發(fā)酵工藝控制課件

第四章發(fā)酵工藝控制

第一節(jié)發(fā)酵生產(chǎn)方法的類型

發(fā)酵過程狀態(tài)：1、間歇：（1）培養(yǎng)基加入和發(fā)酵液放出是一致的；（2）發(fā)酵一次一次進(jìn)行。2、連續(xù)：（1）培養(yǎng)液加入到放出是連續(xù)的；（2）培養(yǎng)罐中處于穩(wěn)定狀態(tài)。3、半連續(xù)發(fā)酵：培養(yǎng)基連續(xù)加入發(fā)酵液分批或分別放出I→II→III整個(gè)系統(tǒng)培養(yǎng)液連續(xù)加入，但各罐的發(fā)酵液分別放出。一、分批發(fā)酵1、分批發(fā)酵的定義是指在一封閉系統(tǒng)內(nèi)含有初始限量基質(zhì)的發(fā)酵方式。在這一過程中，除了氧氣、消泡劑及控制pH的酸或堿外，不再加入任何其它物質(zhì)。發(fā)酵過程中培養(yǎng)基成分減少，微生物得到繁殖。2、分批發(fā)酵的特點(diǎn)微生物所處的環(huán)境在發(fā)酵過程中不斷變化，其物理，化學(xué)和生物參數(shù)都隨時(shí)間而變化，是一個(gè)不穩(wěn)定的過程。典型的分批發(fā)酵工藝流程典型的分批發(fā)酵工藝流程二、補(bǔ)料分批發(fā)酵1、定義補(bǔ)料分批發(fā)酵又稱半連續(xù)發(fā)酵或流加分批發(fā)酵，是指在分批發(fā)酵過程中，間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基的發(fā)酵方式。2、補(bǔ)料分批發(fā)酵的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：使發(fā)酵系統(tǒng)中維持很低的基質(zhì)濃度；和連續(xù)發(fā)酵比、不需要嚴(yán)格的無菌條件；不會(huì)產(chǎn)生菌種老化和變異等問題。缺點(diǎn)：存在一定的非生產(chǎn)時(shí)間；和分批發(fā)酵比，中途要流加新鮮培養(yǎng)基，增加了染菌的危險(xiǎn)。3、補(bǔ)料分批發(fā)酵的類型按補(bǔ)料方式不同可分為：（1）連續(xù)流加（2）不連續(xù)流加（3）多周期流加按補(bǔ)料成分的不同可分為：（1）單一組分流加（2）多組分流加按控制方式的不同可分為：（1）反饋控制（2）無反饋控制連續(xù)發(fā)酵的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：能維持低基質(zhì)濃度；可以提高設(shè)備利用率和單位時(shí)間的產(chǎn)量；便于自動(dòng)控制。缺點(diǎn)：菌種發(fā)生變異的可能性較大；要求嚴(yán)格的無菌條件。第二節(jié)發(fā)酵過程的動(dòng)力學(xué)類型反應(yīng)化學(xué)因素則化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)酶→酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)發(fā)酵：1、速度：表征是什么？幾個(gè)表征間關(guān)系；2、影響因素：其如何影響，怎樣控制這些因素現(xiàn)主要討論第1個(gè)問題將培養(yǎng)基滅菌，加入菌種，在一定容器中發(fā)酵，將其動(dòng)態(tài)變化畫成曲線，此為發(fā)酵曲線圖所以影響因素為：

a基質(zhì)中糖或碳源

b菌種c產(chǎn)物從此三個(gè)因素分析發(fā)酵速度。一、分批發(fā)酵1、分批發(fā)酵的定義是指在一封閉系統(tǒng)內(nèi)含有初始限量基質(zhì)的發(fā)酵方式。在這一過程中，除了氧氣、消泡劑及控制pH的酸或堿外，不再加入任何其它物質(zhì)。發(fā)酵過程中培養(yǎng)基成分減少，微生物得到繁殖。2、分批發(fā)酵的特點(diǎn)微生物所處的環(huán)境在發(fā)酵過程中不斷變化，其物理，化學(xué)和生物參數(shù)都隨時(shí)間而變化，是一個(gè)不穩(wěn)定的過程。從此三個(gè)因素分析發(fā)酵速度。所以研究發(fā)酵速度就是研究1．碳源利用速度

2．菌生長(zhǎng)速度

3．產(chǎn)物形成速度

4．上述三者之間關(guān)系根據(jù)以上四個(gè)條件將所有發(fā)酵過程分為三大類型發(fā)酵過程分為三大類型（一）類型I

（一）類型I乳酸發(fā)酵（一）類型I乳酸發(fā)酵（一）類型I桿菌肽發(fā)酵（二）類型II1特點(diǎn)：

①分成兩個(gè)時(shí)期：菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成在不同時(shí)期，分別在菌生長(zhǎng)期產(chǎn)物形成期。②碳源利用的比速度有兩個(gè)高峰，分別在兩個(gè)時(shí)期，第一個(gè)高峰用于菌體生長(zhǎng)，第二個(gè)高峰用于產(chǎn)物合成（在產(chǎn)物形成期可能還有菌體第二次生長(zhǎng)）。③碳源利用和產(chǎn)物形成無明確的化學(xué)劑量關(guān)系，但還是有一定關(guān)系的。2、產(chǎn)物類型①有中間產(chǎn)物積累：產(chǎn)物在合成過程中先積累一定產(chǎn)物，再由中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為最終產(chǎn)物。如丙酮丁醇發(fā)醇，丙酮丁醇發(fā)酵分為三個(gè)時(shí)期。增酸期：0~18h有機(jī)酸大量積累，菌體大量生長(zhǎng)產(chǎn)物溶劑形成少減酸期：18~40h菌體長(zhǎng)到最大期，溶劑就大量形成，培養(yǎng)液中pH值上升后發(fā)醇：40~72h菌體不增長(zhǎng)，甚至有些下降，溶劑增長(zhǎng)到最大值，酸降低到最小值。②無中間產(chǎn)物積累如：延胡索酸發(fā)酵用黑根霉谷氨酸發(fā)酵用棒狀桿菌檸檬酸發(fā)酵用黑曲霉土霉素發(fā)酵金色鏈霉菌（四環(huán)類抗生等）土霉素生產(chǎn)因其菌生長(zhǎng)，C利用有兩個(gè)高峰而劃入Ⅱ型，產(chǎn)物產(chǎn)量較高。（三）類型Ⅲ（三）類型Ⅲ

鏈霉素發(fā)酵（用灰色鏈霉素生產(chǎn)）

第三節(jié)連續(xù)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)一、控制方法1、恒濁法：根據(jù)培養(yǎng)液的濁度與菌的濃度成正比，通過一種儀器（如光電效應(yīng)）控制菌的流量，使菌的濃度保持一致，在此培養(yǎng)基的各種養(yǎng)料是充足過量的，菌都在最大生長(zhǎng)速度，菌濃度被控制，適用于動(dòng)力學(xué)類型Ⅰ。2、恒化法：培養(yǎng)基中有一種可限制菌的生長(zhǎng)速度，此為限制性基質(zhì)，如培養(yǎng)基中糖的含量很低，還可用氨基酸，無機(jī)氮等而別的成分不是過量的，培養(yǎng)基的流量一定，這種方法，菌的生長(zhǎng)速度不是在最大生長(zhǎng)速度，以此控制菌的濃度一定，采用這種方法適于動(dòng)力學(xué)Ⅱ、Ⅲ型。3、對(duì)基質(zhì)情況同理

Yx/s為以消耗基質(zhì)基準(zhǔn)的菌生長(zhǎng)得率常數(shù)。

將其代(3-6)對(duì)單級(jí)罐而言

根據(jù)Michadis--mentem公式飽和常數(shù),為1/2時(shí)基質(zhì)濃度為最大比生長(zhǎng)速率Monod公式三、連續(xù)發(fā)酵優(yōu)點(diǎn)：1、提高了生產(chǎn)率，一般至少幾倍至十多倍。原因①提高了發(fā)酵罐的利用率，其表示用兩種：生產(chǎn)單位重量的產(chǎn)品每日所需發(fā)酵罐的立方米。或單位積的發(fā)酵罐每日生產(chǎn)的產(chǎn)品重量。②減少菌的非旺盛生長(zhǎng)期2、便于管理控制由于上面原因，生產(chǎn)成本大大降低，水、電、氣平衡易于控制。四、存在的問題1、理論上：菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物形成的關(guān)系，最適D、最適菌濃度的掌握理論上的推導(dǎo)不完全符合實(shí)際生產(chǎn)。2、退化與變異：連續(xù)發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng)越好，但許多菌會(huì)發(fā)生退化，表現(xiàn)在生產(chǎn)能力上退化，合成產(chǎn)物上發(fā)生變換。解決方法，更換菌種或種子。3、染菌問題：要解決之，對(duì)設(shè)備嚴(yán)密度、無菌操作嚴(yán)格，及好氣氣體供給。4、均勻度：與輸送能否順利進(jìn)行，主要是絲狀菌。第四節(jié)溫度對(duì)發(fā)酵的影響及其控制溫度是保證酶活性的重要條件，因此在發(fā)酵系統(tǒng)中，必須保證穩(wěn)定而合適的溫度環(huán)境。一、影響發(fā)酵溫度的因素。（1）產(chǎn)熱因素：生物熱和攪拌熱。（2）散熱因素：蒸發(fā)熱和輻射熱。發(fā)酵熱就是發(fā)酵過程中釋放出來的凈熱量。①生物熱：定義：生物熱是生產(chǎn)菌在生長(zhǎng)繁殖時(shí)產(chǎn)生的大量熱量。培養(yǎng)基中碳水化合物，脂肪，蛋白質(zhì)等物質(zhì)被分解為CO2,NH3時(shí)釋放出的大量能量。用途：合成高能化合物，供微生物生命代謝活動(dòng)，熱能散發(fā)。影響生物熱的因素：生物熱隨菌株，培養(yǎng)基，發(fā)酵時(shí)期的不同而不同。一般，菌株對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用的速率越大，培養(yǎng)基成分越豐富，生物熱也就越大。發(fā)酵旺盛期的生物熱大于其他時(shí)間的生物熱。生物熱的大小還與菌體的呼吸強(qiáng)度有對(duì)應(yīng)關(guān)系。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抗生素高產(chǎn)量批號(hào)的生物熱高于低產(chǎn)量批號(hào)的生物熱。說明抗生素合成時(shí)微生物的新陳代謝十分旺盛。發(fā)酵過程中生物熱的變化在四環(huán)素發(fā)酵中，還發(fā)現(xiàn)生物熱和菌的呼吸強(qiáng)度的變化有對(duì)應(yīng)關(guān)系，特別是在80小時(shí)以前。從此實(shí)驗(yàn)中還可看到，當(dāng)產(chǎn)生的生物熱達(dá)到高峰時(shí)，糖的利用速度也最大。另外也有人提出，可從菌體的耗氧率來衡量生物熱的大小。四環(huán)素生物合成過程中系列參數(shù)的動(dòng)態(tài)變化過程1：效價(jià)；2：呼吸強(qiáng)度；3：生物熱；4：糖濃度②攪拌熱定義：通風(fēng)發(fā)酵都有大功率攪拌，攪拌的機(jī)械運(yùn)動(dòng)造成液體之間，液體與設(shè)備之間的摩擦而產(chǎn)生的熱。攪拌熱的計(jì)算：

Q攪拌=3600（P/V）式中3600：熱功當(dāng)量（kJ/（kW.h））（P/V）：通氣條件下單位體積發(fā)酵液所消耗的功率（kW/m3）③蒸發(fā)熱定義：通入發(fā)酵罐的空氣，其溫度和濕度隨季節(jié)及控制條件的不同而有所變化?？諝膺M(jìn)入發(fā)酵罐后，就和發(fā)酵液廣泛接觸進(jìn)行熱交換。同時(shí)必然會(huì)引起水分的蒸發(fā)；蒸發(fā)所需的熱量即為蒸發(fā)熱。蒸發(fā)熱的計(jì)算：

Q蒸發(fā)=G（I2-I1）式中G：空氣流量，按干重計(jì)算，kg/hI2

、I1

：進(jìn)出發(fā)酵罐的空氣的熱焓量，J/kg（干空氣）（4）輻射熱定義：由于發(fā)酵罐內(nèi)外溫度差，通過罐體向外輻射的熱量。輻射熱的計(jì)算：輻射熱可通過罐內(nèi)外的溫差求得，一般不超過發(fā)酵熱的5%。3，發(fā)酵熱的測(cè)定（1）通過測(cè)定一定時(shí)間內(nèi)冷卻水的流量和冷卻水進(jìn)出口溫度，由下式求得這段時(shí)間內(nèi)的發(fā)酵熱。（2）通過罐溫的自動(dòng)控制，先使罐溫達(dá)到恒定，再關(guān)閉,自控裝置測(cè)得溫度隨時(shí)間上升的速率S，按下式可求得發(fā)酵熱：二、溫度對(duì)微生物影響。分為嗜冷菌，嗜中溫菌，嗜熱菌生長(zhǎng)活化能25~33KJ/mol小于死亡的活化能104~122KJ/mol∴死亡速率比生長(zhǎng)速度對(duì)溫度更敏感三、溫度對(duì)發(fā)酵影響溫度低，反應(yīng)速度低，周期長(zhǎng)溫度高，反應(yīng)速度快，但菌易衰老，影響產(chǎn)量。菌合成與產(chǎn)物合成溫度要求不同。溫度通過以下方式影響發(fā)酵過程（1）影響各種酶的反應(yīng)速率和蛋白質(zhì)性質(zhì)（2）影響發(fā)酵液的物理性質(zhì)（3）影響生物合成的方向。例如，四環(huán)素發(fā)酵中金色鏈霉菌同時(shí)能產(chǎn)生金霉素。在低于30℃溫度下，該菌種合成金霉素能力較強(qiáng)。當(dāng)溫度提高，合成四環(huán)素的比例也提高。在溫度達(dá)35℃則只產(chǎn)生四環(huán)素而金霉素合成幾乎停止。發(fā)酵過程中，微生物生長(zhǎng)速率變化

dX/dt=μX-αX式中μ：比生長(zhǎng)速率

α：比死亡速率當(dāng)處于生長(zhǎng)狀態(tài)時(shí)，μ>>α，α可忽略。μ與α與溫度有關(guān)根據(jù)Arrenhnius公式μ=Ae-E/RTα=A’e-E’/RT通常E’大于E，所以α比μ對(duì)溫度變化更為敏感。例：青霉菌生產(chǎn)青霉素青霉菌生長(zhǎng)活化能E=34kJ/mol青霉素合成活化能E=112kJ/mol青霉素合成速率對(duì)溫度較敏感，溫度控制相當(dāng)重要。五、最適溫度的確定在發(fā)酵過程中，最適溫度是一種相對(duì)概念，是指在該溫度下最適于菌的生長(zhǎng)或發(fā)酵產(chǎn)物的生成。最適發(fā)酵溫度與菌種，培養(yǎng)基成分，培養(yǎng)條件和菌體生長(zhǎng)階段有關(guān)。最適發(fā)酵溫度的選擇：在發(fā)酵的整個(gè)周期內(nèi)僅選一個(gè)最適培養(yǎng)溫度不一定好。溫度的選擇要參考其它發(fā)酵條件。溫度的選擇還應(yīng)考慮培養(yǎng)基成分和濃度六、溫度的控制發(fā)酵罐：夾套（10M3以下）盤管（蛇管）（10M3以上）第五節(jié)微生物的耗氧與氧的供給大多數(shù)發(fā)酵過程是好氧的，因此需要供氧。如果考慮呼吸的化學(xué)計(jì)量，則葡萄糖的氧化可由下式表示：

C6H12O6

十6O2＝6H2O十6CO2

只有當(dāng)這兩種反應(yīng)物均溶于水后，才對(duì)菌體有用。氧在水中的溶解度比葡萄糖要小約6000倍左右(氧在水中的飽和度約為l0mg/L)

。許多發(fā)酵的生產(chǎn)能力受到氧利用限制，因此氧成為影響發(fā)酵效率的重要因素。∴谷氨酸發(fā)酵氧供應(yīng)要適量——合理供氧一、微生物的需氧量，即微生物的耗氧量，Oxypenconsumcd微生的耗氧量用：1、耗氧速率來表示單位體積的培養(yǎng)液在單位時(shí)間的耗氧量叫耗氧速率（r）單位毫摩分子/升·小時(shí)mM/l·h耗氧速率與培養(yǎng)液中微生物的呼吸強(qiáng)度和細(xì)胞濃度有關(guān)實(shí)例一在對(duì)黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)生物合成氨基酸進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，溶氧濃度對(duì)相關(guān)的氨基酸的生物合成具有很大的影響。研究表明：菌體的臨界溶氧濃度為0.01mg/L；并根據(jù)“安全”的程度予以考慮供氧的程度，也即把菌體的呼吸率作為最大呼吸率的一個(gè)組成部分。因此，氧安全值低于最大呼吸率就意味著其溶氧濃度低于臨界值。當(dāng)溶氧濃度低于1.0時(shí)，谷氨酸和天冬氨酸族氨基酸合成受到影響，但苯丙氨酸，纈氨酸和亮氨酸最佳合成的溶氧濃度分別為0.55、0.60和0.85。從合成途徑中可知，谷氨酸和天冬氨酸族的氨基酸來自于三羧酸循環(huán)(TCA)的中間體，而苯丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸來自于糖酵解的中間體，即來自于丙酮酸和磷酸稀醇式丙酮酸。r=QO2*CCCC－－－g/l呼吸強(qiáng)度QO2－－－mM/gh每克干菌體每小時(shí)所消耗的氧的毫摩爾數(shù)呼吸強(qiáng)度與菌特性有關(guān)如青霉素菌4.2mM/gh鏈霉菌4.0mM/gh還與生理狀態(tài)、培養(yǎng)條件（氧濃度）有關(guān)。臨界氧濃度2、臨界氧濃度，當(dāng)培養(yǎng)液溶解氧濃度達(dá)到這一點(diǎn)，即在此之后，呼吸度與氧濃度無關(guān)。臨界氧濃度是培養(yǎng)液最低氧濃度一般在0.003~0.05M/L圖DissolvedOxygenConcentration微生物溫度（?C）臨界氧濃度（mmol/L）固氮菌300.018大腸桿菌370.008酵母300.004產(chǎn)黃青霉240.0223、微生物的需氧量與以下因素有關(guān)①菌種特性一般在25~100mM/l·h，但有個(gè)別菌特別，如石油酵母，200mM/l·h生理狀態(tài)（1）與菌齡有關(guān)幼＞老（2）與生理階段有關(guān):1.生長(zhǎng)階段＞合成階段如卷曲霉素

2.生成階段＜合成階段如頭孢霉素②培養(yǎng)基成分與濃度C、N源微量成分濃度高則耗氧量大（補(bǔ)料后，微生物耗氧量升高）微量元素如P濃度高，耗氧大大提高。金屬離子低，一般耗氧降低。CO2濃度高，耗氧量低。③細(xì)胞濃度：細(xì)胞濃度高，耗氧量高④溫度：溫度升高，耗氧高，所以高溫發(fā)酵，供氧加強(qiáng)二、氧的供給（一）氧的溶解度（二）氧的傳遞（三）溶解速率（dC/dt）（一）氧的溶解度微生物需氧，而氧又難溶于培養(yǎng)液。25℃.1大氣壓.純氧,溶于水的溶解度為1.26mmol/l.25℃.1大氣壓.空氣溶于水的溶解度為0.26mmol/l.25℃.1大氣壓.空氣,溶于發(fā)酵液的溶解度為0.20mmol/l.如青霉素發(fā)酵80小時(shí)，其耗氧為40mM/h.l不夠消耗20秒的,好氧性發(fā)酵要不斷供氧。（二）氧的傳遞攪拌成為細(xì)泡阻力有來自培養(yǎng)液。細(xì)菌細(xì)胞。供氧不足，微生物缺氧，窒息。要求耗氧速率與溶氧速率達(dá)到平衡。當(dāng)溶氧的速率＜耗氧速率，則溶氧濃度↓，微生物生長(zhǎng)受影響。（三）溶氧速率（dC/dt）溶氧速率（dC/dt）：?jiǎn)挝惑w積的培養(yǎng)液在單位時(shí)間里溶解的氧量。單位：mM/l·h。dC/dt=KLa(C*-C)C*飽和氧濃度 C實(shí)際氧濃度KL液膜傳質(zhì)系數(shù)（m/h）a比界面面積(M2/M3)a=A/VA培養(yǎng)液氣液接觸面積V培養(yǎng)液體積KLa氧的吸收系數(shù)（氧傳遞系數(shù)）單位1/h提高培養(yǎng)液溶解氧速率常用以下方法：提高培養(yǎng)液溶解氧速率常用方法①提高C*據(jù)享利定律（1）在通入的空氣中摻入的純氧（2）提高罐壓力也是提高氧分壓的一種方法②提高KLa,最重要的一種方法（1）攪拌（2）提高通氣量③降低培養(yǎng)液粘度④降低培養(yǎng)液溫度⑤添加某些物質(zhì)增加溶氧⑥與培養(yǎng)液液柱體積有關(guān)①提高C*C*=HPO2據(jù)享利定律可提高氧分壓PO2提高氧分壓方法（1）在通入的空氣中摻入純氧由于產(chǎn)品產(chǎn)值高，微生物耗氧量大，在微生物耗氧最大時(shí)通入純氧。（2）提高罐壓力也是提高氧分壓的一種方法不常用，現(xiàn)發(fā)酵保持正壓0.1~1.0kg/m2是為防止染菌,提高罐壓還可壓碎氣泡.但更大加速了

的溶解度.②提高KLa最主要的一種方法KLa與罐攪拌型式、通氣量有關(guān)提高KLa方法（1）攪拌可增加氣泡進(jìn)行走時(shí)間，增加氣液的接觸面積，（把大泡變?yōu)樾∨荩?。可降低液膜厚度，降低了傳遞阻力，有利于氣、液、固三相物質(zhì)均勻混和，既有利于氧溶解，也有利于微生物的吸收，有利于代謝廢物的分散和排出，有利于產(chǎn)物的均勻分布，在一定范圍內(nèi)提高攪拌速率可提高溶解速率，當(dāng)攪拌率超過一定限度不但會(huì)降低溶氧速率，且不利于菌生長(zhǎng)，造成空轉(zhuǎn)，使攪拌器接觸不到培養(yǎng)液，不能打碎氣泡，且剪切作用加速細(xì)胞的自溶。（2）提高通氣量也是可增占加KLa，但通氣量太大，也會(huì)降低KLa產(chǎn)生過載，一部分沒經(jīng)過攪拌器打碎，跑出培養(yǎng)液。通氣量太大，增加發(fā)酵液的蒸發(fā)，使之濃縮，還會(huì)因溫度不高而降低培養(yǎng)液溫度。③降低培養(yǎng)液粘度：粘度越大，就減少了培養(yǎng)液的湍動(dòng)程度，使液膜變厚，粘度越大，氣泡穩(wěn)定性越大，粘度與培養(yǎng)液濃度，成分有關(guān)，增加1%蛋白胨KLa降低40%，粘度與茵絲濃度有關(guān)。④降低培養(yǎng)液溫度：在允許條件下降低，可增加溶解速率。⑤添加某些物質(zhì)增加溶氧。如加入高分子水溶性物，表面活性劑可增加溶氧，但不得影響菌生長(zhǎng)，不使產(chǎn)物提煉變難，要經(jīng)濟(jì)。⑥與培養(yǎng)液液柱體積有關(guān)，相同體積下，液柱高的溶氧高，氧利用率高，高徑比（H/D）由1升至2，KLa可提高40%，再提至3還可提高30%，現(xiàn)發(fā)酵罐高徑比常為2.5~3.5，大型罐比小型罐溶氧多。第六節(jié)pH值，、基質(zhì)濃度對(duì)發(fā)酵的影響一、pH值對(duì)發(fā)酵過程的影響及控制培養(yǎng)液的ph值是微生物在一定環(huán)境條件下代謝活動(dòng)的綜合指標(biāo)，是一個(gè)重要參數(shù)。1、菌類在一定的pH值范圍內(nèi)繁殖，代謝菌的代謝活動(dòng)會(huì)改變發(fā)酵液的PH值。2、發(fā)酵過程pH值變化當(dāng)外環(huán)境變化不大時(shí)，菌本身有調(diào)節(jié)pH的能力，但有限。pH值變化會(huì)引起多種酶的改變從而影響菌對(duì)基質(zhì)的利用速率和細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，影響菌生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成。引起pH下降因素 上升因素

3、pH值控制①培養(yǎng)基的配比②中間補(bǔ)料控制pH值，補(bǔ)糖或補(bǔ)氨水、尿素③PH電極控制加補(bǔ)料或酸、堿來控制pH。二、和呼吸商既是發(fā)酵產(chǎn)物又是合成的一種基質(zhì)?？勺鳛榧?xì)胞代謝的重要指示對(duì)菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成有直接影響。1、釋放率（CER）CER與菌體生長(zhǎng)速率成比率關(guān)系2、呼吸商（RQ）值 OUR菌耗氧速率molO2/l·hRQ值反映菌的代謝情況當(dāng)RQ值不同，菌走不同代謝途徑。當(dāng)利用不同基質(zhì)時(shí)，RQ值也不相同。1、CO2對(duì)發(fā)酵的影響（1）CO2對(duì)菌體具有抑制作用當(dāng)排氣中CO2的濃度高于4%時(shí)，微生物的糖代謝和呼吸速率下降。例如，發(fā)酵液中CO2的濃度達(dá)到1.6×10-1mol，就會(huì)嚴(yán)重抑制酵母的生長(zhǎng)；當(dāng)進(jìn)氣口CO2的含量占混合氣體的80%時(shí)，酵母活力與對(duì)照相比降低20%。（2）CO2對(duì)發(fā)酵的影響①對(duì)發(fā)酵促進(jìn)。如牛鏈球菌發(fā)酵生產(chǎn)多糖，最重要的發(fā)酵條件是提供的空氣中要含5%的CO2

。②對(duì)發(fā)酵抑制。如對(duì)肌苷、異亮氨酸、組氨酸、抗生素等發(fā)酵的抑制③影響發(fā)酵液的酸堿平衡。2、CO2對(duì)發(fā)酵影響的機(jī)理CO2及HCO3-主要是影響細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致膜的流動(dòng)性及表面電荷密度發(fā)生改變，影響到細(xì)胞膜的輸送效率，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制、形態(tài)發(fā)生改變。培養(yǎng)液中的CO2主要作用于細(xì)胞膜的脂質(zhì)核心部位；HCO3-影響細(xì)胞膜的膜蛋白。3、CO2的控制CO2在發(fā)酵液中的濃度變化不像溶解氧那樣有一定的規(guī)律。它的大小受到許多因素的影響，如細(xì)胞的呼吸強(qiáng)度、發(fā)酵液的流變學(xué)特性、通氣攪拌程度、罐壓大小、設(shè)備規(guī)模等。在發(fā)酵過程中通常通過調(diào)節(jié)通風(fēng)和攪拌來控制。三、基質(zhì)濃度對(duì)發(fā)酵的影響及補(bǔ)料控制。monod模型下圖為代表性圖式as＜＜ksb適于monod。C為高濃度基質(zhì)產(chǎn)生抑制。基質(zhì)過高，則菌生長(zhǎng)受抑，產(chǎn)物合成也受抑，高濃基質(zhì)會(huì)引起碳分解產(chǎn)生物阻遏現(xiàn)象，并阻礙產(chǎn)物形成。無機(jī)鹽p對(duì)多種發(fā)酵物生產(chǎn)有影響要求p濃度高，核酸要求p鹽濃度達(dá)2%多數(shù)要求p濃度低，低至0.1%以下。如金霉素要求磷濃度0.02~0.04%.高p濃度改變了糖代謝途徑。（三）補(bǔ)料當(dāng)高產(chǎn)菌株選用，其氧化基質(zhì)一般強(qiáng)要求工藝跟上去工藝改革。①采用豐富培養(yǎng)基，成分全，濃度高達(dá)10%~15%。由于這樣菌生長(zhǎng)快速，大部分原料用于菌生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物用于產(chǎn)物形成有局限性，同時(shí)培養(yǎng)液粘度大，使得溶解氧（DO）下降，培養(yǎng)液滲透壓也升高，到一定程度，會(huì)影響菌的生長(zhǎng)狀態(tài)，產(chǎn)生很多泡沫，由于粘度大，泡沫也穩(wěn)定。②補(bǔ)料：在發(fā)酵過程中，中途補(bǔ)加的料液，補(bǔ)償作用優(yōu)點(diǎn)：

(1)用控制營(yíng)養(yǎng)物資的濃度的方法來控制菌的生長(zhǎng)速度，使菌生長(zhǎng)不致太快衰老，自溶推遲，達(dá)到增加合成時(shí)間，提高產(chǎn)物量的作用。（2）作為控制，扭正異常發(fā)酵的手段如發(fā)酵罐中通氣不良，可能是菌絲成團(tuán)或萎縮，用補(bǔ)稀料，補(bǔ)水的辦法。如生長(zhǎng)緩慢，可加磷、促使之生長(zhǎng)。發(fā)現(xiàn)有不嚴(yán)重雜菌，可在補(bǔ)料中加抑菌劑。（3）增加發(fā)酵液總體積補(bǔ)料的內(nèi)容：缺何補(bǔ)何，所補(bǔ)之物與菌種有關(guān)。與基礎(chǔ)培養(yǎng)基原料有關(guān)，與培養(yǎng)條件有關(guān)。如補(bǔ)（C源、N源，微量元素）補(bǔ)料時(shí)機(jī)：適時(shí)適量時(shí)間適宜：則效果顯著補(bǔ)料不單純以時(shí)間來決定根據(jù)取樣分析的結(jié)果來定第七節(jié)泡沫控制與發(fā)酵終點(diǎn)判斷一、泡沫的產(chǎn)生及其影響1、產(chǎn)生在微生物浸沒培養(yǎng)過程中，通氣攪拌，代謝氣體逸出，培養(yǎng)基中糖，蛋白質(zhì)，代謝物等穩(wěn)定泡沫的表面活性物質(zhì)。2、影響①降低發(fā)酵罐裝料系數(shù)②增加了菌群的非均一性③增加染菌機(jī)會(huì)④導(dǎo)致產(chǎn)物損失⑤消泡劑的加入增加提取的困難

3、泡沫控制：泡沫控制：機(jī)械消泡，消泡劑消泡從微生物本身著手①機(jī)械消泡：靠機(jī)械力引起強(qiáng)烈振動(dòng)或壓力變化促使泡沫破裂②罐內(nèi)：攪拌軸上的方裝消沫漿，可在其轉(zhuǎn)系上加少量消泡劑③罐外：將泡沫引出罐外，通過噴咀的人為作用或離心力來消泡沫。優(yōu)點(diǎn)：不需引進(jìn)外界物質(zhì)，減少培養(yǎng)液性復(fù)雜化程度，減少污染機(jī)會(huì)。缺點(diǎn)：不能從根本上消除了引起穩(wěn)定泡沫的因素。④消泡劑消泡（1）機(jī)理

a、當(dāng)泡沫的表層有在著由極性的表面活性物質(zhì)形成雙電系層，可加入另一種具有相反電荷的表面活性劑，以降低泡沫的機(jī)械強(qiáng)度，或加入具強(qiáng)極性的物質(zhì)與發(fā)泡劑爭(zhēng)奪液膜上的空間，降低液膜強(qiáng)度，使泡沫破裂。b、泡沫的液膜具較大的表面粘度時(shí)，可加入某些分子內(nèi)聚力較小的物質(zhì)，以降低液膜的粘度，使液膜的液體流失，導(dǎo)致泡沫破裂。（2）種類

a、天然油脂：玉米油、米糠油、豆油、魚油、豬油等即可作為消泡，也可作為碳源和中間補(bǔ)料。b、化學(xué)消泡劑聚醚類高級(jí)醇類硅酮類聚氧乙烯丙烯甘油（泡敵）十八醇分散劑：幫助消沫劑擴(kuò)散和緩慢釋放，具加速和延長(zhǎng)消泡劑作用，減少消泡劑粘性。消泡劑的種類和性能?天然油脂：常用的有玉米油、米糠油、豆油、棉子油、魚油及豬油等。?聚醚類：在生產(chǎn)上應(yīng)用較多的是聚氧丙烯甘油和聚氧乙烯氧丙烯甘油(又稱泡敵)。?高級(jí)醇類十八醇是較常用的一種，可以單獨(dú)或與載體—起使用。據(jù)報(bào)導(dǎo)，它與冷榨豬油一起控制青男素發(fā)酵的泡沫，效果較好。聚二酵具有消沫效果持久的特點(diǎn)，尤其適用于霉菌發(fā)酵。?硅酮類硅酮類消沫劑主要是聚二甲基硅氧烷及其衍生物。分散劑：幫助消沫劑擴(kuò)散和緩慢釋放，具加速和延長(zhǎng)消泡劑作用，減少消泡劑粘性。選擇消泡劑的依據(jù)?對(duì)發(fā)酵過程無毒，對(duì)人、畜無害和不影響酶的生物合成。?消泡作用迅速，效果高和持久性能好?能耐高壓蒸氣滅菌而不變性，在滅菌溫度下對(duì)設(shè)備無腐蝕性或不形成腐蝕性產(chǎn)物。?不影響以后的提取過程。?消沫劑的來源多，價(jià)格低，添加裝置簡(jiǎn)單。?不干擾分析系統(tǒng)，如溶解氧、pH測(cè)定儀的探頭。?最好還能做到不影響氧的傳遞。二、發(fā)酵終點(diǎn)的判斷發(fā)酵要求提高生產(chǎn)率（kg/m3h），得率（kg產(chǎn)物/kg基質(zhì)）發(fā)酵系數(shù)（kg產(chǎn)物/罐容積m3、發(fā)酵周期h）當(dāng)下游提取精制成本占主要部分，產(chǎn)品價(jià)格比較貴，則除了要求高的產(chǎn)率和發(fā)酵系數(shù)外還要求高的產(chǎn)物濃度，體積生產(chǎn)率指每升發(fā)酵液每小時(shí)形成的產(chǎn)物克數(shù)。發(fā)酵的生產(chǎn)周期縮短發(fā)酵周期可提高總的生產(chǎn)率。放罐時(shí)間早殘留過多養(yǎng)分，不利于提取，放罐時(shí)間晚菌自溶，延長(zhǎng)過濾的處理時(shí)間，產(chǎn)物不穩(wěn)定放罐前，加糖，補(bǔ)料慎重

第八節(jié)污染的防止與挽救污染：微生物發(fā)酵為純種發(fā)酵，如有他菌侵入稱為污染。

一、雜菌污染的防止與挽救（一）危害性1、引起異常發(fā)酵會(huì)影響產(chǎn)物產(chǎn)量①生產(chǎn)菌的生長(zhǎng)受抑制測(cè)OD值菌濃度下降②C、N消耗加速，pH值的不正常變化③泡沫一般增多粘稠顏色加深，使培養(yǎng)液發(fā)酸發(fā)臭④發(fā)酵周期縮短2、影響產(chǎn)物提煉，使產(chǎn)物質(zhì)量不得保證如溶媒存在，使培養(yǎng)液乳化，不易分層與危害程度相關(guān)的幾個(gè)方面①與產(chǎn)品的品種有關(guān)，酒精和丙酮丁酸較小AA．核酸嚴(yán)重抗生素（窄譜廣譜）染菌與發(fā)酵周期有關(guān)，發(fā)酵周期長(zhǎng)，較易染菌，如前中期染菌后果較嚴(yán)重。②雜菌類型染球菌：后果較嚴(yán)重，其繁殖速度特快，染短桿菌：后果較嚴(yán)重，染菌的時(shí)間越早，危害越大，染菌量越多，危害越大。染菌原因：公共系統(tǒng)引起染菌，影響面大，后果嚴(yán)重，公共系統(tǒng)為空氣，總過濾器，空氣管道不嚴(yán)密，公共補(bǔ)料系統(tǒng)，公共系統(tǒng)染菌，就會(huì)引起連續(xù)染菌，大面積染菌。（二）引起染菌的主要途徑和原因

生產(chǎn)環(huán)節(jié)

1、種子培養(yǎng)階段可能染菌①生產(chǎn)菌種在保存、轉(zhuǎn)移時(shí)可能染菌②種子擴(kuò)大培養(yǎng)，種子罐可能染菌，培養(yǎng)基可能帶菌防止方法：選育抗污染能力強(qiáng)的菌株，定期進(jìn)行分離，嚴(yán)格無菌操作，培養(yǎng)基首先要進(jìn)行無菌試驗(yàn)，種子本身也要做無菌試驗(yàn)。2、培養(yǎng)基滅菌不徹底，培養(yǎng)基要求滅菌徹底，培養(yǎng)基盡量不能破壞，滅菌過程中，培養(yǎng)基要達(dá)到預(yù)定體積，培養(yǎng)基滅菌后泡沫不可太多，培養(yǎng)基滅菌方法連續(xù)消毒，優(yōu)點(diǎn)高溫短時(shí)培養(yǎng)基破壞較小，實(shí)罐消毒（分批清毒）培養(yǎng)基裝到罐中，蒸氣通入罐中進(jìn)行消毒，培養(yǎng)基滅菌的幾個(gè)環(huán)節(jié)易造成染菌的：①冷空氣排除不徹底造成假壓，蒸汽預(yù)熱80~90°（三路進(jìn)氣列管排料管進(jìn)空氣管）②蒸氣走短路，由于空氣走阻力小的管道③負(fù)壓抽吸：滅菌后，不可立即排冷卻水，要通無菌空氣保壓，空氣冷卻后收縮，壓力突然下降，把外面冷空氣在嚴(yán)密度不夠的縫隙進(jìn)去。④泡沫過多，當(dāng)進(jìn)氣過分，使泡沫過多，其傳熱性差，使其中雜菌保留。3、空氣系統(tǒng)：空氣過濾與統(tǒng)出問題主是要過濾介質(zhì)失效。4、設(shè)備滲漏：設(shè)備安裝不合理，有死角存在（三）情況分析雜菌類型：染芽孢者：設(shè)備死角，使芽孢存活。染霉菌：培養(yǎng)基滅菌不徹底之故。染球菌：大部分從空氣來，主要是空氣過濾器失效。染G-：大部分從水中來，是由于設(shè)備的滲漏。還可以從染菌的規(guī)模來分析：如車間中多罐同時(shí)染菌，且菌類型相同，則問題出在公共系統(tǒng)，如連消系統(tǒng)，空氣總過濾器，共同的移種管道，加油管道，補(bǔ)料管道，如單罐連續(xù)染菌，與此罐相聯(lián)系的系統(tǒng)，包括分過濾器，與此罐相聯(lián)的管道死角。如偶然染菌這種情況較復(fù)雜，幾種情況都可能，偶爾單罐染菌，則為操作不慎引起。從染菌時(shí)間來分析：如發(fā)酵早期染菌，可能種子罐染菌，培養(yǎng)基滅菌不徹底，發(fā)酵中、早期染菌設(shè)備滲漏，管道有死角還可能操作不慎。染菌防治，以防為主。嚴(yán)格無菌操作，加強(qiáng)對(duì)染菌的監(jiān)測(cè)，已染菌要盡可能挽救，挽救的幾種方法：種子罐染菌：先滅菌，再倒罐，再空消取備用種或倒種，發(fā)酵罐染菌，根據(jù)染菌時(shí)間不同采取相應(yīng)的方法。前期染菌：如染的菌危害不大，采取補(bǔ)種的方法，使生產(chǎn)菌在發(fā)酵罐中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，如染的菌危害性較大，一般采用先補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)再重新滅菌的方法，再接種。如染的菌危害極大，一般先放掉一部分發(fā)酵液，新配一部分培養(yǎng)基加入，滅菌再接種，再發(fā)酵。中后期染菌：①用降低罐溫，調(diào)