芳香族氨基酸羧基形成的肽鍵TAsp-則易結(jié)合帶正電的氨基酸，故水解堿性氨基酸羧基形成的肽鍵酶活性部位的氨基酸組成直接影響其特異性，即二者結(jié)合部位不同。

第十三頁，共三十七頁，2022年，8月28日第十四頁，共三十七頁，2022年，8月28日四、酶活性部位的研究

主要方法是化學(xué)修飾法，其它方法包括反應(yīng)動(dòng)力學(xué)法、光譜法、X光衍射法（結(jié)果可靠，但必須是晶體）。第十五頁，共三十七頁，2022年，8月28日化學(xué)修飾法：蛋白質(zhì)+化學(xué)試劑——反應(yīng)——引起某些氨基酸殘基或某些基團(tuán)的共價(jià)的化學(xué)改變即化學(xué)修飾。此化學(xué)試劑叫化學(xué)修飾劑。第十六頁，共三十七頁，2022年，8月28日如何確定修飾試劑是結(jié)合在活性部位的基團(tuán)上，而不是結(jié)合到活性部位以外的基團(tuán)上呢？首先要求加入修飾試劑后，酶計(jì)量失活（平行失活），其次還要根據(jù)不同的情況作進(jìn)一步確定。計(jì)量失活：加入幾摩爾修飾劑就有幾摩爾的酶100%失活。第十七頁，共三十七頁，2022年，8月28日特殊基團(tuán)————非特異性試劑

使用此種試劑要求:Y只能在活性部位中有，其它部位沒有。例：木瓜蛋白酶有7個(gè)Cys，其中6個(gè)形成-S-S-；1個(gè)Cys。Cys+碘乙酸———計(jì)量失活故Cys在活性部位上。活性部位Y，由于活性部位微環(huán)境的影響反應(yīng)靈敏度極高，此時(shí)非活性中心的Y不與R結(jié)合。例：RNA酶活性部位Lys41的ε-NH2活性特強(qiáng)，可被氟二硝基苯特異標(biāo)記。第十八頁，共三十七頁，2022年，8月28日具有上述二條件的酶極少，而我們要使用非特異性試劑就必須用差示標(biāo)記法。差示標(biāo)記法（加入保護(hù)劑）非特殊基團(tuán)——非特異性試劑R*連接的基團(tuán)即活性部位。保護(hù)效果：在保護(hù)過程中要避免下述兩點(diǎn):P要過量，防止剩余未被保護(hù)的Y；保護(hù)后構(gòu)象變化導(dǎo)致Y-R解離。上述兩點(diǎn)可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)誤差。前兩種標(biāo)記均為共價(jià)標(biāo)記。第十九頁，共三十七頁，2022年，8月28日親和標(biāo)記法非特殊基團(tuán)——親和試劑根據(jù)酶和底物的結(jié)合特性來設(shè)計(jì)底物即特異性試劑。底物+可與活性部位結(jié)合的活性基團(tuán)—親和試劑（特異性較強(qiáng)）ChT：水解芳香族氨基酸羧基所形成的肽鍵或酯鍵，故親和試劑為甲苯磺酰-L-苯丙氨酸為基本結(jié)構(gòu)。第二十頁，共三十七頁，2022年，8月28日第二十一頁，共三十七頁，2022年，8月28日ChT酶原+TPCK——不結(jié)合ChT+8M脲+TPCK——不結(jié)合ChT+TPCK——結(jié)合TPCK結(jié)合部位必定是活性中心ChT：有兩個(gè)His殘基，一級(jí)結(jié)構(gòu)的40，57位。ChT+TPCK—酶水解—分析氨基酸組成——只有一個(gè)His—確定TPCK結(jié)合的是另一His。14C-TPCK+ChT水解發(fā)現(xiàn)14C存在于His-57上，確定TPCK與第57位的His結(jié)合（即活性部位）第二十二頁，共三十七頁，2022年，8月28日T（胰蛋白酶）也有His，但不與TPCK結(jié)合，說明T與ChT有不同的底物專一性，T水解堿性氨基酸羧基所形成的酰胺鍵或酯鍵。它的底物是甲苯磺酰-L-賴氨酰胺（酯）TLCK+T，最后找出與TLCK結(jié)合的氨基酸是His-46即活性部位。

第二十三頁，共三十七頁，2022年，8月28日其它方法：動(dòng)力學(xué)分析法：若在不同的pH條件下，酶活力變化較大，而某個(gè)基團(tuán)的解離程度也有較大程度的改變，則此基團(tuán)是活性部位。光譜學(xué)法：最常用的紫外吸收光譜和熒光光譜。蛋白質(zhì)分子中含有生色基團(tuán)，當(dāng)?shù)孜锝Y(jié)合時(shí)，位于結(jié)合部位的生色基團(tuán)必然會(huì)發(fā)生某種變化，比較底物結(jié)合前后光譜學(xué)的變化，可推斷活性部位。X光衍射：X光衍射可直接看出活性部位（即底物結(jié)合部位），但必須是結(jié)晶。

第二十四頁，共三十七頁，2022年，8月28日第三節(jié)酶的催化機(jī)制我們已經(jīng)了解到酶之所以能加速化學(xué)反應(yīng)，主要是酶能通過與底物形成中間產(chǎn)物來降低反應(yīng)的活化能。不同的酶其催化機(jī)制是有差別的，下面討論酶的催化機(jī)制和對(duì)酶高效催化有貢獻(xiàn)的主要因素。第二十五頁，共三十七頁，2022年，8月28日1、底物與酶的接近與定向效應(yīng)底物的反應(yīng)基團(tuán)與酶活性中心的催化基團(tuán)相互嚴(yán)格的定向，使得活性中心的底物濃度特別高從而使反應(yīng)速度增高。研究發(fā)現(xiàn)提高酶反應(yīng)速度的最主要方法是使底物分子進(jìn)入酶的活性中心區(qū)域，亦即大大提高活性中心區(qū)域的底物有效濃度。除此之外，還需要使反應(yīng)的基團(tuán)在反應(yīng)中彼此相互嚴(yán)格地“定向”，反應(yīng)物分子才被作用，迅速形成過渡態(tài)。見軌道定向假設(shè)示意圖。

第二十六頁，共三十七頁，2022年，8月28日第二十七頁，共三十七頁，2022年，8月28日2、底物分子的敏感鍵產(chǎn)生張力或變形許多酶的活性部位開始與底物并不相適應(yīng)，但為了結(jié)合底物，酶的活性部位不得不發(fā)生相應(yīng)變化（前面所提的誘導(dǎo)契合），以適應(yīng)底物。一旦與底物結(jié)合，酶分子中某些基團(tuán)可使底物分子的敏感鍵中電子云密度部分的增加或減少從而產(chǎn)生“電磁張力”使底物發(fā)生變形，使底物敏感鍵更敏感，更易于反應(yīng)。下圖用一個(gè)示意圖說明酶與底物結(jié)合，使底物變形生成產(chǎn)物的過程。第二十八頁，共三十七頁，2022年，8月28日第二十九頁，共三十七頁，2022年，8月28日3、共價(jià)催化作用

某些酶能與底物形成一個(gè)反應(yīng)活性很高的共價(jià)中間復(fù)合物。底物只需越過較低的活化能就可以形成產(chǎn)物。此既為共價(jià)催化作用。共價(jià)催化的最一般的形式是催化劑的親核基團(tuán)對(duì)底物中親電子的碳原子進(jìn)行攻擊，親核基團(tuán)含有多電子的原子，可以提供電子，它是十分有效的催化劑。酶反應(yīng)中可以進(jìn)行共價(jià)催化的、強(qiáng)有力的親核基團(tuán)很多，酶蛋白分子上至少就有三種，圖中所指出的絲氨酸羥基、半胱氨酸巰基及組氨酸的咪唑基。此外對(duì)具輔酶的雙成分酶（復(fù)合蛋白質(zhì)）來講，其輔酶中往往還含有另外一些親核中心。第三十頁，共三十七頁，2022年，8月28日第三十一頁，共三十七頁，2022年，8月28日4、酸堿催化這里指的是廣義的酸堿催化。它是一種質(zhì)子供體及質(zhì)子受體的催化，發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)許多類型的有機(jī)反應(yīng)都是受廣義的酸堿催化的，如將水加到羰基上、酯的水解，從雙鍵上脫水、各種分子重排及許多取代反應(yīng)等。酶活性中心的一些基團(tuán)（氨基、羧基、酚羥基、巰基、咪唑基等）可作為質(zhì)子供體或受體對(duì)底物進(jìn)行催化，從而加快反應(yīng)速度。蛋白質(zhì)中可作為廣義酸堿的功能基。

第三十二頁，共三十七頁，2022年，8月28日其中組氨酸的咪唑基值得特別注意，因?yàn)樗仁且粋€(gè)很強(qiáng)的親核基團(tuán)，又是一個(gè)最有效、最活潑的廣義酸堿功能基。這是因?yàn)榻M氨酸的咪唑基的解離常數(shù)約為6.0，接近生物體的生理pH條件，此時(shí)它一半是酸形式、另一半是堿形式，既可以作為質(zhì)子供體、也可作為質(zhì)子受體，而且研究發(fā)現(xiàn)它供出和接受質(zhì)子的速度十分迅速，在酶的酸堿催化中顯得特別活躍，而因其廣義堿的形式咪唑環(huán)中N原子上有未共享的電子對(duì)，所以也是親核基團(tuán)，可進(jìn)行共價(jià)催化作用。鑒于咪唑基有如此的優(yōu)點(diǎn)，雖然組氨酸在大多數(shù)蛋白質(zhì)中含量很少，卻很重要。第三十三頁，共三十七頁，2022年，8月28日第三十四頁，共三十七頁，2022年，8月28日5、活性中心部位的微環(huán)境效應(yīng)酶活性中心多半靠近位于疏水微環(huán)境的凹陷中，疏水環(huán)境中介電常數(shù)較低，故在疏水環(huán)境中兩個(gè)帶電物（底物、酶中心）之間的作用力顯著增加，從而使反應(yīng)速度加快。處于低介電環(huán)境中的基團(tuán)之間的反應(yīng)之所以會(huì)得到加強(qiáng)，主要是因?yàn)榻橘|(zhì)的電荷常數(shù)是反映介質(zhì)影響極性基團(tuán)間相互作用力的一種常數(shù)，此值高則會(huì)減弱，此值低則