有機(jī)酸測(cè)定2-4課件

第四章有機(jī)酸和維生素的分析

第一節(jié)概述果實(shí)具有酸味，是因?yàn)楹懈鞣N有機(jī)酸，其中以檸檬酸、蘋(píng)果酸、酒石酸為主，這三種酸通稱為果酸，此外，還有草酸、水楊酸及少量的揮發(fā)性蟻酸、醋酸、丁酸，這些揮發(fā)酸含量雖少，但它們的酯類則是重要的芳香物質(zhì)，給予果實(shí)特有香氣。一定的酸度含量能使農(nóng)產(chǎn)品、食品具有一定的風(fēng)味,質(zhì)地和色澤,如：蘋(píng)果中所含的蘋(píng)果酸;檸檬中所含的檸檬酸等成分,它們使這些水果具有人們喜愛(ài)的酸味和酸甜味。有機(jī)酸具有防腐和抗氧化作用，但過(guò)量時(shí)又顯示出不良的品質(zhì)。測(cè)定果蔬的酸度及其與糖含量的比值，能判斷果蔬的成熟度和品質(zhì)。如：采后隨著時(shí)間延長(zhǎng)，因生理作用，其可滴定酸含量急劇下降，肉質(zhì)淡而無(wú)味；低溫貯藏和氣調(diào)貯藏能明顯延緩可滴定酸的代謝消耗.

果實(shí)酸味的強(qiáng)弱，并非決定于酸的總含量，而是決定它的酸堿值的高低，即氫離子的離解度大小，氫離子愈多則愈酸。不過(guò)果實(shí)中含有各種緩沖物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、氨基酸等成分，能起一定的緩沖作用。但當(dāng)果實(shí)或果汁加熱或煮熟時(shí)，由于蛋白質(zhì)凝固，失去了緩沖作用，同時(shí)因溫度升高，也促進(jìn)酸的離解，則氫離子增加使得果實(shí)酸味增大。

在同一種果實(shí)中，其所含的有機(jī)酸并非是單純某一種，往往數(shù)種同時(shí)存在。但在分析測(cè)定果實(shí)中的含量時(shí)，多以果實(shí)所含的主要有機(jī)酸種類為計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)。如檸檬酸含于柑橘類、石榴、鳳梨等果實(shí)中；蘋(píng)果酸主含于仁果類、核果類；酒石酸為葡萄的主要有機(jī)酸，故也稱為葡萄酸.

新鮮果實(shí)及其加工品的風(fēng)味，主要決定于糖分和酸分的比例（簡(jiǎn)稱糖酸比）。在加工過(guò)程中，酸分的存在可以促使蔗糖的轉(zhuǎn)化和果膠物質(zhì)的水解，還能與金屬化合而影響制品的風(fēng)味和色澤。在處理高酸分的果實(shí)時(shí)，對(duì)于所用的器械、用具和儀器，最好是非金屬的。氫離子的存在對(duì)微生物的活動(dòng)是非常不利的，可以降低微生物的致死溫度，一般果實(shí)pH值為2.5-5.0之間，加熱至100℃后便能達(dá)到殺菌的效果。糖和有機(jī)酸是果汁中主要的風(fēng)味營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其含量高低與果汁制品的品質(zhì)有密切的關(guān)系。因此，糖和有機(jī)酸含量的測(cè)定是國(guó)內(nèi)外果汁生產(chǎn)企業(yè)極為關(guān)注的問(wèn)題之一。植物體內(nèi)有機(jī)酸含量分析是近幾年來(lái)研究的熱點(diǎn),尤其是在逆境生理方面，果實(shí)中有機(jī)酸種類與含量也是衡量果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)。人們?cè)谖队X(jué)中的酸度，主要不取決于酸的總量，而是取決于離子狀態(tài)的那一部分酸(游離酸)，一般以氫離子濃度(pH值)來(lái)表示，稱為有效酸度。測(cè)定pH值的方法很多，其中以pH計(jì)較為準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便。各種有機(jī)酸的分離和定量。通常用柱層析法、紙層析法、氣相色譜法和羧酸分析儀法。

常規(guī)的酸度分析包括總酸度(可滴定酸度)、有效酸度(氫離子活度、pH值)和揮發(fā)性酸。

總酸度即可滴定酸度,它簡(jiǎn)單，實(shí)用，總酸度是所有酸性成分的總量，通常用標(biāo)準(zhǔn)堿來(lái)測(cè)定，并以酚酞指示劑指示其滴定終點(diǎn),以此進(jìn)行定性、定量分析,是一種強(qiáng)堿弱酸的中和滴定反應(yīng);并以樣品中所含主要酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(％)表示。但有的農(nóng)產(chǎn)品由于緩沖作用和色素的影響，往往難以判斷滴定終點(diǎn)，在這種情況下，可以使用電位滴定法。代表了樣品中所含各種酸的總和,而不能全面地準(zhǔn)確地表達(dá)農(nóng)產(chǎn)品中所含各種酸的確切的含量?？偹岫龋瑩]發(fā)酸和有效酸度的pH值都是酸度的表達(dá)方式,它們之間有一定的內(nèi)在聯(lián)系,即都表示了被測(cè)物中酸度的大小,但是,它們?cè)诤x上卻有不同之處，酸度中的總酸度的測(cè)定都是在測(cè)定過(guò)程中,被檢樣品中的酸性成分和強(qiáng)堿的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行中和反應(yīng),定量地得出其中含酸成分的大概含量(因都以所含主要有機(jī)酸計(jì)算的),這些酸的成分不管它們的酸性強(qiáng)弱,氫離子離解度的大小,都同樣在強(qiáng)堿弱酸的中和滴定中反映到測(cè)定結(jié)果中。而有效酸度中的pH值卻只表示了被測(cè)樣品中氫離子濃度的大小，相同總酸度的不同樣品中,由于所含的酸的種類不同,從理論上講,它們的pH值也會(huì)有所差異。而揮發(fā)酸的測(cè)定,卻比較真實(shí)地反映了樣品中低沸點(diǎn)的蟻酸含量的多少,不能概括樣品中其它多種沸點(diǎn)較高的有機(jī)酸的含量和樣品pH值的高低。滴定法只能測(cè)定食品的總酸度，不能具體反映出有機(jī)酸的種類和含量，所需費(fèi)用較低,但影響因素較多,準(zhǔn)確度差。比色法只能測(cè)定單一的有機(jī)酸。薄層色譜法一次可測(cè)定多種有機(jī)酸,但測(cè)量精度差,可以定性,不適合定量。這些方法往往只適用于某些特殊樣品或不常見(jiàn)有機(jī)酸的分析，而且能達(dá)到同時(shí)分離的有機(jī)酸種類較少。離子色譜法多采用稀強(qiáng)酸,如稀鹽酸和稀硫酸作淋洗液,對(duì)設(shè)備有一定腐蝕作用。而高效液相色譜法分析有機(jī)酸可以克服上述不足之處,并且實(shí)現(xiàn)一機(jī)多用,一柱多用。在高效液相色譜法檢測(cè)食品中的有機(jī)酸時(shí)，最重要的是選擇最佳的色譜分離條件，這些條件中涉及流動(dòng)相的pH值、流速、柱溫、檢測(cè)波長(zhǎng)等等。流動(dòng)相配比影響著流動(dòng)相的pH值，從而對(duì)柱效和峰的分離均有影響。流速同樣是影響其分離效果的一個(gè)重要因素，流速過(guò)低則分離時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，柱效差，而流速過(guò)高又導(dǎo)致峰擠在一起分不開(kāi)。根據(jù)色譜理論，柱溫是影響柱效和分離度的主要因素，柱溫升高可以降低流動(dòng)相的粘度和提高樹(shù)脂的傳質(zhì)效率，但是太高又會(huì)破壞色譜柱，所以色譜條件的選擇是相當(dāng)復(fù)雜的，要綜合眾多的考慮因素。方法原理：樣品中的有機(jī)酸用堿滴定時(shí)，被中和生成鹽類。反應(yīng)如下：注釋

1．本試驗(yàn)所用蒸餾水應(yīng)經(jīng)煮沸除去二氧化碳。

2．若顏色過(guò)深，可先加入等量蒸餾水稀釋后再滴定或用活性炭脫色（損失較大，滴定值偏低）。終點(diǎn)不易辨認(rèn)時(shí)，可用原樣作對(duì)照，判明終點(diǎn)，也可改用電位或電導(dǎo)滴定法。3.總酸測(cè)定的結(jié)果一般以樣品中含量最多的酸來(lái)表示。一般葡萄的總酸度用酒石酸表示；柑桔以檸檬酸表示；蘋(píng)果、核仁、核果、漿果和蔬菜類按蘋(píng)果酸表示；牛乳、水產(chǎn)品以乳酸表示。4.農(nóng)產(chǎn)品中的有機(jī)酸均為弱酸，用強(qiáng)堿(NaOH)滴定時(shí)，其滴定終點(diǎn)偏堿，一般在pH8.2左右，所以，可選用酚酞作為指示劑，微紅色，30s內(nèi)不褪色為終點(diǎn)。。5.氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液用基準(zhǔn)物質(zhì)來(lái)標(biāo)定。常用的有草酸和鄰苯二甲酸氫鉀等。采用鄰苯二甲酸氫鉀，它與氫氧化鈉的反應(yīng)為：

KHC8H4O4+NaOHKNaHC8H4O4+H2O

到達(dá)化學(xué)計(jì)量點(diǎn)時(shí)，溶液呈弱堿性，可用酚酞作指示劑。

揮發(fā)性酸的測(cè)定揮發(fā)性酸主要是指醋酸、蟻酸、丁酸和痕量的甲酸等霉?fàn)€的果蔬、籽粒，未成熟的種子和果實(shí)，常含有較多的揮發(fā)性酸，它的含量是農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)好壞的一個(gè)重要指標(biāo)。揮發(fā)性酸包括游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩部分。前者在蒸餾時(shí)較易揮發(fā)，后者比較困難。測(cè)定揮發(fā)性酸的方法有直接法和間接法。直接法是用堿液滴定由蒸餾或其它方法所得的揮發(fā)性酸；間接法是將揮發(fā)性酸蒸發(fā)除去后，滴定殘?jiān)牟粨]發(fā)酸的酸度，再由總酸度減去此殘?jiān)岫燃吹脫]發(fā)酸含量。一般用直接法較為方便。4．磷酸的濃度：1︰9，50ml加1ml。5．揮發(fā)性酸的滴定須把蒸出液為300ml左右。6．滴定終點(diǎn)，1min不褪色為終點(diǎn)。7.揮發(fā)性酸的結(jié)果計(jì)算以蟻酸計(jì)。蟻酸的摩爾質(zhì)量為60g。

有效酸度(pH)的測(cè)定果蔬食品的pH值的變動(dòng)不僅取決于原料品種和成熟度，而且取決于加工方法。其pH值與總酸度之間沒(méi)有嚴(yán)格的比例關(guān)系，pH值的大小不僅取決于酸的數(shù)量和性質(zhì)(種類)，而且受其中的酸、果膠、某些鹽類和蛋白質(zhì)緩沖能力的影響。提取：一般的果蔬樣品，與水1︰1研磨，過(guò)濾；干果、籽粒，水2-3倍，沸水煮30min，過(guò)濾測(cè)定。測(cè)定pH值測(cè)定的方法應(yīng)用最廣泛的有：pH試紙法、標(biāo)準(zhǔn)色管比色法和pH計(jì)測(cè)定法。其中以pH計(jì)法最準(zhǔn)確，操作也簡(jiǎn)便、迅速，可排除或減小這些樣品中所含的色澤和雜質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果所造成的影響,測(cè)得較準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。pH計(jì)的型號(hào)很多，使用時(shí)參照說(shuō)明書(shū)即可。pH標(biāo)準(zhǔn)溶液可以用國(guó)家計(jì)量管理機(jī)關(guān)提供的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)按規(guī)定配制；或按一般專業(yè)書(shū)籍上的配方配制。

水果、蔬菜等有機(jī)酸組分的測(cè)定

(高效液相色譜法)有機(jī)酸是果、蔬的主要組成分之一。果、蔬中有機(jī)酸的種類和含量變化很大。這些變化決定于品種、成熟度、氣候條件及其它因素。果蔬中蘋(píng)果酸和檸檬酸的一般含量范圍見(jiàn)表17-1。方法原理樣品經(jīng)處理后，直接將樣品液注入反相化學(xué)鍵合相色譜體系，用5g·L-1(NH4)2HPO4

為流動(dòng)相，有機(jī)酸在兩相中分配分離；按照其碳原子數(shù)由少到多的順序從色譜柱中洗脫下來(lái)；用紫外檢測(cè)器(214nm)或示差折光檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)并與標(biāo)準(zhǔn)樣品比較定量。

操作步驟

有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

分別取適量有機(jī)酸單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣，如酒石酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸、琥珀酸等于25mL容量瓶中，用0.01mo1/LNaOH溶液溶解后定容，參照表17-1的含量范圍配制標(biāo)準(zhǔn)濃度系列。

樣品溶液的制備液體樣品：需經(jīng)合適倍數(shù)稀釋，用Sep-PAKC18凈化柱處理（有色素等雜質(zhì),會(huì)干擾有機(jī)酸的分析,同時(shí)造成色譜柱的污染，因此,在樣品前處理中必須將其去除），收集餾出液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后備用。固體或半固體樣品：要將其搗碎，均質(zhì)后，加入一定量的0.01mo1/LNaOH（或80％乙醇）溶液提取。經(jīng)離心分離或過(guò)濾后收集提取液，用Sep-PAKC18（WatersSep-PakC18小柱固相萃?。﹥艋幚?，收集餾出液。經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后備用。該技術(shù)所用設(shè)備簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，溶劑用量較少，能夠高效率、有選擇地分離和富集極性不同的樣品，是一種可靠性高和實(shí)用的現(xiàn)代分離技術(shù)。SPE改善、簡(jiǎn)化了分離，提高了色譜柱壽命，降低了檢測(cè)限色譜條件固定相：C18鍵合相流動(dòng)相：5g·L-1(NH4)2HPO4，pH=2.5流速：2mL·min-1進(jìn)樣量：10μL檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器，214nm，0.1AUFS最常用的“萬(wàn)能柱”填料為“C18”，簡(jiǎn)稱“ODS”柱，即十八烷基硅烷鍵合硅膠填料（Octadecylsilyl，簡(jiǎn)稱ODS）。這種填料在反相色譜中發(fā)揮著極為重要的作用。由于C18(ODS)是長(zhǎng)鏈烷基鍵合相，有較高的碳含量和更好的疏水性，對(duì)各種類型的生物大分子有更強(qiáng)的適應(yīng)能力，因此在生物化學(xué)分析工作中應(yīng)用的最為廣泛，近年來(lái)，為適應(yīng)氨基酸、小肽等生物分子的分析任務(wù)，又發(fā)展了CH、C3、C4等短鏈烷基鍵合相和大孔硅膠（20～40μm）。按鍵合到基質(zhì)上的官能團(tuán)可分為：反相柱：填料是非極性的，官能團(tuán)為烷烴，例如：C18(ODS)、C8、C4等。正相柱：填料是極性的，官能團(tuán)為－CN氰基、－NH2氨基等。測(cè)定和計(jì)算將待測(cè)樣10μL注入色譜儀，根據(jù)其峰高或峰面積設(shè)定有關(guān)最佳參數(shù)如最小峰面積。注入有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液10μL，進(jìn)行色譜分析。以各標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間定性。定性：將各種單一有機(jī)酸液依次進(jìn)樣，記錄各自保留時(shí)間。方法a.在相同的色譜條件下,將樣品色譜圖與有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)液色譜圖進(jìn)行對(duì)照,根據(jù)保留時(shí)間確定樣品中的有機(jī)酸;b.在樣品中加入有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)液,根據(jù)峰高的突增來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證色譜峰的歸屬;c．比較各有機(jī)酸在標(biāo)準(zhǔn)液和樣液色譜圖中的紫外吸收?qǐng)D譜。有機(jī)酸的定量：外標(biāo)法，將不同濃度酸液從低濃度到高濃度依次進(jìn)樣，計(jì)算各自的峰面積，每個(gè)樣平行進(jìn)5次，作各種有機(jī)酸的峰面積或峰高與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各響應(yīng)值(峰高或峰面積)作一響應(yīng)值與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別注入待測(cè)樣品10μL，進(jìn)行色譜分析。根據(jù)各待測(cè)樣品的響應(yīng)值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相應(yīng)的含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

說(shuō)明在樣品溶液測(cè)定中，每進(jìn)3次樣液，就應(yīng)進(jìn)1次標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校正，并重新計(jì)算校正系數(shù)，以保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度。樣品液制備須經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后才能上機(jī)測(cè)定，否則引起柱的污染和測(cè)定干擾。流動(dòng)相（載液）：5g·L-1(NH4)2HPO4，須準(zhǔn)確pH=2.5，并經(jīng)濾膜過(guò)濾后、脫氣后才能使用。否則分離不好，引起較大誤差。標(biāo)準(zhǔn)液的濃度與樣品中相應(yīng)有機(jī)酸的濃度相一致，才能有較大的準(zhǔn)確性。可查閱相關(guān)手冊(cè)，了解樣品酸的含量范圍。用反相色譜法測(cè)定水果及果汁中的有機(jī)酸。固定相的極性大于流動(dòng)相時(shí)，叫正相。即固定相為極性，流動(dòng)相為非極性。常用于分離極性較強(qiáng)的化合物，分析的順序是極性較低的組分保留值小，先流出色譜柱。流動(dòng)相的極性應(yīng)小于固定相的極性，常用飽和烴作流動(dòng)相的洗脫劑，加入適量的極性溶劑（甲醇、異丙醇等）作調(diào)節(jié)劑以調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性。反相分配色譜法，與正相的相反，常用于分離極性較弱的化合物，分析的順序是極性較強(qiáng)的組分保留時(shí)間短，先流出色譜柱。反相色譜中多以水（極性最強(qiáng)）和有機(jī)溶劑的混合物作流動(dòng)相，常用的流動(dòng)相是甲醇/水、乙腈/水。分離有機(jī)酸,既要考慮流動(dòng)相的組成，濃度及pH，還要考慮有機(jī)酸的強(qiáng)弱，磷酸鹽緩沖液是C18反相柱上應(yīng)用較廣的流動(dòng)相。實(shí)驗(yàn)證明：選擇磷酸二氫銨，磷酸氫二銨，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀溶液作流動(dòng)相，結(jié)果表明,這四種緩沖液為流動(dòng)相，分離效果相同，當(dāng)濃度相同,采用磷酸二氫銨為流動(dòng)相時(shí),各有機(jī)酸的響應(yīng)值最大,選用磷酸二氫銨為流動(dòng)相。有機(jī)酸組分的測(cè)定(氣相色譜法)采用氣相色譜法由于有機(jī)酸的強(qiáng)極性及部分有機(jī)酸對(duì)熱的不穩(wěn)定性和吸附性,故常將其酯化制備成甲酯、芐酯等衍生物進(jìn)行分析,但這樣往往會(huì)造成分析結(jié)果失真,且手續(xù)繁雜。方法原理：在硫酸的催化下，使有機(jī)酸成為丁酯的衍生物，用氣相色譜法分別定量?？啥康挠袡C(jī)酸有：甲酸、乙酸、丙酸、異丁酸、正丁酸、乳酸、異戊酸、異乙酸、正己酸、乙酰丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、反丁烯二酸、蘋(píng)果酸、酒石酸、反丙烯三羧酸以及檸檬酸等。操作步驟試樣準(zhǔn)備蔬菜：把樣品切成3mm見(jiàn)方，稱取25.0g加溫水(80℃，部分蔬菜可用800ml/L乙醇代替研磨)，提取2次，合并提取液，加酚酞指示劑，用0.1mol/LNaOH溶液滴定，求總酸量，同時(shí)使有機(jī)酸成為鈉鹽。中和后的溶液，在40℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至約15mL，濃縮液移入25mL容量瓶并定容。必要時(shí)可過(guò)濾除去不溶物。吸取此提取液10mL用AmberliteCGl20、AmberliteCG4B，得到有機(jī)酸組分，將其酯化,供氣相色譜分析用(圖17-2)。水果：從新鮮水果樣品中稱取2.0g，加3倍量的800ml/L乙醇研磨，以離心分離后，收集上清液，殘?jiān)俜磸?fù)提取2次，合并提取液，加酚酞指示劑，用0.1mol/LNaOH溶液中和。中和后在80℃恒溫水槽中加熱10min后，定容至200mL，使用前保存于冰箱中。取此提取液10～50mL，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至無(wú)醇后，依次通過(guò)AmberiteCGl20、CG4B及CGl20柱，得到有機(jī)酸組分，加入酚酞指示劑并滴定，求出總酸含量。然后保存于約40℃下，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，干涸后進(jìn)行丁酯化處理。酯化

用上述方法制備的有機(jī)酸中，加丁醇2mL，無(wú)水硫酸鈉2g，濃硫酸0.2ml，連接冷凝管，在電熱板上平穩(wěn)沸騰約30min(加熱時(shí)要不斷攪拌)，使有機(jī)酸成為丁酯。酯的提取

酯化終了，加水和己烷各5mL充分混合，使酯轉(zhuǎn)溶于己烷中，每次用己烷5mL提取3次。用移液管移入20ml容量瓶中