微生物實驗實驗一顯微鏡使用與微生物形態(tài)觀察

實驗一顯微鏡的使用及微生物形態(tài)觀察

一.目的

1.了解普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造，學(xué)習(xí)顯微鏡的使用方法和保養(yǎng)。（高、低倍鏡的使用）2.觀察藍細菌、霉菌、酵母菌、放線菌的個體形態(tài)，學(xué)會生物圖的繪制。二.實驗器材

1.光學(xué)顯微鏡2.示范片：顫藻、曲霉、青霉、酵母菌、放線菌。第一頁，共35頁。三.實驗內(nèi)容(一)顯微鏡的構(gòu)造和使用方法1.構(gòu)造機械部分:鏡筒(雙筒，兩筒間距離可調(diào)，上裝有目鏡）轉(zhuǎn)換器（3孔，裝有物鏡）載物臺（中央圓孔、彈簧夾、移動器）調(diào)節(jié)器（粗調(diào)、細調(diào)）鏡臂（支撐作用）鏡座（上有光源，亮度可調(diào)）光學(xué)部分：目鏡（10×、16×）物鏡（低倍鏡10×、高倍鏡40×、油鏡100×）聚光器（內(nèi)有光圈調(diào)節(jié)）光源（光量可調(diào)）

第二頁，共35頁。

顯微鏡放大倍數(shù)=目鏡放大倍數(shù)×物鏡放大倍數(shù)

物鏡上的標(biāo)識：

1.25(0.65、0.25)100(40、10）160/0.17

↓↓↓↓

數(shù)值孔徑放大倍數(shù)鏡筒長蓋玻片厚度

數(shù)值孔徑：N.A.=n﹒sinα/2

n—玻片和物鏡之間的折射率。

α—光線最大射入角。

分辨率（最大可分辨距離）＝λ/N.A.

λ—波長

第三頁，共35頁。

2.顯微鏡的使用

低倍鏡的使用

（1）雙手取出顯微鏡置于實驗臺上，接上電源，打開開關(guān)，調(diào)節(jié)合適光量。

（2）轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器，將低倍鏡移至正下方。調(diào)節(jié)兩目鏡鏡筒間的距離。

（3）將載玻片放在載物臺上夾住，移動觀察對象于圓孔正中。

（4）側(cè)視物鏡，轉(zhuǎn)動粗調(diào)將載物臺上移，至載玻片距物鏡頭約５ｍｍ時停止。

（5）雙眼向目鏡里觀察，同時旋轉(zhuǎn)粗調(diào)節(jié)器使載物臺緩慢下移，若標(biāo)本顯出但不清晰，可用細調(diào)節(jié)器調(diào)至清晰。若粗調(diào)旋轉(zhuǎn)太快，超過焦點沒有看到標(biāo)本，則必須重復(fù)（4）、(5)步驟。不能在眼睛觀察目鏡的同時旋轉(zhuǎn)粗調(diào)，以防物鏡與載玻片相碰撞，造成損壞。

第四頁，共35頁。

高倍鏡的使用

在用低倍鏡找到觀察目標(biāo)后，若需要進一步放大觀察，將其移到視野中央。用轉(zhuǎn)換器將高倍鏡移到鏡筒下方，將光量調(diào)大一點。若標(biāo)本不清晰，用細調(diào)上下轉(zhuǎn)動使之清晰。（此時不再動粗調(diào)）

３．顯微鏡的維護

（１）將載物臺降至最低，取下標(biāo)本片。

（２）將光量調(diào)至最小，關(guān)上電源。

（３）用鏡頭紙先檫目鏡、物鏡，再擦顯微鏡其它部分。

（４）將顯微鏡放入鏡箱，還原。第五頁，共35頁。（二）微生物形態(tài)的觀察

1.

用低倍鏡和高倍鏡觀察顫藻、曲霉、青霉、酵母菌、放線菌、星藻示范片。

2.

畫出微生物形態(tài)圖，并標(biāo)明顯微鏡的放大倍數(shù)。10╳10

顫藻第六頁，共35頁。實驗二活性污泥生物相的觀察

一.目的1.學(xué)習(xí)測量微生物大小。2.學(xué)習(xí)用壓滴法制作標(biāo)本片。3.觀察幾種原、后生動物，菌膠團及藻類個體形態(tài)。

二.實驗器材1.活性污泥混合液。2.單胞藻、新月藻、草履蟲等示范片。3.顯微鏡、載玻片、蓋玻片。

4.目測微尺、物測微尺。第七頁，共35頁。

三.實驗內(nèi)容1.微生物大小的測定(1)標(biāo)定目鏡測微尺裝在目鏡上的目測微尺中央刻有等分為100格或更多格的標(biāo)尺，使用前要用物測微尺標(biāo)定。物測微尺中央刻有1mm長的標(biāo)尺，等分為100格，10μm／格。將物測微尺的刻度朝上放在載物臺上，用低倍鏡找出物測微尺的刻度，移動物測微尺使其第一條線與目測微尺的第一條線重合，順著刻度線找出另一條重合線。算出低倍鏡下目測微尺每格的長度。換高倍鏡用同樣方法標(biāo)定出高倍鏡下目測微尺每格的長度。第八頁，共35頁。測微尺示意圖(2)微生物大小的測量

將物測微尺取下，換上標(biāo)本片，選擇適當(dāng)物鏡測量微生物的長度和寬度占目測微尺的格數(shù)，再按目測微尺1格的長度算出微生物的長度和寬度。第九頁，共35頁。

2.壓滴法觀察活性污泥中生物相

（1）壓滴法制作標(biāo)本片用滴管取活性污泥混合液一小滴，放在載玻片中央。取一塊蓋玻片先將一邊與混合液接觸，然后慢慢將蓋玻片放下使其蓋在混合液上。片內(nèi)不能有氣泡。（2）觀察活性污泥中生物相先用低倍鏡觀察活性污泥中菌膠團、原生動物、后生動物。畫出所觀察到的生物形態(tài)圖。標(biāo)明名稱、放大倍數(shù)和微生物的大小。第十頁，共35頁。四.實驗結(jié)果

1.低、高倍鏡下目測微尺每格的長度。

2.畫出2~3種污泥中所觀察到的生物形態(tài)圖。標(biāo)明名稱、放大倍數(shù)和微生物的大小。

3.畫出兩種藻類生物形態(tài)圖，標(biāo)明名稱、放大倍數(shù)和微生物的大小。。3.觀察幾種藻類的個體形態(tài)觀察幾種藻類的個體形態(tài)，畫出生物形態(tài)圖，標(biāo)明名稱、放大倍數(shù)。第十一頁，共35頁。實驗三微生物的染色

一.目的1.學(xué)習(xí)微生物的染色技術(shù)，掌握微生物的單染色法和革蘭氏染色法。2.學(xué)習(xí)油鏡的操作。第十二頁，共35頁。二．染色原理和油鏡的工作原理1．油鏡工作原理

油鏡的放大倍數(shù)最大（100），故鏡頭焦距短，直徑小,但所需光照強度卻最大。從標(biāo)本片透過的光線是從玻片進入空氣，再進入鏡頭。由于玻璃和空氣的介質(zhì)密度不同，有些光會因折射或反射而不能進入鏡頭。物象就顯現(xiàn)不清。為了不使通過的光線有所損失，須在油鏡與玻片之間加入折射率和玻璃(n=1.52）相仿的香柏油(n=1.515)。故而稱之為“油鏡”。第十三頁，共35頁。

2．單染色法：微生物不但個體微小，且無色半透明。要在顯微鏡下觀察清楚，必須染上顏色。微生物細胞中含有大量的蛋白質(zhì)等一類兩性電解質(zhì)：在酸性溶液中結(jié)合質(zhì)子帶正電；在堿性溶液中給出質(zhì)子而帶負電。等電點一般在pH=2~5。所以，在中性、堿性或弱酸性溶液中，微生物細胞通常帶負電荷。堿性染料在電離時，染色部分是帶正電荷的，容易與帶負電荷的菌體結(jié)合使之著色。經(jīng)染色后的菌體細胞與背景形成鮮明的對比，在顯微鏡下很容易觀察。第十四頁，共35頁。

3．革蘭氏染色法：

革蘭氏染色法將細菌分為G＋和G-，這由兩類細菌細胞壁的結(jié)構(gòu)和組成的不同而決定。用結(jié)晶紫初染后，所有的細菌都染上藍紫色。碘作為媒染劑能與結(jié)晶紫結(jié)合形成結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物，增強了染料與菌體的結(jié)合力。用乙醇脫色處理時，兩類細菌的脫色效果是不同的。G＋細菌的細胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成，且壁厚、類脂含量低，用乙醇脫色時使細胞壁脫水、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑縮小，通透性降低，使得結(jié)晶紫—碘的復(fù)合物不易被洗脫而保留在細胞內(nèi)。雖經(jīng)洗脫和復(fù)染仍然保持初染劑的藍紫色。G-細菌則不同，由于其細胞壁肽聚糖層較薄，類脂含量高，所以在脫色處理時，類脂被乙醇溶解，細胞壁的通透性增大，使結(jié)晶紫—碘的復(fù)合物比較容易被洗脫出來，用復(fù)染劑復(fù)染后，細胞被染上復(fù)染劑的顏色。第十五頁，共35頁。三．實驗器材1．顯微鏡、香柏油、接種環(huán)、酒精燈等。2．結(jié)晶紫染液、碘液、95%乙醇、沙黃染液。3．菌種：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌。第十六頁，共35頁。四．實驗內(nèi)容

(一)單染色1．涂片取一塊載玻片，用記號筆劃分出兩區(qū)域并做上記號，在兩區(qū)域中央各滴半滴無菌水，用接種環(huán)以無菌操作法分別取兩種菌種在左右兩滴水中，和勻后涂成薄膜。

2．干燥室溫自然干燥或吹干。3．固定涂面朝上，通過火焰2~3次。4．染色在涂片薄膜上滴加結(jié)晶紫染液，使之覆蓋2分鐘。5．水洗傾倒去染液，斜置載玻片，用洗瓶小水流沿玻片邊緣沖洗，直至水呈無色為止。

6．干燥室溫自然干燥或用吸水紙吸干。第十七頁，共35頁。

(二)革蘭氏染色

完成單染色的1~6步驟后

7.媒染加媒染劑碘液使之覆蓋1分鐘，水洗，吸水紙吸干。

8.脫色滴加95%乙醇數(shù)滴使之覆蓋16秒鐘，立即水洗,吸干。

9.復(fù)染用沙黃（番紅）液復(fù)染2分鐘，水洗，吸干。

第十八頁，共35頁。(二)鏡檢

先分別用低倍鏡和高倍鏡找到要觀察的樣品區(qū)域后，用轉(zhuǎn)換器將物鏡轉(zhuǎn)到空擋，在樣品區(qū)域滴加香柏油，再將油鏡慢慢轉(zhuǎn)到工作位置浸入油中。若不清晰，慢慢轉(zhuǎn)動微調(diào)直至清楚。油鏡用完后，用鏡頭紙沾取乙醇-乙醚混合液檫拭油鏡頭。再用干的鏡頭紙檫干鏡頭。第十九頁，共35頁。

五．實驗結(jié)果

觀察兩種細菌的形態(tài)和顏色，繪出油鏡下細菌形態(tài)圖，說明革蘭氏染色的結(jié)果。

六．思考題

通過實驗，你認為革蘭氏染色成功關(guān)鍵是那一步？為了避免假陽性或假陰性出現(xiàn)，在對未知菌種做革蘭氏染色鑒定時，你認為應(yīng)該怎樣做？第二十頁，共35頁。實驗四微生物的計數(shù)

（顯微鏡直接計數(shù)法）

一．目的

1.了解血球計數(shù)板的計數(shù)原理，掌握血球計數(shù)板的計數(shù)方法。2.觀察酵母菌的形態(tài)，學(xué)習(xí)區(qū)分酵母菌死活細胞的方法。二.實驗器材

顯微鏡、血球計數(shù)板、酵母菌液、美藍染液、蓋玻片。

第二十一頁，共35頁。

三．原理

1.血球計數(shù)板計數(shù)原理血球計數(shù)板是一塊特制的載玻片，有四條豎槽和一條橫槽。橫槽兩邊的平臺上各有一個有九個大方格的方格網(wǎng)，中間大方格為計數(shù)室：邊長為１ｍｍ，深為0.1mm，容積為0.1mm3(10-4ml)。計數(shù)室有兩種規(guī)格：一是分為16個中方格，每中方格中有25個小方格；另一種是分為25個中方格，每中方格有16個小方格。兩種都共有400個小方格。第二十二頁，共35頁。

計數(shù)：

數(shù)出5個中方格中的總菌數(shù)A，若菌液的稀釋倍數(shù)為B，則計算公式如下：

(1)25個中方格的計數(shù)板計算公式(2)16個中方格的計數(shù)板計算公式第二十三頁，共35頁。

2.區(qū)分酵母菌死活細胞基本原理美藍是一種無毒性的染料，它的氧化型呈藍色，還原型是無色。用美藍對酵母菌的活細胞進行染色時，由于細胞的新陳代謝作用，細胞內(nèi)具有較強的還原能力，能使美藍由藍色的氧化型變成無色的還原型。因此，具有還原能力的酵母活細胞是無色的或淡藍色，而死細胞或代謝作用的衰老細胞則呈藍色，借此即可對酵母菌的死細胞和活細胞進行鑒別。第二十四頁，共35頁。

四.實驗內(nèi)容

1.酵母菌的形態(tài)觀察及死活細胞的鑒別(1)在載玻片上加半滴美藍染液，在染液上滴一滴菌液。取一塊蓋玻片，先將一邊與菌液接觸，然后慢慢將蓋玻片放下蓋在菌液上。(2)將標(biāo)本片放3分鐘后，先用低倍鏡然后用高倍鏡觀察酵母菌的形態(tài)和出芽情況，并根據(jù)顏色來區(qū)別死活細胞。

第二十五頁，共35頁。

2.酵母菌液的計數(shù)

(1)鏡檢計數(shù)室對計數(shù)板進行鏡檢。若有污物，則用自來水沖洗，用電吹風(fēng)吹干后才能進行計數(shù)。(2)加樣品

在血球計數(shù)板上蓋上蓋玻片,用滴管將搖勻的酵母菌液由蓋玻片邊的小槽滴一小滴,菌液會自動進入計數(shù)室，靜置5分鐘。

(3)計數(shù)將血球計數(shù)板置于載物臺上，先用低倍鏡找到計數(shù)室的位置，再換高倍鏡計數(shù)。每計數(shù)室計5個中格（四角和中間）。計數(shù)原則：計上不計下，計左不計右。芽體占母細胞一半時算一個。

(4)清洗血球計數(shù)板

計數(shù)后將血球計數(shù)板用自來水沖洗干凈，勿用硬物刷，吹干后鏡檢。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌干凈為止。第二十六頁，共35頁。

五.結(jié)果記錄

1.2.酵母菌死活細胞的比例？六.思考題用此法計數(shù)的結(jié)果是活菌體還是死、活菌體的總和？第二十七頁，共35頁。實驗五活性污泥不同微生物種群的分離培養(yǎng)與鑒別

一.目的

1．掌握配制培養(yǎng)基和制備無菌水的方法。2.學(xué)會玻璃器皿的干熱滅菌和培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌技術(shù)。3.學(xué)習(xí)倒平板的方法和兩種分離微生物的基本操作技術(shù)。4.學(xué)習(xí)微生物純種分離、培養(yǎng)及菌落的觀察。第二十八頁，共35頁。

二.實驗器材1.培養(yǎng)皿、試管、吸管、錐形瓶等。2.牛皮紙等包扎材料。3.10%HCl、10%NaOH、精密pH試紙。4.牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂。5.高壓蒸汽滅菌鍋等。6.活性污泥。7．接種環(huán)、酒精燈、恒溫箱(培養(yǎng)箱)等。8．結(jié)晶紫染液。9.顯微鏡、載玻片第二十九頁，共35頁。

三.實驗內(nèi)容

（一）培養(yǎng)基的制備及滅菌1.玻璃器皿的包扎與滅菌（1）六套培養(yǎng)皿一組,用報紙包裝。（2）取四支吸量管，在其吸端塞少許棉花后用長報紙條包扎。（3）干熱滅菌:上述玻璃器皿在160°C烘箱內(nèi)2小時。

2.無菌水的制備在3支試管中各裝入9ml自來水，塞上硅膠塞,同下述培養(yǎng)基一起用高壓蒸汽滅菌。第三十頁，共35頁。3.培養(yǎng)基的制備

⑴稱量：牛肉膏蛋白胨NaCl瓊脂自來水0.75g1.5g0.75g3g150ml

⑵溶化：用燒杯在電爐上將上述各物依次溶解，注意補充水。

⑶調(diào)pH值：

溶液稍冷后用pH試紙、10%NaOH或10%HCl調(diào)整溶液的pH在7.6左右。

⑷分裝：試管4支各裝其高度1/5的溶液，其余溶液裝錐形瓶。

⑸加塞包扎：錐形瓶加棉塞并用牛皮紙包扎。

⑹濕熱滅菌：（高壓蒸汽滅菌）1.05kg/cm2(103kPa)、

121℃滅菌20min。

⑺擱置斜面：

試管培養(yǎng)基冷至50℃時斜擱使斜面長度不`超過試管一半。第三十一頁，共35頁。（二）微生物的分離、培養(yǎng)及形態(tài)觀察1.平板劃線分離法

(1)倒平板:將融化并冷至50℃的細菌培養(yǎng)基倒約15~20ml于無菌培養(yǎng)皿中，立即放在桌上輕輕轉(zhuǎn)動使之均勻。冷后成平板。（3個）(2)劃線：在火焰旁，左手拿平板，右手拿接種環(huán)，取一環(huán)菌液（原污水）在平板上劃線。常用的方法有如下三種：劃線完畢后蓋上皿蓋，倒置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)48小時后觀察結(jié)果。第三