層析和膜技術(shù)在生物制藥中的應(yīng)用課件

層析技術(shù)在生物制藥中的應(yīng)用一.離子交換層析技術(shù)定義：利用溶液中各種帶電顆粒與離子交換劑之間結(jié)合力的差異進(jìn)行物質(zhì)分離的操作稱離子交換法。離子交換劑由惰性的不溶性載體，功能基團(tuán)和平衡離子組成。平衡離子帶正電荷的為陽(yáng)離子交換劑，平衡離子帶負(fù)電荷的為陰離子交換劑，可見(jiàn)離子交換劑是一類具有活性基團(tuán)的荷電固相顆粒。離子交換層析技術(shù)離子交換反應(yīng)：離子交換劑與交換離子間的作用是由靜電引力而產(chǎn)生的，是一個(gè)可逆的反應(yīng)過(guò)程，當(dāng)這個(gè)反應(yīng)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡時(shí)，其平衡點(diǎn)隨著pH、溫度、溶劑的組成及交換劑本身性質(zhì)的改變而變化。例如，向平衡體系中加入過(guò)量的X+離子，反應(yīng)傾向于生成R-SO3-X+。

離子交換層析的應(yīng)用如慶大霉素，小諾霉素的提煉，應(yīng)用了離子交換技術(shù)。

慶大霉素的提煉酸化的目的在于將慶大霉素從菌絲體中釋放出來(lái)，然后為了便于離子交換，將酸化液中和，再于中性溶液中投入732強(qiáng)酸性陽(yáng)離子樹(shù)脂。因?yàn)閼c大霉素屬于堿性抗生素，系有機(jī)堿，能與多種酸成鹽，在水溶液中以離子狀態(tài)G+存在，可以為陽(yáng)離子樹(shù)脂所吸附，對(duì)吸附了慶大霉素的732樹(shù)脂進(jìn)行洗滌，先用稀酸洗至無(wú)Ca2+、Mg2+，接著用無(wú)鹽水洗至無(wú)Cl-，然后用稀氨洗去小組分雜質(zhì)，最后用濃氨進(jìn)行洗脫，洗脫液（解吸液）用711陰離子樹(shù)脂進(jìn)行脫色，然后經(jīng)濃縮，轉(zhuǎn)鹽、活性炭脫色，噴霧干燥即得慶大霉素成品。

二.凝膠層析凝膠層析，是指樣品混合物通過(guò)一定孔經(jīng)的凝膠固定相，由于流經(jīng)體積的差異，使不同分子量的組分得以分離的一種分離技術(shù)。因整個(gè)層析過(guò)程與過(guò)濾相似也稱凝膠過(guò)濾。又由于物質(zhì)在分離過(guò)程中的阻滯減速現(xiàn)象，也稱排阻層析?；蚍Q凝膠擴(kuò)散層析。凝膠的每個(gè)顆粒的細(xì)微結(jié)構(gòu)如同一個(gè)篩子，小的分子可以進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔，大的分子被排阻于凝膠顆粒之外，因而也稱分子篩層析。凝膠層析分離原理分子篩理論最容易理解，當(dāng)含有大小分子的混合物品流給凝膠層析柱時(shí)，各組分隨洗脫液的流動(dòng)而移動(dòng).大分子進(jìn)入不了顆粒內(nèi)部，最先流出；中分子部分地進(jìn)入顆粒，流出速度中等；小分子進(jìn)入所有顆粒內(nèi)部，移動(dòng)速度慢，最后流出。整個(gè)樣品接分子量大小順序先后流出層析柱，從而達(dá)到分離。凝膠層析分離原理凝膠層析的應(yīng)用凝膠層析目的（或稱分離形式）一般有二種：分組分離和分級(jí)分離。分組分離亦稱類分離，其目的是將分子量極為懸殊的兩類物質(zhì)分開(kāi)，如蛋白質(zhì)與鹽的分離,常用SephadexG-25，因?yàn)槠浞蛛x范圍是1,000-5,000，被分離的兩組物質(zhì)的分子量正好落在分離范圍的兩側(cè)，大分子組為全排阻，而小分子組為全滲入，其Kd值的差可達(dá)最大值1。凝膠層析的應(yīng)用分級(jí)分離，將分子量相差不很大的大分子物質(zhì)加以分離，如分離血清球蛋白與白蛋白。對(duì)于這種分子量相近的物質(zhì)的分離常常選用排阻限略大于樣品中最高分子量的凝膠，即O≤Kd≤1。如果樣品中含有3個(gè)組分的話，最好一個(gè)接近全排阻，另一個(gè)接近全滲入，第三個(gè)為部分滲入，且分子量大于滲入限的3倍，并小于排阻限的1/3。凝膠層析的應(yīng)用脫鹽濃縮去熱原分子量測(cè)定純化凝膠層析的應(yīng)用:脫鹽和濃縮

方法：柱層析包埋法樣品置于透析袋中埋入干膠顆粒堆內(nèi)，經(jīng)過(guò)相當(dāng)時(shí)間后，樣品中的鹽與水分一道為干膠所吸收。直接投入法即將一定量的干膠投入盛樣品容器或直接使樣品溶液從干膠柱上流下。

凝膠層析的應(yīng)用:分離純化用SephadexG-50純化牛、豬胰島素:用SephadexG-25分離氨基酸混合物凝膠層析的應(yīng)用分子量測(cè)定測(cè)定依據(jù)：不同分子量的物質(zhì)，只要在凝膠的分離范圍內(nèi)（滲入限與排阻限之間），其洗脫體積Ve及分配系數(shù)Kd值隨分子量增加而下降。待測(cè)物質(zhì)洗脫體積與分子量關(guān)系符合下式：Ve=-KlogM+CK、C是常數(shù)，為直線方程的斜率和外推截距。同時(shí)Kav=-K′logM+C凝膠層析的應(yīng)用測(cè)定分子量方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法。先以3個(gè)以上的已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白（有標(biāo)準(zhǔn)蛋白商品出售）過(guò)柱，測(cè)取各目Ve值，以Ve做縱坐標(biāo)，logM做橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，之后在同一測(cè)定系統(tǒng)測(cè)取未知物質(zhì)的Ve值，即可由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得分子量。注意：測(cè)得的分子量是近似分子量，誤差在±10%。該法操作簡(jiǎn)便，需要樣品量較少，實(shí)用價(jià)值較大。凝膠層析的應(yīng)用:分子量測(cè)定親和層析的設(shè)計(jì)原理和過(guò)程:

3.親和層析的應(yīng)用由于親和層析技術(shù)具有簡(jiǎn)便，快速、專一和高效等特點(diǎn)，應(yīng)用十分廣泛，已普及到生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。應(yīng)用范圍如下：（1）提取、分離純化、濃縮各類生物分子；（2）分離純化各種功能細(xì)胞，細(xì)胞器，膜片段和病毒顆粒；（3）用于各種生化成分的分析檢測(cè)；（4）其他；金屬螯合親和層析柱的制備：將環(huán)氧活化型Sepharose6B與金屬螯合劑（如亞氨二醋酸）偶聯(lián)成配基，再用金屬離子溶液處理（如Zn2+、Cu2+、Co2+、Ni2+、Cd2+），即成。

金屬螯合親和層析

上樣：柱子經(jīng)平衡后，可將含有生物活性物質(zhì)的樣品上柱，與固定化的金屬配基復(fù)合物有親和力的分子都將被滯留，其余則流出柱外。洗脫：可通過(guò)改變鹽的濃度、改變pH、或由競(jìng)爭(zhēng)性的試劑將蛋白質(zhì)置換下來(lái)，這些方式的機(jī)理都是通過(guò)降低固定化金屬離子和蛋白質(zhì)之間的親和常數(shù)。金屬螯合親和層析的應(yīng)用:

利用含汞樹(shù)脂分離谷胱甘肽

谷胱甘肽中的半胱氨酸含有巰基，巰基化合物與汞具有很強(qiáng)的化學(xué)親和作用，因此用含汞樹(shù)脂提取含巰基化合物能取得很好的效果。谷胱甘肽多從酵母中提取，也可從啤酒生產(chǎn)的廢酵母中提取。酵母的提取液中除了含谷胱甘肽外，還含有其他含巰基的氨基酸和短肽，含汞樹(shù)脂對(duì)這些物質(zhì)也有一定的吸附?？赏ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)酵母提取液的pH值，改變樹(shù)脂對(duì)各種雜質(zhì)成分的吸附力，以達(dá)到分離的目的。有機(jī)染料親和層析

基本原理：一些有機(jī)染料如蒽醌化合物和偶氮化合物具有類似于NAD+的結(jié)構(gòu)，因此一些需要核苷酸類物質(zhì)為輔酶的酶，對(duì)這些染料有一定的親和力，如果這些染料作為配基共價(jià)偶聯(lián)到纖維素或瓊脂糖等多糖載體上，就能制得染料親和層析柱。常用的有機(jī)染料有二羥偶氮復(fù)合物。有機(jī)染料親和層析已成功地分離純化了多種酶，以及應(yīng)用于白蛋白、脂蛋白和干擾素等的分離。有機(jī)染料親和層析應(yīng)用：

苯丙氨酸脫氫酶的純化

苯丙氨酸脫氫酶的純化應(yīng)用了有機(jī)染料親和層析法。將一種模擬生物的染料配基（商品名：ProcionRedHE-3B）,結(jié)合在SepharoseCL-4B上。ProcionRedHE-3B與依靠NAD/NADH作輔酶的酶有特異性的結(jié)合，因而在分離這種類型的酶時(shí)，應(yīng)用很廣。有機(jī)染料親和層析應(yīng)用：

苯丙氨酸脫氫酶的純化將含有苯丙氨酸脫氫酶的酶提取液上柱，親和柱專一性地吸附苯丙氨酸脫氫酶。然后，用平衡緩沖液洗去雜蛋白，再用1mmol/L的NADH（配于平衡緩沖液中）將酶洗脫下來(lái)。經(jīng)過(guò)這種方法純化的酶，純度達(dá)到單一區(qū)帶，達(dá)到了診斷用酶制劑的純度要求。苯丙氨酸脫氫酶可作為診斷試劑，用于測(cè)定和監(jiān)測(cè)遺傳性代謝疾病苯丙酮酸尿。作為診斷用酶制劑的市場(chǎng)很大。四.膜分離技術(shù)膜分離的概念：利用膜的選擇性（孔徑大小），以膜的兩側(cè)存在的能量差作為推動(dòng)力，由于溶液中各組分透過(guò)膜的遷移率不同而實(shí)現(xiàn)分離的一種技術(shù)。透析技術(shù)透析是應(yīng)用得最早的膜分離技術(shù)。透析法的特點(diǎn),是用于分離兩類分子量差別較大的物質(zhì)。即將分子量103級(jí)以上的大分子物質(zhì)與分子量在103級(jí)以下的小分子物質(zhì)分離，屬于分子水平的分離，無(wú)相的改變。透析法都是在常壓下依靠小分子物質(zhì)的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)來(lái)達(dá)到分離濃縮目的。此點(diǎn)不同于超濾。透析技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便，不需要復(fù)雜裝置。缺點(diǎn)：速度慢、處理量小。用途：（1）透析法多用于去除大分子溶液中的小分子物質(zhì)，稱為脫鹽；（2）常用來(lái)對(duì)溶液中小分子成分進(jìn)行緩慢的改變。即所謂的透析平衡，如濃縮大分子、透析結(jié)晶等。旋轉(zhuǎn)透析裝置連續(xù)透析器平面透析器用塑料框把透析管張開(kāi)成為很薄的平面透析管，使透析面積增大，提高了效率。

淺流透析器可兼用于透析和超濾。超濾技術(shù)超濾技術(shù)是近幾十年迅速發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)分子級(jí)薄膜分離手段，它以特殊的超濾膜為分離介質(zhì)，以膜兩側(cè)的壓力差為推動(dòng)力將不同分子量的物質(zhì)進(jìn)行選擇性分離。超濾膜的最小截留分子量為500道爾頓，在生物制藥中可用來(lái)分離蛋白質(zhì)、酶、核酸、多糖、多肽、抗生素、病毒等。超濾技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：沒(méi)有相轉(zhuǎn)移，無(wú)需添加任何化學(xué)物質(zhì)，可以在低溫下操作，過(guò)濾速度較快，便于做無(wú)菌處理，分離操作簡(jiǎn)便，避免生物活性物質(zhì)的活力損失和變性。用途：①大分子物質(zhì)的脫鹽和濃縮；②小分子物質(zhì)的純化；③大分子物質(zhì)的分級(jí)分離；④生化制劑或其他制劑的去熱原處理。超濾技術(shù)的應(yīng)用濃縮和脫鹽優(yōu)點(diǎn)是不消耗試劑，無(wú)相轉(zhuǎn)移，可在低溫下進(jìn)行，濃縮的同時(shí)還可脫掉鹽和其他小分子雜質(zhì)。脫鹽方法：

（1）稀釋超濾法鹽離子等小分子雜質(zhì)隨溶劑（水）不斷透過(guò)濾膜而去，當(dāng)濃縮到一定濃度時(shí)再加入溶劑至原體積，如此反復(fù)多次，絕大部分小分子物質(zhì)可被除去。（2）滲濾法脫鹽原理與稀釋法相同。

超濾的應(yīng)用分級(jí)分離與純化如右圖所示，按分子量截留值由大而小串聯(lián)幾個(gè)超濾器，各自保持一定體積，用10-20倍體積的緩沖液逐級(jí)洗下，不同分子量物質(zhì)相應(yīng)下移，在各濾器中獲得不同分子量范圍的組分，從而使大分子量得到分離和純化，同時(shí)也進(jìn)行了濃縮。超濾的應(yīng)用除菌超濾是一種很好的冷滅菌法，適合于不能高壓消毒滅菌的生化產(chǎn)品；去熱原適合一些分子量較小的生物藥物的去熱原；超濾的應(yīng)用超濾與酶反應(yīng)器聯(lián)用使分解產(chǎn)物生成后立即與底物分離，提高底物利用率，減少酶用量，提高酶促反應(yīng)速度。微孔膜過(guò)濾微孔膜過(guò)濾又稱“精密過(guò)濾”，是最近20多年發(fā)展起來(lái)的一種薄膜過(guò)濾技術(shù)。主要用于分離亞微米級(jí)顆粒，是目前應(yīng)用最廣泛的一種分離分析微細(xì)顆粒和超凈除菌的手段。優(yōu)點(diǎn)：（1）設(shè)備簡(jiǎn)單；（2）操作簡(jiǎn)便、快速；（3）分離效率高，重現(xiàn)性好；（4）一些微孔濾膜具有結(jié)合生物大分子的特殊能力。微孔濾膜過(guò)濾的應(yīng)用

藥液中微粒及細(xì)菌的濾除靜脈注射若受微粒及細(xì)菌的污染，對(duì)人體危害性很大。微孔濾膜過(guò)濾在制藥工業(yè)中對(duì)于濾除藥液中微粒、微生物和檢測(cè)藥液的質(zhì)量是不可缺少的保證手段?？股氐臒o(wú)菌檢驗(yàn)空氣凈化處理微孔濾膜過(guò)濾的應(yīng)用

抗生素的無(wú)菌檢驗(yàn)

用微孔膜過(guò)濾進(jìn)行無(wú)菌