工業(yè)用微生物菌種課用

工業(yè)用微生物菌種課用第1頁/共108頁第二章發(fā)酵工業(yè)菌種第2頁/共108頁本章內容

一、常用的工業(yè)微生物二、發(fā)酵工業(yè)菌種篩選的原則與基本技術三、發(fā)酵工業(yè)菌種改良第3頁/共108頁最常用的工業(yè)微生物細菌醋酸桿菌屬制醋工業(yè)的菌種乳酸桿菌枯草桿菌丙酮丁醇梭菌大腸桿菌谷氨酸棒狀桿菌假單胞菌第4頁/共108頁第5頁/共108頁第6頁/共108頁第7頁/共108頁第8頁/共108頁熒光假單胞菌熒光假單胞菌(P.fluorescens)屬于假單胞菌屬rRNAI群熒光DNA同源組，是植物根際最普遍的微生物類群，具有分布廣、數(shù)量多、營養(yǎng)需要簡單、繁殖快、競爭定殖力強的特點。熒光假單胞菌，而且許多菌株能產(chǎn)生幾種活性物質，抗多種植物病害。其作用機制包括：抗生素的作用、噬鐵素對鐵的營養(yǎng)競爭、有效的根際定殖等。世界許多國家均有人報道分離到抗植物病害的熒光假單胞菌,而且許多菌株能產(chǎn)生幾種活性物質,如抗油菜菌核病的菌株。第9頁/共108頁第10頁/共108頁銅綠假單胞菌（綠膿桿菌）第11頁/共108頁第12頁/共108頁第13頁/共108頁第14頁/共108頁谷氨酸發(fā)酵菌種日前用于谷氨酸發(fā)酵的菌種有谷氨酸棒桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌、黃色短桿菌、嗜氨小桿菌、球形節(jié)桿菌。我國常使用的生產(chǎn)菌株是北京棒桿菌AS1.299、北京棒桿菌D110、鈍齒棒桿菌A51.542、棒桿菌S-914和黃色短桿菌T6~T13等。在己報道的谷氨酸生產(chǎn)菌中，除芽孢桿菌外，雖然它們在分類學上屬于不同的屬種，但都有一些共同的特點，如菌體為球形、短稈至棒狀、無鞭毛、不運動、不形成芽孢、呈革蘭氏陽性、需要生物素做生長因子、在通氣條件下培養(yǎng)產(chǎn)生谷氨酸。第15頁/共108頁谷氨酸發(fā)酵機制谷氨酸的生物合成途徑大致是：葡萄糖經(jīng)EMP途徑或HMP途經(jīng)生成丙酮酸→再氧化成乙酰輔酶A→然后進入TCA→再通過乙醛酸循環(huán)、CO2固定作用→生成a-酮戊二酸→谷氨酸脫氫酶的催化及有NH4+存在的條件下生成谷氨酸第16頁/共108頁谷氨酸生產(chǎn)菌能夠在體外積累菌體最大生長需要量300多倍的谷氨酸，研究發(fā)現(xiàn)：大量積累并非是當初設想的由于特異代謝途徑導致，而是：代謝調節(jié)控制；細胞膜通透性的特異調節(jié)；發(fā)酵條件的適合。第17頁/共108頁谷氨酸菌種的定向選育改變細胞膜的通透性：生物素（乙酰CoA羧化酶的輔酶）營養(yǎng)缺陷型株喪失脂肪酸合成酶的油酸缺陷型；喪失a-磷酸甘油酶的甘油缺陷型。選育溫度敏感突變株：例：使用典型的溫度敏感突變株TS-88生產(chǎn)谷氨酸時，通過控制發(fā)酵條件，在生長適當階段將發(fā)酵溫度由30℃提高到40

℃，可在生物素含量為33ug/L，含糖3.6%的甜菜糖蜜發(fā)酵培養(yǎng)基中，產(chǎn)生20g/L谷氨酸，對糖轉化率>55%。第18頁/共108頁生物素對谷氨酸發(fā)酵的影響生物素作為催化脂肪酸生物合成最初反應的關鍵酶——乙酰CoA羧化酶的輔酶，參與了脂肪酸的生物合成，進而影響磷脂的合成。當控制生物素在亞適量時，脂肪酸合成就不完全，導致磷脂合成不完全。而細胞膜是由磷脂雙分子層組成的，當磷脂含量減少到正常時的一半左右時，細胞發(fā)生變形，谷氨酸能夠從胞內滲出、積累于發(fā)酵液中。如果生物素過量，則發(fā)酵過程菌體大量繁殖，不產(chǎn)或少產(chǎn)谷氨酸，代謝產(chǎn)物中乳酸和琥珀酸明顯增多。第19頁/共108頁生物素亞適量的原因（2ug/L~5ug/L）

：當生物素缺乏時，菌種生長十分緩慢；當生物素過量時，則轉為乳酸發(fā)酵。在谷氨酸發(fā)酵過程中，影響菌種代謝途徑的因素見下表。第20頁/共108頁第21頁/共108頁第36頁，共69頁防止噬菌體和雜菌的污染谷氨酸生產(chǎn)菌一

般都是生物素缺陷型，而在發(fā)酵培養(yǎng)基中又大多是控制生物素亞適量，所以谷氨酸生產(chǎn)菌對噬菌體和雜菌的抵抗能力較弱。最怕污染噬菌體，輕則出現(xiàn)谷氨酸收率低、難提取，重則倒罐，造成很大的經(jīng)濟損失。所以，雜菌和噬菌體的防治工作就顯得特別重要。一定要從空氣過濾、培養(yǎng)基、設備、環(huán)境等環(huán)節(jié)嚴格把關。第22頁/共108頁最常用的工業(yè)微生物酵母菌釀酒酵母假絲酵母屬產(chǎn)朊假絲酵母解脂假絲酵母熱帶假絲酵母畢赤酵母屬、漢遜酵母屬：酒精發(fā)酵工業(yè)及釀造工業(yè)的有害菌第23頁/共108頁1、酵母菌形態(tài)：酵母菌是一群單細胞的真核微生物,其形態(tài)因種而異.通常為圓形、卵圓形或橢圓形。也有特殊形態(tài)，如檸檬形、三角形、藕節(jié)狀、臘腸形，假菌絲等。酵母菌第24頁/共108頁假菌絲:酵母菌在一定條件下培養(yǎng)，產(chǎn)生的芽體與母細胞不分離形成的特殊形態(tài)。第25頁/共108頁啤酒酵母的菌落紅酵母的菌落各種酵母菌的菌落第26頁/共108頁酵母菌菌落第27頁/共108頁最常用的工業(yè)微生物霉菌曲霉屬米曲霉黑曲霉青霉屬青霉菌：點青霉、產(chǎn)黃青霉桔青霉根霉屬德氏根霉米根霉、小麥曲根霉紅曲霉屬紫紅曲霉第28頁/共108頁第29頁/共108頁第30頁/共108頁最常用的工業(yè)微生物放線菌鏈霉菌屬小單孢菌屬地中海諾卡氏菌米蘇里游動放線菌第31頁/共108頁第32頁/共108頁第33頁/共108頁第34頁/共108頁

未培養(yǎng)微生物定義：指迄今所采用的微生物純培養(yǎng)分離及培養(yǎng)方法還未獲得純培養(yǎng)的微生物，其在自然環(huán)境微生物群落中占有非常高的比例，約為99％。研究方法①模擬自然培養(yǎng)法:

原位培養(yǎng)、培養(yǎng)條件優(yōu)化、單細胞操作②宏基因組分析法第35頁/共108頁二、發(fā)酵工業(yè)菌種分離篩選原則與基本技術（一）發(fā)酵工業(yè)菌種篩選的總趨勢與要求（二）分離篩選原理與技術（三）應用舉例第36頁/共108頁

1.菌種選擇的總趨勢野生菌→變異菌自然選育→代謝控制育種誘發(fā)基因突變→基因重組的定向育種

第37頁/共108頁純凈健壯產(chǎn)量質量穩(wěn)定2易于控制培養(yǎng)條件,周期短3對誘變劑敏感4抗污染力強5原料廉價,生長迅速,目的產(chǎn)物產(chǎn)量高6不是病原菌12、微生物工業(yè)對菌種的要求7產(chǎn)物分泌型第38頁/共108頁工業(yè)菌種的改良方法解除或繞過代謝途徑中的限速步驟：通過增加特定基因的拷貝數(shù)或增加相應基因的表達能力來提高限速酶的含量；在代謝途徑中引伸出新的代謝步驟，由此提供一個旁路代謝途徑。增加前體物的深度。改變代謝途徑，減少無用副產(chǎn)品的生成以及提高菌種對高深度的有潛在毒物的底物、前體或產(chǎn)品的耐受力。第39頁/共108頁抑制或消除產(chǎn)品分解酶。改進菌種外泌產(chǎn)品的能力。消除代謝產(chǎn)品的反饋抑制，如誘導代謝產(chǎn)品的結構類似物抗性。工業(yè)菌種的改良方法第40頁/共108頁（二）分離篩選原理與技術1.篩選的指導思想2.分離篩選工作在實際中應用的幾個方面3.

新種分離篩選原理與技術第41頁/共108頁1.篩選的兩種指導思想

先分離純化，再結合工藝要求進行篩選。分離純化同時富于篩選條件，一步得出所需菌株。結果有兩種可能：獲得適于工業(yè)發(fā)酵菌株只獲得選育所需的出發(fā)菌株

第42頁/共108頁2.分離篩選工作在實際中應用的幾個方面從被污染的生產(chǎn)及科研用菌中分離目的菌；

生產(chǎn)中長期使用的菌種的定期分離篩選；從各種育種方法處理的微生物材料中分離篩選適于工業(yè)目的的優(yōu)良菌株；從保藏機構獲取菌種好處：經(jīng)濟性、指導性從已知菌種和大自然中分離新菌株尋找新的發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)生菌；尋找老產(chǎn)品的新的優(yōu)良菌株。第43頁/共108頁國際承認的中國培養(yǎng)物保藏單位武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC。保藏了幾乎所有的培養(yǎng)物。(CCTCC)第44頁/共108頁國際承認的中國培養(yǎng)物保藏單位中科院微生物研究所的中國普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC。保藏有普通菌種。(CGMCC)第45頁/共108頁此外，較著名的中國培養(yǎng)物保藏單位還有中國微生物菌種保藏管理委員會CCCCM——管理機構第46頁/共108頁3.新種分離與篩選的步驟

調查研究（包括資料查閱）

試驗方案設計

含微生物樣品的采集

（如何使樣品中含所需微生物的可能性大？）

樣品預處理（如何在后續(xù)的操作中使這種可能性實現(xiàn)）

菌種分離

第47頁/共108頁

根據(jù)目的菌株及其產(chǎn)物特點分

選擇性分離方法 隨機分離方法

(定向篩選←選擇壓力)

(用篩選方案-檢測系統(tǒng)進行間接分離）

富集液體培養(yǎng)固體培養(yǎng)基條件培養(yǎng)

(初篩)

菌種純化

復篩

第48頁/共108頁

菌種純化初步工藝條件摸索再復篩生產(chǎn)性能測試較優(yōu)菌株1-3株保藏及進一步做生產(chǎn)試驗某些必要試驗和或作為育種的出發(fā)菌株毒性試驗等

第49頁/共108頁（1）含微生物樣品的采集采樣時應注意的問題:土壤微生物的分布采土深度：5~25cm土壤植被情況采樣季節(jié)土壤的酸堿度對于分離篩選新菌種，還存在另兩個選擇標準：土壤來源廣泛在已適應相當苛刻環(huán)境壓力的微生物類群中尋找新菌種第50頁/共108頁采樣1、采樣對象以采集土壤為主。一般園田土和耕作過的沼澤土中，以細菌和放線菌為主；富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長區(qū)和果園內。采樣的對象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。細菌（108）>放線菌（107

）>霉菌（106

）>酵母菌（105

）>藻類（104

）>原生動物（103

）第51頁/共108頁從自然界篩選第52頁/共108頁2、采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。3、采土方式：在選好適當?shù)攸c后，用小薩子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標記，記錄采樣時間、地點、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時分離。第53頁/共108頁（2）樣品的預處理目的：提高分離效率方法：物理方法：熱處理；膜過濾法；離心法化學方法：化學成分增加特定微生物的數(shù)量誘餌法：富集目的菌第54頁/共108頁膜過濾法當樣品中菌數(shù)很低時,可以將一定體積的湖水、海水或飲用水等樣品通過膜過濾器,然后將將膜轉到相應的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng),對形成的菌落進行統(tǒng)計。第55頁/共108頁第56頁/共108頁例如：放線菌的分離篩選，培養(yǎng)基的組成原則大多數(shù)放線菌的分離培養(yǎng)是在貧脊或復雜底物的瓊脂平板上進行的。除嗜溫性放線菌外，其他放線菌一般在培養(yǎng)4-20天內在分離平板上緩慢形成菌落。在放線菌分離瓊脂中通常都加入抗真菌劑制霉菌素或放線菌酮，以抑制真菌的繁殖。選擇性地添加抗生素。分離瓊脂平板制備好后，一般皆應在37℃培養(yǎng)箱中存放3天。第57頁/共108頁放線菌的分離土樣中放線菌的非選擇性分離：土樣風干，磨碎，無菌海綿壓印土樣后壓印平板后培養(yǎng)。植物體上放線菌的分離：無菌取植物組織，干燥以減少細菌數(shù)量，剪碎植物材料后植入平板表層后培養(yǎng)。也可洗下微生物后振蕩培養(yǎng)。水中放線菌的分離：為使所要分離的放線菌的數(shù)量種類增多，一般將水樣離心或濾紙過濾，取離心沉積或濾紙表面沉積進行系列稀釋和涂布。第58頁/共108頁次代培養(yǎng)及純化菌落形成后可根據(jù)肉眼可見的菌落形態(tài)上的差異，作初步的鑒定和區(qū)分。通過高倍放大進行鏡檢，可了解氣生和營養(yǎng)孢子形成情況。成功地分離出各種不同的放線菌屬及種的關鍵是所采集樣本的本身及其分離用的瓊脂培養(yǎng)基；而肉眼識別不同的生長形態(tài)、從而初步地加以鑒定，在分離放線菌時顯得尤為重要。將分離平板上所形成的菌落用經(jīng)火焰灼燒滅菌的鉤形針或無菌牙簽挑取，點接到瓊脂平板上進行影印培養(yǎng)，以進一步篩選和分離。第59頁/共108頁（3）分離方法的選擇

根據(jù)目的菌有無選擇性特征來選擇分離方法菌種的營養(yǎng)特征獨特

生長特征獨特

無選擇性特征根據(jù)產(chǎn)物的特征進行

隨機分離選擇性分離的關鍵：生長培養(yǎng)條件的選擇與控制，從而實現(xiàn)定向富集篩選。選擇性分離

第60頁/共108頁A、選擇性分離原理和技術1、生長條件的選擇與控制原理控制營養(yǎng)成分

控制培養(yǎng)基酸堿度

添加抑制劑

控制培養(yǎng)溫度

控制通氣條件

2、選擇性分離技術富集液體培養(yǎng)技術固體培養(yǎng)技術施加選擇壓力，進行定向篩選

第61頁/共108頁①富集液體培養(yǎng)增加混合菌群中所需菌株數(shù)量的一種技術技術特點：給混合菌群提供一些有利于目的菌株生長或不利于目的菌以外的其他菌型生長的條件培養(yǎng)方式分批培養(yǎng)方式：以最大比生長速率（μmax）篩選，存在選擇壓力的控制、移種時間和次數(shù)等問題連續(xù)培養(yǎng)方式：以比生長速率（μ）篩選第62頁/共108頁

μ

ABS0基質濃度對A、B兩種菌的比生長速率（μ）的影響

當S<S0時，富集什么菌株？當S>S0時，富集什么菌株？連續(xù)培養(yǎng)方式：以比生長速率μ篩選第63頁/共108頁連續(xù)富集培養(yǎng)技術分離菌株的優(yōu)點

分離的菌株特別適合連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)過程有利于分離具有某種工業(yè)生產(chǎn)特性的菌株可以篩選出能共生的穩(wěn)定混合培養(yǎng)物

第64頁/共108頁②固體培養(yǎng)技術常用于分離某些酶產(chǎn)生菌

選擇壓力：在選擇培養(yǎng)基中加入所需酶的基質

第65頁/共108頁隨機分離原理與技術從產(chǎn)物入手，通過設計高產(chǎn)培養(yǎng)基和建立快速靈敏專一的篩選方法，從隨機分離的菌落中篩選出所需的目的菌。技術關鍵：產(chǎn)物合成條件的選擇與控制及相應篩選方法的確定。隨機分離技術舉例

抗生素產(chǎn)生菌的篩選藥理活性化合物產(chǎn)生菌的篩選生長因子產(chǎn)生菌的篩選多糖產(chǎn)生菌的篩選

第66頁/共108頁高產(chǎn)培養(yǎng)基設計的幾個原則

制備一系列的培養(yǎng)基，其中有各種類型的養(yǎng)分成為生長限制因素；使用一聚合或復合形式的生長限制養(yǎng)分；避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代謝物阻遏；確定含有所需的輔因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）；使用pH緩沖劑以減少pH變化；前體、促進劑及抑制劑的采用。第67頁/共108頁抗生素產(chǎn)生菌的篩選篩選模型：試驗菌篩選方法：鋪菌法復印平板法液體培養(yǎng)篩選

抗藥性篩選篩選模型：氨芐青霉素和β-內酰胺酶產(chǎn)生菌（克雷白氏菌）協(xié)同

I II無試樣時（不含棒酸時），I對II菌作用不大有試樣時（含棒酸時），I對II菌恢復藥效，棒酸抑制水解酶活性

固體培養(yǎng)篩選第68頁/共108頁試驗菌代表微生物類型金黃色葡萄球菌209p革蘭氏陽性球菌枯草桿菌6633 革蘭氏陽性桿菌 大腸桿菌革蘭氏陰性腸道細菌恥垢分枝桿菌607

結核桿菌 白色念珠菌 酵母狀真菌 青霉菌

絲狀真菌

第69頁/共108頁藥理活性化合物產(chǎn)生菌的篩選

藥理活性化合物是指能抑制人類代謝中某一個關鍵酶的微生物產(chǎn)物即酶抑制劑，從而達到治療的目的。篩選模型：目標酶第70頁/共108頁生長因子產(chǎn)生菌的篩選

篩選模型：營養(yǎng)缺陷型試驗菌

篩選方法：利用被分離的微生物產(chǎn)物能否促進營養(yǎng)缺陷型試驗菌生長第71頁/共108頁氨基酸產(chǎn)生菌的篩選

樣品

預處理

初篩（除真菌）

在分離平板上生長獲得多個單菌落復印平板（copy法）

平板培養(yǎng)，其中有產(chǎn)生氨基酸的菌落分泌氨基酸對應到copy前相應

u.v線殺死長好的菌落

位置，找到目的菌落

再鋪上一層含營養(yǎng)缺陷型試驗菌的瓊脂

培養(yǎng)后

產(chǎn)氨基酸菌落周圍有生長圈

目的菌落進行液體培養(yǎng)，對產(chǎn)物進行定量測定篩選產(chǎn)物含量高的菌株第72頁/共108頁多糖產(chǎn)生菌的篩選取樣特點：碳水化合物工業(yè)的廢棄物篩選方案：從菌落外觀判斷，選擇外觀呈粘液狀的菌落，然后根據(jù)液體培養(yǎng)測定多糖含量來篩選高產(chǎn)菌。第73頁/共108頁4、幾種典型微生物的分離篩選方法舉例細菌放線菌真菌第74頁/共108頁細菌分離：以乳酸菌為例

取未成熟的醬醪樣品1g至無菌磨口瓶中

加麥芽汁至瓶口處，封塞，25℃培養(yǎng)24-48h培養(yǎng)基中長出絹絲狀波動物，鏡檢桿狀，陽性染色初步斷定乳酸菌

用選擇性培養(yǎng)基分批富集培養(yǎng)2-3代稀釋分離法分離單菌落，培養(yǎng)基為含麥芽汁、CaCO3的瓊脂培養(yǎng)基

根據(jù)透明圈挑選菌落

性能測定（鏡檢桿狀，染色陽性；乳酸紙層析鑒定）

Rf值定性（有機酸呈黃斑點）

乳酸生成量測定（滴定法）第75頁/共108頁放線菌的分離：

以產(chǎn)鏈霉素菌種的分離為例

（從退化菌種中篩選）

取工業(yè)發(fā)酵液（含孢子）樣品1環(huán)放入帶玻璃珠的裝有10ml無菌水的小三角瓶中，搖勻

采用稀釋法制平板，獲取單菌落

斜面保藏高產(chǎn)菌恢復根據(jù)高產(chǎn)菌的特點，選擇目的菌落放大培養(yǎng)，發(fā)酵液性能測試篩選模型：形態(tài)依據(jù)第76頁/共108頁真菌的分離篩選：以啤酒酵母的分離為例

取發(fā)酵液少許以10倍稀釋成10-1-10-7

稀釋分離法取0.1ml加入固體培養(yǎng)基鋪平皿（×2）

在麥芽汁固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)48-72h

形態(tài)篩選根據(jù)正常株特點進行挑選，接種斜面?zhèn)溆?/p>

純化，采用平板分離法進一步純化，至少反復三次

①生成子囊孢子速度測定 ②發(fā)酵力測定性能測定③熱死溫度測定 ④凝集力測定 ⑤雙乙酰含量測定第77頁/共108頁菌種選育改良的具體目標提高目標產(chǎn)物的產(chǎn)量提高目標產(chǎn)物的純度，減少副產(chǎn)物改良菌種性狀，改善發(fā)酵過程改變生物合成途徑，以獲得高產(chǎn)的新產(chǎn)品第78頁/共108頁

第二節(jié)發(fā)酵高產(chǎn)菌種選育常規(guī)育種(誘變育種)細胞工程育種基于代謝調節(jié)的育種技術基因工程育種蛋白質工程育種代謝工程育種

第79頁/共108頁選擇育種方法時綜合考慮的因素(1)待改良性狀的本質及與發(fā)酵工藝的關系(如批式或連續(xù)發(fā)酵試驗)；

(2)對這一特定菌種的遺傳和生物化學萬面認識的明了程度；

(3)經(jīng)濟費用。如果對特定菌種的基本性狀及其工藝知曉甚少，則多半采用隨機誘變、篩選及選育等技術：如果對其遺傳及生物化學方面的性狀已有較深的認識，則可選擇基因重組等手段進行定向育種。第80頁/共108頁誘變育種以微生物的自然變異作為基礎的生產(chǎn)選種的機率并不很高，一個基因的自然突變頻率僅10-6-10-10左右。誘變育種：以誘發(fā)突變?yōu)榛A的育種，是迄今為止國內外提高菌種產(chǎn)量、性能的主要手段。第81頁/共108頁誘變物理、化學或生物誘變方法第82頁/共108頁

一、誘變劑和誘變處理

物理誘變劑：射線如紫外線、X—射線、γ—射線，快中子；物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外線。許多高產(chǎn)菌株的選育都用過紫外線，對于一般實驗室、中小型工廠都適用，也很安全。其他的幾種射線都是電離性質的，有一定的穿透力，一般都由專業(yè)人員在專門的設備中使用，否則有一定危險性。第83頁/共108頁化學誘變劑：化學因子如堿基類似物、5—氟尿嘧啶、烷化劑等?；瘜W誘變劑中使用最多、最有效的是烷化劑。使用化學誘變劑的優(yōu)缺點：1、大多數(shù)情況下，就突變數(shù)量而言，要比電離輻射更有效。

第84頁/共108頁化學誘變劑：

化學因子如堿基類似物、5—氟尿嘧啶、烷化劑等。化學誘變劑中使用最多、最有效的是烷化劑。1、大多數(shù)情況下，就突變數(shù)量而言，要比電離輻射更有效。2、化學誘變劑是很經(jīng)濟的，因為只需要少量的合適的誘變劑，設備是實驗室的一般玻璃器皿，一個蒸氣罩。而用電離輻射±行工作時，設備費用大，并要注意安全性。3、大部分誘變劑是致癌劑，所以在使用中必須非常謹慎，要避免化學誘變劑與皮膚接觸，，且切勿吸入其蒸氣，有人對某些誘變劑極其敏感，甚至未直接接觸就會過敏，這就更要當心。第85頁/共108頁誘變劑的選擇1．堿基類似物和羥胺具有很高的特異性，但很少使用，回復突變率高，效果不大。2．亞硝酸和烷化劑應用的范圍較廣，造成的遺傳損傷較多。其中亞硝基胍和甲基磺酸乙酯常被稱為“超誘變劑”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的誘變劑之一。3．吖啶類誘變劑可以造成生化代謝途徑的完全中斷。4．紫外線仍十分有效。電離輻射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑，它能造成不可回復的缺突變。但它可能影響鄰近基因的性能。第86頁/共108頁誘變育種的基本方法出發(fā)菌株的選擇處理菌懸液的制備誘變處理中間培養(yǎng)分離和篩選第87頁/共108頁(一)出發(fā)菌株的選擇1．自然界新分離的野生型菌株，對誘變處理較敏感，容易達到好的效果。2．在生產(chǎn)中經(jīng)生產(chǎn)選種得到的菌株與野生型較相像，也是良好的出發(fā)菌株。3．每次誘變處理都有一定提高的菌株，往往多次誘變能積累較多的提高。4．出發(fā)菌株開始時可以同時選2～3株，在處理比較后，將更適合的出發(fā)菌株留作繼續(xù)誘變。第88頁/共108頁5．要盡量選擇單倍體細胞、單核或核少的多細胞體來作出發(fā)誘變細胞，這是由于變異性狀大部分是隱性的，特別是高產(chǎn)基因。

6．根據(jù)采用的誘變劑或根據(jù)細胞生理狀態(tài)或誘變譜選擇誘變劑，因為同一誘變劑的重復處理會使細胞產(chǎn)生抗性，使誘變效果下降。有的誘變劑是作用于營養(yǎng)細胞，就要選對數(shù)期的細胞：有的作用于休止期，就可選用孢子。第89頁/共108頁

(二)處理菌懸液的制備這一步驟的關鍵是制備單細胞和單孢子狀態(tài)的、活力類似的菌懸液，為此要進行合適培養(yǎng)基的培養(yǎng)，并要離心，洗滌，過濾。第90頁/共108頁(三)誘變處理結合誘變對象的實際，設計誘變處理方案。第91頁/共108頁

(四)中間培養(yǎng)

由于在發(fā)生了突變尚未表現(xiàn)出來之前，有一個表現(xiàn)延遲的過程，即細胞內原有酶量的稀釋過程(生理延遲)，需3代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來。這個過程對今后的篩選和獲得穩(wěn)定菌株都是極為重要的。第92頁/共108頁

方法措施：讓變異處理后細胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時，以讓細胞的遺傳物質復制，讓細胞繁殖幾代，以得到純的變異細胞。這樣，隱性的變異就會顯現(xiàn)出來，若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng)，直接在平皿上分離就會出現(xiàn)變異和不變異細胞同時存在于一個菌落內的可能，形成混雜菌落，以致造成篩選結果的不穩(wěn)定和將來的菌株退化。第93頁/共108頁(五)分離和篩選篩選分初篩和復篩。初篩以迅速篩出大量的達到初步要求的分離菌落為目的，以量為主。復篩則是精選，以質為主，也就是以精確度為主。因此在具體方法上就有差異.

例如初篩可以在平皿上直接以菌落的代謝產(chǎn)物與某些染料或基質的作用形成的變色圈或透明圈的大小來挑取參加復篩者，而將90%的菌落淘汰。在數(shù)量減少后就要仔細比較參加復篩和再復篩的菌株，最后才能選得優(yōu)秀菌株。在以后的復篩階段，還應不斷結合自然分離，純化菌株。第94頁/共108頁（1）營養(yǎng)缺陷型的選育營養(yǎng)缺陷型是指通過誘變而產(chǎn)生的缺乏合成某些營養(yǎng)物質如氨基酸、維生素和堿基等的能力，必須在其基本培養(yǎng)基中加入相應的營養(yǎng)成分才能正常生長的變異株。與營養(yǎng)缺陷型對應的是野生型。能滿足野生型菌株正常生長的培養(yǎng)基稱基本培養(yǎng)基(MM)；在基本培養(yǎng)基中加入相應的營養(yǎng)成分的稱補充培養(yǎng)基(SM)；能滿足各種營養(yǎng)缺陷型生長的稱完全培養(yǎng)基(CM)，如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基等。第95頁/共108頁營養(yǎng)缺陷型的用途

營養(yǎng)缺陷型在生產(chǎn)上和科學研究上用途很大。目前生產(chǎn)氨基酸、核苷酸的菌種都是各種類型的缺陷型。要研究代謝途徑，育種技術都必須有營養(yǎng)缺陷型的菌株為材料。第96頁/共108頁篩選營養(yǎng)缺陷型的步驟誘變淘汰野生型檢出缺陷型確定生長譜具體方法：影印法、點種法、夾層法第97頁/共108頁賴氨酸生產(chǎn)菌種的選育改良思路出發(fā)菌株：黃色短桿菌、谷氨酸棒桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌育種思路

1.優(yōu)先合成的轉換——滲漏缺陷型的選育

2.切斷支路代謝——營養(yǎng)缺陷型的選育：高絲氨酸缺陷型

3.抗結構類似物突變株的選育：AEC4.解除代謝互鎖：Leu-、

抗Leu結構類似物、喹啉s

、苯醌s5.增加前體物的合成和阻塞副產(chǎn)物的生成：

Ala-、抗Asp結構類似物

選育適宜的CO2固定酶/TCA循環(huán)酶活性比突變株

6.改善細胞膜的透過機能

7.選育溫度敏感突變株

8.應用細胞工程和基因工程育種

第98頁/共108頁第99頁/共108頁選育適宜的CO2固定酶/TCA循環(huán)酶活性比突變株賴氨酸合成中間代謝有以下兩條途徑：①通過TCA循環(huán)葡萄糖丙酮酸草酰乙酸天冬氨酸

賴氨酸②通過磷酸烯醇丙酮酸羧化反應葡萄糖磷酸烯醇草酰乙酸天冬氨酸式丙酮酸