酶的固定化技術(shù)

酶的固定化技術(shù)第一頁，共五十六頁，2022年，8月28日主要內(nèi)容為什么要固定化什么叫做固定化如何固定固定化的酶活力測量固定化酶的特征固定化酶的應(yīng)用第二頁，共五十六頁，2022年，8月28日1、穩(wěn)定性差2、回收困難，一次使用3、產(chǎn)物的分離純化困難一、為什么要對酶進(jìn)行固定化？第三頁，共五十六頁，2022年，8月28日二、什么是固定化酶固定化酶（Immobilizedenzyme）：固定在一定載體上，在一定空間范圍內(nèi)起催化作用的酶。水溶性酶水不溶性載體水不溶性酶（固定化酶）固定化技術(shù)第四頁，共五十六頁，2022年，8月28日必須注意維持酶的催化活性及專一性固定化應(yīng)該有利于生產(chǎn)自動化、連續(xù)化固定化酶應(yīng)該有最小的空間位阻酶與載體必須結(jié)合牢固固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性固定化酶成本要低三、固定化酶的制備原則第五頁，共五十六頁，2022年，8月28日優(yōu)點(diǎn)固定化酶可以重復(fù)，使用效率高，成本低極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開；在大多數(shù)情況下，能提高酶的穩(wěn)定性；具有一定的機(jī)械強(qiáng)度可以在較長時(shí)間內(nèi)進(jìn)行反復(fù)分批反應(yīng)和裝柱連續(xù)反應(yīng)；酶反應(yīng)過程能夠加以控制；產(chǎn)物溶液中沒有酶的殘留，簡化了提純工藝；較游離酶更適合多酶反應(yīng)；可以增加產(chǎn)物的收率，提高產(chǎn)物的質(zhì)量；酶的使用效率提高，成本降低。四、固定化酶的優(yōu)缺點(diǎn)第六頁，共五十六頁，2022年，8月28日缺點(diǎn)固定化時(shí)，酶活力有損失；工廠初始投資大；只能用于可溶性底物；胞內(nèi)酶必須經(jīng)過酶的分離。第七頁，共五十六頁，2022年，8月28日吸附法、包埋法、結(jié)合法、交聯(lián)法五、如何進(jìn)行酶固定化第八頁，共五十六頁，2022年，8月28日固定化酶的模式圖第九頁，共五十六頁，2022年，8月28日定義；利用各種固體吸附劑將酶或含酶細(xì)胞吸附在其表面上而使酶固定的方法稱為物理吸附法，簡稱吸附法。常用的吸附劑：活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石等。優(yōu)點(diǎn)：操作簡便、條件溫和、不易變性失活、載體廉價(jià)、可反復(fù)使用。缺點(diǎn)：酶與載體結(jié)合不牢固，易脫落。（一）吸附法第十頁，共五十六頁，2022年，8月28日定義：將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法稱為包埋法。根據(jù)包埋的材料和包埋方法的不同，可分為：凝膠包埋法和半透膜包埋法兩類。（二）包埋法第十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日將酶分子包埋在凝膠格子里。凝膠包埋法用得最多、最有效，但不適用于底物或產(chǎn)物分子很大的酶類的固定化。1、凝膠包埋法條件溫和，操作簡便，對酶活影響小，但強(qiáng)度差。天然凝膠：合成凝膠：瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠、明膠等；聚丙烯酰胺凝膠、光交聯(lián)樹脂等強(qiáng)度高，對溫度、pH值變化耐受性強(qiáng)，需要特定的聚合條件，酶易變性。包埋材料第十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日將酶包埋在有各種高分子聚合物制成的小囊中，制成固定化酶。半透膜：聚酰胺膜、火棉膠膜等。適用于底物和產(chǎn)物都是小分子的酶的固定化。2、半透膜包埋法（微囊化法）第十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日（1）界面沉淀法：利用某些高聚物在水相和有機(jī)相的界面上溶解度極低而形成皮膜將酶包埋。例：先將含高濃度的酶液在與水互不相溶的有機(jī)相中乳化形成油包水的微滴,再將高聚物加入乳化液中,然后使高聚物在油水界面沉淀析出,形成膜,將酶包埋,最后移入水相中。此法條件溫和,酶失活少,但是要除去膜上殘留有機(jī)溶劑很麻煩。制備方法：第十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日（2）界面聚合法：

利用親水性單體和疏水性單體在界面發(fā)生聚合原理包埋酶。例：將酶和已二胺的水溶液與葵二酰氯的甲苯溶液混合，再加SPAN乳化已二胺和葵二酰氯，在水相和有機(jī)相的界面聚合形成包埋酶的顆粒。第十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日1、離子鍵結(jié)合法通過離子鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法。載體：DEAE-纖維素、TEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠、CM-纖維素。

優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)酶與載體結(jié)合不牢固，使用時(shí)需嚴(yán)格控制好pH值、離子強(qiáng)度、溫度等操作條件。（三）結(jié)合法條件溫和、操作簡便、活力損失少。第十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日★通過共價(jià)鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法。載體主要有：纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、甲殼質(zhì)、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物等。※載體→活化→活化載體基團(tuán)＋酶分子基團(tuán)

2、共價(jià)鍵結(jié)合法第十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日適用于含有苯氨基的不溶性載體載體先在稀HCl和亞硝酸鈉中進(jìn)行重氮反應(yīng)，然后再在溫和條件下和酶分子上相應(yīng)的基團(tuán)如酚羥基或咪唑基進(jìn)行偶聯(lián)。（1）重氮法Tyr含量高的木瓜蛋白酶、脲酶、葡萄糖氧化酶、堿性磷酸酶、β-葡萄糖苷酶可與多種重氮化載體連接。第十八頁，共五十六頁，2022年，8月28日（2）疊氮法

含有酰肼基團(tuán)的載體可用亞硝酸活化，生成疊氮化合物。活潑的疊氮基團(tuán)可與酶分子中的-NH2形成肽鍵，此外疊氮基團(tuán)還可與酶分子中的-OH、-SH等反應(yīng)。使酶固定化。如：第十九頁，共五十六頁，2022年，8月28日如：R-O-CH2–COOH+CH3OHR-O-CH2–COOCH3+H2OR-O-CH2–COOCH3+NH2-NH2R-O-CH2–CONH2-NH2+CH3OHR-O-CH2–CONH2-NH2

+HNO2R-O-CH2–CON3+H2OR-O-CH2–CON3+E-NH2R-O-CH2–CONH-E

R-O-CH2–CON3+E-OH

R-O-CH2–CO-O-E

R-O-CH2–CON3+E-SH

R-O-CH2–CO-S-ECMC(羧甲基纖維素)第二十頁，共五十六頁，2022年，8月28日對于帶-OH的載體如葡萄糖、纖維素、瓊脂糖來說是最常用的反應(yīng)。在堿性條件下載體-OH和BrCN反應(yīng)生成極活潑的亞氨基碳酸酯衍生物，它們在堿性條件下可與酶的氨基進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)反應(yīng)。（3）溴化氰法第二十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日堿性氨基甲酸衍生物亞氨碳酸酯衍生物+ENZ異脲型亞氨碳酸酯型氨基甲酸酯型第二十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日（4）烷基化法含羥基的載體可用三氯-均三嗪、溴乙酸溴等多鹵代物活化?；罨d體上的鹵素基團(tuán)可與酶分子上的氨基、巰基、羥基等發(fā)生烷基化反應(yīng)，制備固定化酶。第二十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日R-OH+NNNClClCle.g.R-ONNNClClR-ONNNNH-EClE-NH2第二十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日利用雙功能試劑，在酶分子間或酶與載體間，或酶與惰性蛋白間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，以制備固定化酶的方法。交聯(lián)試劑：戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐、雙偶氮苯等。（四）交聯(lián)法第二十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日雙功能試劑：

常用的是戊二醛

O

O H—C—CH2—CH2—

CH2—

C—H交聯(lián)反應(yīng)可以發(fā)生在酶分子間也可以發(fā)生在酶分子內(nèi)。在低酶濃度下一般形成分子內(nèi)交聯(lián)，交聯(lián)后的酶通常保持溶解狀態(tài)。在酶濃度升高情況下分子間交聯(lián)比例上升。形成的固定化酶通常為不溶解狀態(tài)。酶50-200mg/ml，戊二醛0.3-0.6%時(shí)，固定化酶活性高。一般主張交聯(lián)劑和酶最適合比例為1：10（W/W）。采用的pH值一般與被交聯(lián)的酶的等電點(diǎn)相同。第二十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日酶分子之間共價(jià)交聯(lián)和與水不溶性載體共價(jià)偶聯(lián)酶分子；（a）酶分子之間用雙功能基團(tuán)的化學(xué)交聯(lián)試劑相互交聯(lián)成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶聯(lián)到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶第二十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日第二十八頁，共五十六頁，2022年，8月28日交聯(lián)反應(yīng)條件激烈，酶的多個(gè)基團(tuán)被交聯(lián)，致使酶的活力損失大。制備的固定化酶顆粒較小，不便于使用。優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)結(jié)合牢固，酶不會脫落，可長時(shí)間使用。雙重固定化第二十九頁，共五十六頁，2022年，8月28日（五）熱處理法如：將培養(yǎng)好的含葡萄糖異構(gòu)酶的鏈霉菌在60~65℃溫度下處理15min，可以使葡萄糖異構(gòu)酶固定在菌體內(nèi)。將含酶細(xì)胞在一定溫度下熱處理一段時(shí)間，使酶固定在菌體內(nèi)。只適用于熱穩(wěn)定性較好的酶的固定化。第三十頁，共五十六頁，2022年，8月28日四、固定化酶的活力測定方法介紹1.振蕩測定法：2.酶柱測定法：第三十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日評價(jià)固定化酶的指標(biāo)：或稱偶聯(lián)效率，活力保留百分?jǐn)?shù)。相對酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力與游離酶活力的比值稱為相對酶活力

第三十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)吸附法制作條件溫和、簡便、成本低、載體再生、可反復(fù)使用結(jié)合力弱，對pH、離子強(qiáng)度、溫度等因素敏感，酶易脫落，酶的裝載容量較小共價(jià)法載體與偶聯(lián)方法可選擇性大；酶的結(jié)合力強(qiáng)，非常穩(wěn)定偶聯(lián)條件激烈，易引起酶失活；成本高，某些偶聯(lián)試劑有一定毒性交聯(lián)法可用的交聯(lián)試劑多，技術(shù)簡易，酶的結(jié)合力強(qiáng)，穩(wěn)定性高交聯(lián)條件激烈，機(jī)械性能差包埋法包埋材料、包埋方法可選余地大，固定化酶的使用面廣，包埋條件溫和僅可用于低分子量的底物，不適用于柱系統(tǒng)，常有擴(kuò)散限制問題各種酶固定化方法的比較第三十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日影響固定化酶（細(xì)胞）性質(zhì)的因素

酶經(jīng)過固定化后引起的性質(zhì)改變，不外乎兩種原因：一是酶本身的變化，二是受固定化載體的物理或化學(xué)性質(zhì)的影響。就載體物化性質(zhì)和固定化過程影響而言，主要存在以下三種影響效應(yīng)：.

分配效應(yīng)

空間障礙效應(yīng)擴(kuò)散限制效應(yīng)固定化后的特征第三十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日

1、分配效應(yīng)由于載體和底物的性質(zhì)差異引起了微環(huán)境和宏觀環(huán)境之間的性質(zhì)不同。微環(huán)境是在固定化酶附近的局部環(huán)境，而將主體溶液稱為宏觀環(huán)境。由這種不同造成的底物、產(chǎn)物和各種效應(yīng)物在兩個(gè)環(huán)境之間的不同分配，被稱為分配效應(yīng)。

第三十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日

2、空間障礙效應(yīng)

固定化之后，由于酶的空間自由度受到限制(因?yàn)檩d體的空隙太小，或者固定化方式與位置不當(dāng)，給酶的活性部位造成了空間屏障)，使酶分子的活性基團(tuán)不易于底物或效應(yīng)物接觸，影響酶分子的分子活性中心對底物的定位作用,所造成的對固定化酶的活力的影響效應(yīng)，被稱為空間障礙效應(yīng)。

第三十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日第三十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日

3、擴(kuò)散限制效應(yīng)

酶固定化使生物催化反應(yīng)從均相轉(zhuǎn)化為多相，于是產(chǎn)生了擴(kuò)散阻力：

1）、外擴(kuò)散阻力是底物從宏觀環(huán)境向酶顆粒表面?zhèn)鬟f過程中的一種擴(kuò)散限制效應(yīng)，它發(fā)生在反應(yīng)之前，發(fā)生在固定化顆粒周圍的液膜層。它會使底物在固相酶周圍形成濃度梯度，通過增加攪拌速度和底物流速的方法可以減少外擴(kuò)散效應(yīng)。

2）、內(nèi)擴(kuò)散阻力是指底物分子達(dá)到固相酶表面后傳遞到酶活性部位時(shí)的一種擴(kuò)散阻力，它與催化反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行。載體小而彎曲的細(xì)孔是產(chǎn)生內(nèi)擴(kuò)散阻力的要原因。因此使用低分子量底物，小的粒徑、載體孔盡可能大而直且互相連通，或僅僅將酶固定在載體表面都可以降低這種內(nèi)擴(kuò)散阻力。

第三十八頁，共五十六頁，2022年，8月28日1.固定化對酶穩(wěn)定性的影響(1)固定化酶增加了酶的耐熱性(2)固定化增加了酶對變性劑,抑制劑的抵抗能力(3)固定化減輕了蛋白酶的破壞作用(4)固定化可延長酶的操作和保存有效期五、固定化酶的特性第三十九頁，共五十六頁，2022年，8月28日可能原因：固定化后酶與載體多點(diǎn)連接，可以防止酶伸展變性；酶活力的緩慢釋放；抑制酶的自降解，酶分子之間相互作用的機(jī)會大大降低。在工業(yè)上半衰期超過一個(gè)月有應(yīng)用價(jià)值。第四十頁，共五十六頁，2022年，8月28日固定化酶的最適作用溫度一般與游離酶差不多，活化能也變化不大。但有些固定化酶的最適溫度與游離酶比較會有明顯的變化。如胰蛋白酶用殼聚糖包埋后最適合溫度提高了30℃。用重氮法制備的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其作用的最適溫度比游離酶高5~10℃。2.固定化酶最適溫度變化第四十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日3.固定化酶最適pH變化固定化后酶作用的最適pH值一般會發(fā)生變化。影響固定化酶最適pH值的因素主要有兩個(gè)：載體的帶電性質(zhì)、酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的性質(zhì)。第四十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日用帶負(fù)電荷的載體制備固定化酶，其最適合pH值較游離酶偏高。用帶正電荷……一般催化反應(yīng)的產(chǎn)物為酸性時(shí)，固定化酶的最適pH值要比游離酶最適pH值的高一些?！谒氖?，共五十六頁，2022年，8月28日固定化酶的底物特異性與游離酶比較可能有些不同，其變化與底物分子質(zhì)量的大小有一定關(guān)系。4.底物特異性第四十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日作用于低分子底物的酶，固定化前后的底物特異性沒有明顯變化。如：氨基?；浮⑵咸烟茄趸浮⑵咸烟钱悩?gòu)酶?？勺饔糜诖蠓肿拥孜?，又可作用于低分子底物的酶，固定化酶的底物特異性往往會發(fā)生變化。如：以羧甲基纖維素為載體經(jīng)疊氮法制備的核糖核酸酶，當(dāng)以核糖核酸為底物時(shí)，催化速度僅為游離酶的2%左右，而以環(huán)化鳥苷酸為底物時(shí)，催化速度可達(dá)游離酶的50%~60%。第四十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日5.固定化酶的米氏常數(shù)(km)的變化

固定化酶的表觀米氏常數(shù)km隨載體的帶電性能變化。當(dāng)酶結(jié)合于電中性載體時(shí)，由于擴(kuò)散限制造成表觀米氏常數(shù)km上升。若載體與底物帶有相反電荷，固定化酶的表觀米氏常數(shù)km低于游離酶的km。若載體與底物電荷相同時(shí)，就會造成固定化酶的表觀米氏常數(shù)km顯著增加。第四十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日（一）固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用1、 固定化氨基?；浮谝粋€(gè)工業(yè)化的固定化酶

DEAE-SephadexA-50乙酰-DL-AlaL-Ala+乙酸+乙酰-D-Ala氨基酰化酶Aminoacylase八、固定化酶的應(yīng)用第四十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日泵儲罐反應(yīng)產(chǎn)物離心機(jī)消旋反應(yīng)器固定化酶柱子晶體L-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-Ala第四十八頁，共五十六頁，2022年，8月28日2、葡萄糖異構(gòu)酶————生產(chǎn)規(guī)模最大的固定化酶3、天冬氨酸酶4、青霉素?；浮t(yī)藥上廣泛應(yīng)用的固定化酶，用于制造各種半合成青霉素和頭孢菌素。5、延胡索酸酶6、β-半乳糖苷酶7、天冬氨酸-β-脫羧酶葡萄糖異構(gòu)酶葡萄糖果糖第四十九頁，共五十六頁，2022年，8月28日（二）固定化酶在酶傳感器方面的應(yīng)用

酶傳感器：固定化酶與能量轉(zhuǎn)換器（電極、場效應(yīng)管、離子選擇場效應(yīng)管等）密切結(jié)合而成的傳感裝置。酶電極用于樣品組分的分析檢測，有快速、方便、靈敏、精確等優(yōu)點(diǎn)。已用于測定各種糖類、抗生素、氨基酸、甾體化合物、有機(jī)酸、脂肪酸、醇類、胺類以及尿素、尿酸、硝酸、磷酸等。第五十頁，共五十六頁，2022年，8月28日酶電極

1、葡萄糖電極