紫外可見04課件

衛(wèi)生檢驗(yàn)基礎(chǔ)營養(yǎng)與保健醫(yī)學(xué)系

第三章紫外可見分光光度法紫外－可見分光光度法(Ultravioletvisiblespectrophotometry)是有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)鑒定的四大光譜(質(zhì)譜、核磁、紅外、紫外－可見)之一，也是儀器分析常用的一種快速、簡便的分析方法。它是根據(jù)物質(zhì)的分子對紫外、可見光區(qū)輻射的吸收特征對物質(zhì)結(jié)構(gòu)和組成進(jìn)行定性或定量的方法。

紫外可見分光光度法近年來，紫外－可見分光光度法由于采用了先進(jìn)的光電二極管陣列及計算機(jī)技術(shù)，使儀器的性能得到極大提高，加上各種應(yīng)用方法的不斷創(chuàng)新與改善，使之達(dá)到了前所未有的水平，成為常規(guī)質(zhì)量控制和質(zhì)量分析不可缺少的方法之一，在工農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境保護(hù)、生命科學(xué)等各領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。第一節(jié)基本原理

物質(zhì)分子吸收一定光能后，外層電子會從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，發(fā)生能級躍遷，產(chǎn)生吸收光譜。分子吸收能量具有量子化特征，它只吸收等于兩個能級之差的能量，即E＝E2－E1＝hv。分子光譜比原子光譜復(fù)雜得多，因?yàn)榉肿又谐鈱觾r電子吸收輻射能量能產(chǎn)生躍遷外，而且還有組成分子的原子在吸收能量后引起的振動和整個分子的轉(zhuǎn)動運(yùn)動，因此分子吸收的總能量是三種運(yùn)動能量之和。E＝E電＋E振＋E轉(zhuǎn)

第一節(jié)基本原理

三種不同運(yùn)動涉及三種躍遷能級，它們之間能量差別依次是E電>E振>E轉(zhuǎn)，所以當(dāng)物質(zhì)吸收能量發(fā)生電子能級躍遷時，不可避免地會伴隨著產(chǎn)生振動能級和轉(zhuǎn)動能級的躍遷，從而導(dǎo)致了分子吸收光譜譜帶變寬。價電子躍遷能級的能量差在1～20ev，相應(yīng)的光輻射波長為200～760nm，屬紫外可見區(qū)，其光譜就稱為紫外可見吸收光譜。

二.紫外－可見吸收光譜

與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

1.有機(jī)化合物的吸收光譜紫外－可見吸收光譜由分子的價電子躍遷決定。分子組成不同，產(chǎn)生的吸收光譜也不同。分子吸收能量后，外層價電子將從成鍵軌道躍遷至能量較高的反鍵軌道中，在紫外、可見區(qū)域常見的躍遷包括，n,n,四種，各種電子由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)時所需能量不同，它們所需的能量依次如下：

>n

>nn和躍遷是用紫外、可見分光光度法研究有機(jī)物的最常見的躍遷類型。這類躍遷易發(fā)生，所需能量使吸收波長都處在200nm以上區(qū)域，所涉及的基團(tuán)都具有不飽和的鍵，這種含不飽和鍵的基團(tuán)稱為生色團(tuán)。(1)共軛雙鍵的數(shù)目具有共軛雙鍵體系、結(jié)構(gòu)相似的一系列有機(jī)化合物,隨著共軛雙鍵的增加,化合物的最大吸收顯著紅移,吸收強(qiáng)度增大,顏色加深。對芳香化合物,隨著共軛體系的增大,最大吸收顯著紅移,顏色加深。(2)助色團(tuán)

共軛體系的有機(jī)化合物分子中,引入吸電子或給電子助色團(tuán),最大吸收向長波方向移動,顏色加深;在共軛體系的兩端或苯環(huán)的對位同時引入兩種不同性質(zhì)的助色團(tuán),其助色作用更為顯著。(3)分子離子化

含有吸電子或給電子助色團(tuán)的有機(jī)化合物分子具有離子化的特性,這種離子化作用導(dǎo)致吸電子基的吸電子能力或給電子基的推電子能力加強(qiáng),共軛體系的電子云發(fā)生偏移極化,躍遷的能級差縮小,最大吸收峰紅移,顏色加深。(5)空間位阻效應(yīng)

共軛分子中,各原子都處在同一平面內(nèi),能產(chǎn)生最好的共軛作用,當(dāng)共軛分子的平面結(jié)構(gòu)因空間位阻或其它因素的影響而受到破壞時,共軛體系被分割,電子云重疊程度減弱,在共軛體系中電子的流動性受到某種程度的阻礙,最大吸收向短波方向移動,顏色變淺。2.金屬配合物的

電子吸收光譜

金屬離子與配位體反應(yīng),從生色機(jī)理上看,可分成三種類型:(1)配位體微擾的金屬離子d－d電子躍遷和f－f電子躍遷(2)電荷轉(zhuǎn)移躍遷光譜(3)金屬離子微擾的配位體內(nèi)電子躍遷。對某一金屬配合物來說，可能來自其中的一種或幾種同時起作用。對一自由態(tài)過渡金屬離子，在沒有電磁場作用下，離子處于五重簡并的基態(tài)。在水溶液中，當(dāng)有水分子或其它配位體與金屬離子形成配合物時，d軌道與配位體偶極子作用，破壞了d軌道的簡并性，使d軌道分裂為2個或多個能級組，吸收紫外－可見光能量時，就可能在分裂之后的能級見發(fā)生電子躍遷，形成d－d電子躍遷光譜。電荷轉(zhuǎn)移吸收光譜在許多無機(jī)化合物、有機(jī)化合物和過渡金屬配合物中都可見到，在分光光度法中有重要意義。當(dāng)分子吸收輻射后，分子中的電子從主要定域在金屬M(fèi)的軌道轉(zhuǎn)移到配位體L的軌道或按相反方向轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生的吸收光譜叫電荷轉(zhuǎn)移吸收光譜。這種光譜通常發(fā)生在具有d電子過渡金屬和有鍵共軛體系的有機(jī)分子中，故又稱d－生色團(tuán)。電荷轉(zhuǎn)移光譜主要有三種類型：配位體金屬的電荷轉(zhuǎn)移，金屬配位體的電荷轉(zhuǎn)移以及金屬金屬間的電荷轉(zhuǎn)移光譜。

金屬離子與有色的有機(jī)配位體反應(yīng)生成配合物所引起的顏色變化，主要決定于金屬離子與配位體之間成鍵的性質(zhì)。當(dāng)金屬離子與配位體分子結(jié)合本質(zhì)上是靜電的，則金屬離子類似于配位體質(zhì)子化的方式影響其光譜，這種影響通常表現(xiàn)為配合物的吸收光譜稍向紅移或紫移，但吸收光譜的形狀和摩爾吸收光系數(shù)變化不顯著。三.光的選擇性吸收和

朗伯－比爾定律

物質(zhì)對光的吸收具有選擇性，物質(zhì)只能吸收其特定波長的光，有色物質(zhì)都是由于吸收了可見光中的部分光，顯示的顏色是吸收光的補(bǔ)色；物質(zhì)對紫外光的吸收也有選擇性，化合物的分子結(jié)構(gòu)不同，對光的吸收也不同，這即是紫外－可見分光光度法的定性原理。

四.影響準(zhǔn)確度的因素

1.反射和散射效應(yīng)的影響2.化學(xué)反應(yīng)引起的誤差3.待測組分濃度的影響4.溶劑及試劑中雜質(zhì)的影響5.狹縫寬度6.吸收池引起的誤差1.反射和散射效應(yīng)的影響

光束在空氣－吸收池和吸收池－溶液界面上的反射一般不致引起比爾定律的偏離，但如果樣品溶液和參比溶液或者不同的樣品溶液的折射率不同而引起反射損失不同，就會產(chǎn)生誤差。物質(zhì)的吸收定律只適用于均勻介質(zhì)的吸收體系，如果待測溶液有混濁質(zhì)點(diǎn)，當(dāng)輻射通過時，將產(chǎn)生散射效應(yīng)，散射光的一部分和透射光一起進(jìn)入檢測器，導(dǎo)致偏離吸收定律。然而，混濁試樣在生化、臨床和環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域中極為常見，為了減小或消除由此引起的誤差，可采用雙波長或三波長分光光度法。2.化學(xué)反應(yīng)引起的誤差

分光光度法涉及的酸堿反應(yīng)、絡(luò)合反應(yīng)、締合反應(yīng)、溶劑化反應(yīng)及各種有機(jī)反應(yīng)，當(dāng)反應(yīng)達(dá)到平衡時，如被測組分的表觀濃度與其真實(shí)濃度存在一定的差別，會導(dǎo)致偏離比爾定律。4.溶劑及試劑中雜質(zhì)的影響

有些溶劑，分子與待測物分子間由于形成氫鍵或溶劑化合物，使吸收帶變寬，對比爾定律產(chǎn)生偏離，溶劑中的雜質(zhì)有時在測定波長也會產(chǎn)生吸收，因此，測定時應(yīng)盡量使用高純度溶劑。5.狹縫寬度

狹縫寬度影響光譜的純度，也影響吸光度值，為了得到精細(xì)的光譜結(jié)構(gòu)，必須用最小的狹縫，但小的狹縫寬度，使輻射能明顯減小，給微弱吸收帶的測量造成困難，因此，在定量分析時為了得到足夠的測量信號，應(yīng)采用較大狹縫；在定性分析時采用較小的狹縫。當(dāng)出射狹縫和入射狹縫的寬度相等時，狹縫寬度引起的誤差最小。

單色器即色散裝置，是使不同波長的光以不同角度發(fā)散的組件。儀器中常用的兩種色散元件是棱境和全息光柵。吸收池即樣品池，由玻璃或石英制成，玻璃吸收池只能用于可見光區(qū)，而石英吸收池既可用于可見光區(qū)也可用于紫外光區(qū)。檢測器將光信號轉(zhuǎn)換為電信號，理想的檢測器應(yīng)有寬的線性響應(yīng)范圍，噪聲低，靈敏度高。分光光度計的檢測器一般為光電倍增管或光電二極管。目前采用的二極管陣列檢測技術(shù)是紫外－可見分光光度計的一個革新，一臺普通的二極管陣列光度計相當(dāng)于上百臺普通的分光光度計，它采用“倒光學(xué)”系統(tǒng)設(shè)計，使得每一時刻獲得的是波長范圍內(nèi)每一波長的吸收值，每一時刻都可獲得一全波長的測定光譜。二.分光光度計類型

商品化的分光光度計有不同的構(gòu)型，按光路系統(tǒng)可分為單光束、雙光束和分光束分光光度計；按測量方法可分為單波長和雙波長分光光度計。傳統(tǒng)的分光光度計和二極管陣列分光光度計都是單光束的。單光束儀器成本較低，而且簡單的光路可提供高的光通量，因此靈敏度高。國家標(biāo)準(zhǔn)研究機(jī)構(gòu)，如美國的國家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)研究所及英國的國家物理實(shí)驗(yàn)室使用的標(biāo)準(zhǔn)分光光度計都是單光束分光光度計。

二.分光光度計類型

雙光束分光光度計的設(shè)計是用于消除測量空白和樣品池之間由光源強(qiáng)度變化引起的誤差。這種設(shè)計中，在接近光源的光路處放一斬光器，依次將光線從參比光路和樣品光路送入檢測器，斬光器以一定速度旋轉(zhuǎn)，使空白和樣品的交替測量每秒進(jìn)行數(shù)次，因此能校正光源強(qiáng)度中的漂移。分光束分光光度計類似于雙光束分光光度計，但它使用一個分裂器代替斬光器將光分成兩束同時穿過參比和空白的光路，再到達(dá)兩個分開但一樣的檢測器。這個結(jié)構(gòu)可同時測定樣品和空白，在機(jī)械設(shè)計方面比真正的雙光束簡單，但由于它使用兩個獨(dú)立的檢測器，會引起另一種潛在的漂移。

二.分光光度計類型

雙波長分光光度計的單色器含有兩個色散裝置(實(shí)際上是雙色器)，輸出兩束單色光，通過斬光器使不同波長的兩束光交替地照射到同一盛有樣品液的吸收池，記錄兩個波長的吸光度差。它的優(yōu)點(diǎn)是能夠消除背景吸收和干擾吸收。這種復(fù)雜的儀器一般比傳統(tǒng)的分光光度計貴得多，現(xiàn)大部分已被多波長二極管陣列分光光度計代替。三.儀器性能檢定

1.波長準(zhǔn)確度和波長重復(fù)性儀器性能是否處于正常工作狀態(tài)將直接影響到測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性,因此儀器在使用前對某些儀器參數(shù)進(jìn)行檢定是很有必要的。主要檢定過程如下:

(1)氘燈檢定用儀器固有的氘燈,取單光束能量方式,采用波長掃描,掃描速度慢(如15nm/min),響應(yīng)快,最小帶寬(如0.1nm),量程取0%~100%或參照儀器說明書設(shè)定條件,在波長486.02nm及656.10nm兩個單峰重復(fù)掃描三次,測量譜圖上的兩條譜線波長,與表1比較,同時計算及。

表1氘燈的反射波長(nm)編號12波長486.02656.10

＝－

＝max－min

――波長的準(zhǔn)確度――波長的重復(fù)性

――波長測量的平均值――波長標(biāo)準(zhǔn)值

max、min――三次測量波長的最大值與最小值

波長的準(zhǔn)確度和重復(fù)性概念經(jīng)常被混淆。比較不同儀器之間的測量結(jié)果時，波長的準(zhǔn)確度十分重要；而同一臺儀器測量時，波長的重復(fù)性是最重要的。準(zhǔn)確的定量分析所選擇的分析波長應(yīng)是最大吸收波長，而二極管陣列分光光度計是波長設(shè)置重復(fù)性極佳的儀器。(2)氧化鈥玻璃檢定

測量條件同上,量程0~2A。將氧化鈥玻璃置于樣品室內(nèi)，以空氣作參比，在波長220nm~660nm范圍掃描，取譜圖上二條譜線的波長與表2比較，并計算和，計算方法同氘燈檢定。2.透過率準(zhǔn)確度與透過率重復(fù)性

(1)紫外區(qū)儀器帶寬取2nm,用標(biāo)準(zhǔn)石英吸收池分別盛裝空白溶液及重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液(標(biāo)準(zhǔn)溶液配制方法見參考文獻(xiàn)4),在235nm、257nm、313nm和350nm四個波長處連續(xù)三次測量其透過率，計算透過率準(zhǔn)確度r。

(2)可見光區(qū)儀器帶寬取2nm,用一組透過率為10％、20％、30％的光譜中性濾光片，以空氣為參比，分別在波長440nm、546nm和635nm處連續(xù)三次測量透過率，與中性濾光片的透過率標(biāo)準(zhǔn)值比較，同樣計算r和r。

r＝T－Tr

r＝Tmax－TminT――透過率平均值Tr――透過率標(biāo)準(zhǔn)值Tmax、Tmin――三次測量透過率的最大值和最小值此外,根據(jù)實(shí)際需要,也可對光譜分辨率或光譜帶寬、噪聲、漂移等參數(shù)進(jìn)行檢定。第三節(jié)定量分析

紫外－可見分光光度法主要用于定量分析。一.單組分定量方法

常用的方法有標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)對照法。根據(jù)Larbert－Beer定律，配制一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以不含被測組分的空白溶液為參比，在相同條件下測定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，繪制吸光度－濃度曲線，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線；在相同條件下測出未知樣品的吸光度值，從曲線上找出與之對應(yīng)的濃度就可知未知樣品的濃度了。標(biāo)準(zhǔn)對照法是在相同的條件下測出標(biāo)準(zhǔn)品和未知樣品的吸光度值，根據(jù)As＝kCs,Ax＝kCx可得Cx＝CsAx/As二.多組分分析

按照Larbert－Beer定律，物質(zhì)的吸光度與吸收特定波長下照射光的分子數(shù)成正比，也就是一種混合物在任何波長下的吸光度等于混合物中各組分在該波長下的吸光度之和。1.聯(lián)立方程法簡便的多組分分析方法是選擇和混合物中待測物質(zhì)數(shù)目相同的不同波長測定吸光度，選定的波長通常是每個組分最大吸收值的波長，各波長下混合物的最大吸光度值為該波長下各組分吸光值之和。A1(x+y)＝A1x+A1y=1xbCx+1ybCyA2(x+y)＝A2x+A2y=2xbCx+2ybCy解出上面的聯(lián)立方程，就可得到各組分物質(zhì)的濃度。式中A1和A2分別是組在波長1和2時的吸光度，1和2是組分在波長1和2時的摩爾吸光系數(shù)。2.最小二乘法隨機(jī)噪聲的影響可通過附加的光譜信息來降低，即采用多點(diǎn)定量而不只是兩點(diǎn)的數(shù)據(jù)，在遵守Beer定律和光吸收加和原理時，設(shè)吸收池的厚度為1cm，則A＝1C1＋2C2A/1=C1+C22/1或A/2=C11/2+C2A為混合物總吸光度,1和2為組分1和組分2的摩爾吸光系數(shù)。將式作y＝a+bx的一元回歸處理，即可分別求得C1和C2。用聯(lián)立方程法和最小二乘法得到準(zhǔn)確分析結(jié)果的必要條件是：要用純標(biāo)樣或樣品中有紫外光譜吸收的每個組分的混合標(biāo)樣進(jìn)行校正，未知樣品不允許有額外的光吸收。其他多組分分析的統(tǒng)計方法有偏最小二乘法、關(guān)鍵組分回歸法、多重最小二乘法，理論上，這些方法較前面提到的方法各有優(yōu)點(diǎn)，而實(shí)際上校正過程是相當(dāng)復(fù)雜的。第四節(jié)光譜干擾及校正方法一.干擾類型1.其它物質(zhì)吸收干擾在理想情況下，使用紫外－可見分光光度法測量時，應(yīng)該只有待測物才會產(chǎn)生吸收，而實(shí)際上由于物理和化學(xué)的原因，常會產(chǎn)生很多干擾測量的吸收。若在待測物吸收光譜區(qū)域內(nèi)存在其它吸收物質(zhì)，則會產(chǎn)生吸光度測量的誤差。某些情況下，只存在一種已知干擾物，如合成藥劑時的副產(chǎn)物；另一些情況，會有很多種吸收干擾物，而且大多數(shù)是未知干擾物，如血液等生物樣品，可以產(chǎn)生很多強(qiáng)的基體吸收。2.散射

在藥物和生物樣品分析中，常會出現(xiàn)由于溶液中存在懸浮顆粒，發(fā)生散射的問題。光散射會產(chǎn)生背景吸收，干擾吸光度測量。散射時，入射光照射到溶液中卻改變了方向,因此，即使沒有吸收，到達(dá)檢測器的光也會減弱。在紫外－可見光譜區(qū)，可觀察到兩種類型的散射：一種是瑞利(Reyleigh)散射，出現(xiàn)在散射粒子小于光線波長的情況下，散射強(qiáng)度與波長四次方成反比;另一種是丁達(dá)爾(Tyndall)散射，出現(xiàn)在散射粒子大于光線波長的情況下，強(qiáng)度與波長平方成反比。散射造成的誤差隨波長減小而增加。

二.干擾校正方法

消除或減小干擾誤差的校正方法很多，一般來說，如果誤差來源已知，且不隨樣品而變，就能消除該誤差；另一方面，如果誤差來源未知，且隨樣品變化，誤差能降低但不能完全消除。校正技術(shù)通常至少要在兩個波長處采集數(shù)據(jù)，更高級的校正技術(shù)需要多波長或全光譜數(shù)據(jù)。1.雙波長分光光度法雙波長分光光度法也稱等吸收度消去法。當(dāng)干擾物已知，吸收光譜也已知時，該干擾物在測定波長下對待測物產(chǎn)生的誤差可通過選擇參比波長加以消除。測定時選擇一個測定波長2，一個參比波長1，選擇原則是在這兩個波長下使干擾組分的吸收相等，則樣品的總吸光度是：A1＝A1樣＋A1干A2＝A2樣＋A2干

A＝A2－A1＝（A2樣－A1樣）＋〔A2干－A1干〕因A2干＝A1干

A＝2bC樣－1bC樣＝（2－1）bC樣＝kC樣由此測得的混合物的吸光度差值A(chǔ)只與待測組分的濃度成線性關(guān)系，而與干擾組分無關(guān)。關(guān)于等吸收點(diǎn)波長的選擇，常用的方法有作圖法，一波長固定、另一波長掃描法和系數(shù)倍率法等。(1)作圖法

I為待測組分，II為干擾組分，將I的最大吸收波長2作為測定波長，從2向下作橫軸的垂線與II的吸收光譜交于M點(diǎn)，從M點(diǎn)作橫軸的平行線交于II的另一點(diǎn)N，N點(diǎn)對應(yīng)的波長即為1，如圖－1所示。如果等吸收點(diǎn)不止一個，則選擇A應(yīng)足夠大，且1和2波長差較小的兩個波長作為組合波長，以提高測量的精密度。(2)一波長固定、另一波長掃描法

配數(shù)種不同濃度的干擾組分溶液，以待測組分的最大吸收波長為固定波長，對不同濃度的干擾組分溶液進(jìn)行掃描，得到一組吸收光譜群，從吸收光譜群和基線可以找到1和2，如圖－2所示。此法組合得到的2和1能克服作圖法選擇等吸收點(diǎn)因干擾組分濃度變化而影響吸收光譜形狀的特點(diǎn)，測得的A值不受干擾組分濃度變化的影響。(3)系數(shù)倍率法

亦稱K系數(shù)法。此法適用于干擾組分的吸收光譜無吸收峰的測定。它是在雙波長分光光度計的電學(xué)回路中，引入系數(shù)倍率器，使1和2處的吸光度信號分別按選擇的系數(shù)放大。如用雙波長分光光度法測得的吸光度差為

A＝K2A2－K1A1當(dāng)A2<A1時,設(shè)K1＝1,則

A＝K2A2－A1調(diào)節(jié)系數(shù)倍率器,使K2A2＝A1，則A＝0當(dāng)待測組分與干擾組分吸收峰重疊時，設(shè)待測組分在兩波長處的吸光度分別為A1’和A2’，干擾組分在兩波長處的吸光度分別為A1和A2，兩組分的混合物在兩波長處的吸光度為A1’’和A2’’，調(diào)節(jié)系數(shù)倍率器，使在2處的吸光度增大K2倍，則

A＝K2A2’’－A1’’＝K2(A2＋A2’)－(A1+A1’)=(K2A2－A1)+(K2A2’－A1’)K2A2=A1

A=K2A2’－A1’上式說明，由于調(diào)節(jié)系數(shù)倍率器，可消除沒有吸收峰干擾組分的影響，A只與待測組分的吸光度有關(guān)，與待測組分的濃度成正比。2.背景模型法

背景模型法適合于由物理因素（最常見的是散射）引起的干擾。該方法的原理是分析波長下的干擾情況可由其它波長下的模型外推來估計。選擇一段只有干擾物吸收的光譜，用最小二乘法擬合吸光度的對數(shù)，以此來建立一個多項(xiàng)式來擬合這段光譜。A＝anlgA＝lga+nlgA為吸光度，為波長，n為吸光度和波長關(guān)系的冪，a為常數(shù)，通過擬合得到的系數(shù)，可以估算出所有其它波長背景處的吸收，再將測量值減去估計值即可得到待測物的吸光度值。3.內(nèi)參比法

用一個參比波長的內(nèi)參比法是最簡單的校正技術(shù)之一。該法常在兩次測量時有基線漂移時使用。一般來說，選定的參比波長最好時盡量接近測量波長，但待測物沒有明顯吸收。將分析波長處的吸光度值減去參比波長處的吸光度值，就可消除光譜干擾，只要干擾在全波長范圍內(nèi)是一常數(shù)。雖然，實(shí)際上干擾在全波長范圍內(nèi)并不總為常數(shù)，但這種簡單的技術(shù)卻常能出人意料地提高準(zhǔn)確度。4.三點(diǎn)校正法

亦稱Morton－Stubbs校正，如圖－3所示。該法采用兩個參比波長，參比波長分別選在分析波長兩邊，然后用線性內(nèi)推法估計出分析波長處的背景干擾吸收。這種方法比單波長參比技術(shù)更好，因?yàn)槿魏闻c波長呈線性關(guān)系的背景吸收都可得到校正；在很多情況下，若波長范圍很窄，該法同樣適用來自散射或復(fù)雜基體非線性背景吸收的校正。5.導(dǎo)數(shù)光譜法

導(dǎo)數(shù)光譜法可用于減小或消除很多來源的背景干擾。通過一階求導(dǎo)，恒定的基線補(bǔ)償可以消除；二階求導(dǎo)，隨波長呈線性增加的背景吸收又會被消除，依次類推。第五節(jié)導(dǎo)數(shù)光譜法一.基本原理導(dǎo)數(shù)光譜法又稱微分光譜法。以吸光度A對波長的吸收曲線稱為零階光譜；在零階光譜中，以吸光度的變化dA對波長的變化d的變化率對波長作圖，便可得到一階導(dǎo)數(shù)；以d2A/d2對的圖譜，就是二階導(dǎo)數(shù)光譜。依次類推，可得到更高階數(shù)的導(dǎo)數(shù)光譜。導(dǎo)數(shù)光譜特征導(dǎo)數(shù)光譜具有以下特征：1.零階光譜上的極大在奇數(shù)階導(dǎo)數(shù)光譜中為零;在偶數(shù)階導(dǎo)數(shù)中為極值。因此極小和極大交替出現(xiàn)。2.光譜的極值數(shù)隨導(dǎo)數(shù)階數(shù)的增加而增加，表現(xiàn)為第n階產(chǎn)生n＋1個極值。這是因?yàn)槲涨€上的拐點(diǎn)在奇數(shù)導(dǎo)數(shù)中產(chǎn)生極值，在偶數(shù)導(dǎo)數(shù)中過零點(diǎn)，這些在吸收曲線上原來并不存在的極值是由拐點(diǎn)求導(dǎo)形成的。3.隨著導(dǎo)數(shù)階數(shù)的增加，吸收峰的尖銳程度增大，使譜帶變窄，從而提高了光譜的分辨率。二.干擾消除機(jī)理導(dǎo)數(shù)光譜的最大優(yōu)點(diǎn)是能消除共存組分無關(guān)吸收的干擾。一階導(dǎo)數(shù)光譜可消除對波長呈一次函數(shù)的干擾組分的無關(guān)吸收，原理如下：當(dāng)待測組分與對波長呈一次函數(shù)的干擾組分共存時，則：A＝A待＋A干＝bC＋t＋udA/d＝(d/d)bC＋u這樣，一次函數(shù)的無關(guān)吸收（A干＝t＋u）的一階導(dǎo)數(shù)值成了與濃度無關(guān)的常數(shù)u，其在一階光譜中只影響待測組分一階曲線的縱向位移，而不影響作為定量參數(shù)的振幅值。三.定性分析

導(dǎo)數(shù)光譜圖譜比較復(fù)雜，峰的數(shù)目隨導(dǎo)數(shù)階數(shù)的提高而增加，在定性分析時，這種復(fù)雜性十分有用，既表明了物質(zhì)的特性，又有助于鑒定。導(dǎo)數(shù)光譜可用于放大圖譜間的差別，定性分析中可分辨重疊譜。下圖是一計算機(jī)模擬圖，圖中顯示的是兩個相隔30nm的高斯峰，用光吸收測量時疊加在一起，形成一個極大值位于兩個單獨(dú)峰極大值中間的一個寬帶，兩個峰沒有分開；在四階導(dǎo)數(shù)光譜時，這兩個峰十分明顯，其最大值接近單獨(dú)存在時的兩個最大吸收波長的位置四.定量方法

導(dǎo)數(shù)光譜法可以減少定量分析中來自散射、基體及其它吸收物的干擾影響，吸收光譜服從Beer定律，為討論方便，令b＝1cm，則A＝C對求導(dǎo)，有dA/d＝(d/d)Cd2A/d2＝(d2/d2)C上式表明，導(dǎo)數(shù)信號與濃度成正比，這是導(dǎo)數(shù)光譜法的定量依據(jù)。信號對濃度的靈敏度取決于吸光系數(shù)在特定波長下的變化率。通過對導(dǎo)數(shù)信號的測量，可以對待測組分的含量準(zhǔn)確定量。1.基線法又稱正切法畫一條直線正切于兩個相鄰的極大或極小，測量中間的反向峰峰尖至切線的距離b，b值與待測組分標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度成正比，可得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。此法能較好的適用于非線性吸收干擾試樣的測定。2.峰－零法在基線平直條件下，通過測量峰至基線間的距離來確定待測組分的含量，極值至零值間的垂直距離正比于濃度C。