發(fā)酵滅菌染菌知識(shí)理論篇優(yōu)秀課件

發(fā)酵滅菌染菌知識(shí)理論篇第1頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三發(fā)酵滅菌染菌（理論部分)第2頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三發(fā)酵滅菌染菌理論培訓(xùn)發(fā)酵滅菌篇

1.基礎(chǔ)知識(shí)2.發(fā)酵設(shè)備發(fā)酵染菌篇1.基礎(chǔ)知識(shí)2.染菌原因分析3.案例分析第3頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三滅菌生物化學(xué)工程是以活細(xì)胞或由細(xì)胞提取出來的酶為催化劑的反應(yīng)過程,所以必須進(jìn)行純種培養(yǎng),也就是只允許生產(chǎn)菌存在、生長(zhǎng)和繁殖,不允許其他微生物共存。第4頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三第5頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三1.1培養(yǎng)基滅菌培養(yǎng)基滅菌是指殺滅培養(yǎng)基中具有生活能力的細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)體及其孢子,工業(yè)規(guī)模上的液體培養(yǎng)基滅菌比除去雜菌更為常用,其中熱滅菌最為簡(jiǎn)便、有效和經(jīng)濟(jì)。微生物受熱被殺死,主要原因是高熱能使蛋白質(zhì)變性。第6頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三1.1.1分批滅菌分批滅菌也稱實(shí)罐滅菌,全過程包括升溫、保溫、降溫3個(gè)階段分批滅菌的溫度隨時(shí)間的變化過程取決于加熱方式、換熱面積的大傳熱系數(shù)的高低、換熱介質(zhì)的溫度、培養(yǎng)基的質(zhì)量因素。熱阻死亡活化能(ΔE)第7頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三很明顯，最不想死的是細(xì)菌孢子！第8頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三阿倫尼烏斯方程k＝Ae-E/RT(式中A為指前因子;R為氣體常數(shù)；T為熱力學(xué)溫度),以反應(yīng)速率常數(shù)k表示的反應(yīng)速率主要決定于反應(yīng)活化能E,若催化使反應(yīng)活化能降低ΔE,則反應(yīng)速率即提高e-ΔE/RT倍。試驗(yàn)證明,細(xì)菌孢子熱死滅反應(yīng)的ΔE很高,而有些有效成分熱破壞反應(yīng)的ΔE較低,因而提高滅菌溫度T會(huì)加快細(xì)菌孢子的死亡速率,從而縮短高溫下的滅菌時(shí)間,由于其他有效成分的死亡活化能很低,溫度提高只能稍微增大其熱破壞程度,但滅菌時(shí)間顯著縮短,其結(jié)果是有效成分的破壞量反而大為減少。第9頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三1.1.2連續(xù)滅菌連續(xù)滅菌的加熱、保溫和冷卻3個(gè)階段分別在不同的專有設(shè)備中進(jìn)行。第10頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三板式熱交換器連續(xù)滅菌裝置的特點(diǎn)是單位體積的熱交換器具有較高的傳熱面積,且可根據(jù)生產(chǎn)需要改變其換熱面積的大小;蒸汽噴射連續(xù)滅菌裝置的特點(diǎn)是加熱、冷卻極為短暫,缺點(diǎn)是培養(yǎng)基會(huì)被蒸汽的冷凝水稀釋。下面是組合式第11頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三1.2空氣除菌在發(fā)酵過程中,微生物的生長(zhǎng)和繁殖需要大的氧氣,這就需要輸入大量的空氣來提供氧氣。氣中的微生物多為細(xì)菌、細(xì)菌孢子,也有真菌、酵和病毒,其大小從幾微米到幾百微米不等,小的微生物附在空氣中的灰塵上,灰塵的平均尺寸約為0.1μm。粗濾器可將粗的微粒除去,0.5～2.0μm的粒及細(xì)菌微生物由空氣過濾器除去。過濾器第12頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三1.2.1空氣除菌方法(1)加熱滅菌。(2)輻射滅菌。波長(zhǎng)226.5～328.7nm的紫外(3)化學(xué)滅菌。滅菌后續(xù)工作比較麻煩(4)靜電除塵。還是設(shè)備問題，效果很好(5)介質(zhì)過濾。也就是過濾器第13頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三1.2.2空氣除菌流程第14頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三2.1閥門的選用發(fā)酵罐物料對(duì)輸送閥門的要求甚嚴(yán),既要保證運(yùn)行時(shí)絕對(duì)不漏(否則將造成整批物料的染菌),同時(shí)又要承受定期蒸汽滅菌高溫的影響。第15頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三常用閥門截止閥針形閥旋塞閥球形閥手動(dòng)隔膜閥第16頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三

截止閥也叫球心閥，截閥。優(yōu)點(diǎn)：密封面摩擦力小，耐用；嚴(yán)密性能好，易于開關(guān)，維修方便；開啟高度可以使用絲扣拉桿控制，易于調(diào)節(jié)流量；耐受高溫及壓力，不易損壞。缺點(diǎn)：截止閥閥芯阻力大，影響流量和流速；截止閥不易于在黏稠的物料中使用，這樣回造成閥門的密封面不嚴(yán)密而泄漏；截止閥安裝時(shí)有方向性，逆向安裝會(huì)造成阻力更大，但在發(fā)酵罐的連接上，必須注意與發(fā)酵罐為正向，與管路流向?yàn)槟嫦虬惭b。第17頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三針形閥一般是用來控制微量調(diào)節(jié)的小型閥門，它的一般通徑有15mm和10mm兩種。優(yōu)點(diǎn)：耐受高溫、高壓、不易腐蝕；易于控制微量流速和流加、滴加補(bǔ)料；操作方便，易于更換。缺點(diǎn)：易于損壞，尤其是閥頭容易掉頭；因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)小，通道小，所以容易被堵塞。第18頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三旋塞閥也稱考克，是一種不耐受高溫和高壓，但又易于操作的閥門。材質(zhì)一般以鑄鐵為主，這就決定了它不能耐受高溫（一般要求小于等于100℃）和高壓，不能猛力開關(guān)，以免扭斷、變形。第19頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三球形閥也稱球閥。特點(diǎn)：流體阻力小，流量大，極小有壓差的表現(xiàn)；不受安裝的方向性的制約；能耐受高溫高壓，耐腐蝕，嚴(yán)密性好，閥體本身不存在死角，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，極少有滲漏點(diǎn)。缺點(diǎn)：不能做微量調(diào)節(jié)使用，最好是全開或全閉；盡管能耐受高溫，也不要在長(zhǎng)期高溫管路上使用。第20頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三手動(dòng)隔膜閥也稱隔閥，它是依靠橡膠隔膜和聚四氟隔膜，通過手動(dòng)拉桿的緊密壓合而達(dá)到開啟和密閉的。特點(diǎn)：流體阻力小，流速不受影響；可以在黏稠或有顆粒的介質(zhì)上；介質(zhì)不會(huì)于閥頭部分接觸，因此不存在閥頭填料密封處泄漏的弊端；結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單耐受腐蝕。缺點(diǎn)：除特制的耐高溫高壓的隔膜閥外，一般的手動(dòng)隔膜閥不耐受高溫高壓，一般公稱壓力在6Kgf/cm2，溫度為80℃，最高耐受溫度180℃；容易損壞，滲漏，變形；必須定期更換隔膜閥墊。第21頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三止回閥又稱止逆閥、單向閥等。止回閥是依靠液體本身的動(dòng)力自動(dòng)啟閉閥門，它的作用是阻止介質(zhì)的逆向流動(dòng)。特點(diǎn)：介質(zhì)在閥體內(nèi)單向流動(dòng)，阻止介質(zhì)倒流；耐受高溫、高壓，不易變形。缺點(diǎn)：不能使用在黏稠和有顆粒的物料介質(zhì)上，因?yàn)橹够亻y的密封面一旦有黏稠物或有顆粒物的時(shí)候，止回閥就會(huì)失去單向的意義，起不到防止物料倒流的作用；不能使用在有腐蝕性介質(zhì)的管路上。第22頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三2..2空氣過濾器膜的介紹（了解）分離機(jī)理：氣體—阻留、沉積、擴(kuò)散、攔截、靜電…膜材料：醋纖—三醋纖、磺化聚砜、磺化聚醚砜、芳香聚酰胺、陶瓷…供應(yīng)廠商：PAULDHMILIPOR上海過濾器廠上海一鳴第23頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三

雜菌的類型空氣中的微生物大多數(shù)是細(xì)菌和芽孢,還有一定數(shù)量的霉菌、酵母和病毒。細(xì)菌的大小有零點(diǎn)幾微米至幾個(gè)微米.根據(jù)以上特點(diǎn)我們應(yīng)得出如下結(jié)論：A：這些微生物在空氣中極少單獨(dú)游離存在,基本上是附著于灰塵、液滴等微粒的表面上。B：介質(zhì)過濾除菌就是把空氣中的各種微粒和極少量的游離微生物捕集起來予以除掉。請(qǐng)問我們通常所用的空氣過濾器是多少um的？為什么0.3u可以保證無菌發(fā)酵生產(chǎn)的原因。第24頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三1.2無菌檢查與染菌的處理在抗生素生產(chǎn)過程中,為了及早發(fā)現(xiàn)染菌并進(jìn)行恰當(dāng)處理,保證生產(chǎn)正常進(jìn)行,對(duì)菌種制備、種子罐、發(fā)酵罐的接種前后和培養(yǎng)過程中,須要按工藝規(guī)程要求按時(shí)取樣，進(jìn)行無菌檢驗(yàn)。第25頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三

無菌檢查培養(yǎng)液是否污染雜菌可從三個(gè)方面進(jìn)行分析：a:無菌試驗(yàn)（主要依據(jù)）b:培養(yǎng)液的顯微鏡檢查c:培養(yǎng)液的生化指標(biāo)變化情況。第26頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三

無菌試驗(yàn)現(xiàn)在采用的無菌試驗(yàn)方法有肉湯培養(yǎng)法、雙碟培養(yǎng)法、斜面培養(yǎng)法。其中以酚紅肉湯培養(yǎng)法和雙碟培養(yǎng)法結(jié)合起來進(jìn)行無菌檢查用的較多。無菌試驗(yàn)的結(jié)果一般需要8~12小時(shí)才能作出判斷。為了縮短判斷時(shí)間,有時(shí)向培養(yǎng)基中加入赤霉素、對(duì)氨基苯甲酸等生長(zhǎng)激素以促進(jìn)雜菌的生長(zhǎng)第27頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三

肉湯培養(yǎng)法

直接用裝有酚紅肉湯的無菌試管取樣,然后放入37℃恒溫室(箱)內(nèi)培養(yǎng)。定時(shí)觀察試管內(nèi)肉湯培養(yǎng)基的顏色變化,同時(shí)進(jìn)行顯微鏡觀察。第28頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三斜面培養(yǎng)法先用空白無菌試管取樣,然后在無菌條件下接種于斜面培養(yǎng)基上,置于37℃恒溫室(箱)內(nèi)培養(yǎng)。定時(shí)觀察有無雜菌菌落生長(zhǎng)。第29頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三

雙碟培養(yǎng)法種子罐樣品先取入肉湯培養(yǎng)基中,然后在無菌條件下在雙碟培養(yǎng)基上面劃線,剩下的肉湯培養(yǎng)物在恒溫室(箱)內(nèi)培養(yǎng)6小時(shí)后復(fù)劃線一次,發(fā)酵罐培養(yǎng)液直接取入空白無菌試管中,于37℃下培養(yǎng)6小時(shí)后在雙碟培養(yǎng)基上劃線。24小時(shí)內(nèi)的雙碟定時(shí)在燈光下檢查有無雜菌生長(zhǎng)。24小時(shí)~48小時(shí)的雙碟1天檢查一次,以防生長(zhǎng)緩慢的雜菌漏檢。正常生產(chǎn)過程中,種子罐和發(fā)酵罐每隔8小時(shí)取樣一次,進(jìn)行無菌檢查。該方法經(jīng)常用于單菌落挑選，可以從染有雜菌的培養(yǎng)液中經(jīng)多次劃線挑取單菌落進(jìn)行分離培養(yǎng)，得到純種的種子第30頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三染菌的判斷培養(yǎng)基的染菌判斷是錯(cuò)綜復(fù)雜的工作,又是一種細(xì)微觀察、認(rèn)真分析的王作。第31頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三染菌罐的判斷方法以無菌試驗(yàn)中的酚紅肉湯培養(yǎng)和雙碟培養(yǎng)的反應(yīng)為主,以鏡檢為輔。每個(gè)無菌樣品的無菌試驗(yàn)，至少用2只酚紅肉湯或斜面同時(shí)取樣培養(yǎng)。要定量或用接種環(huán)蘸取法取樣，公司現(xiàn)階段基本都直接從發(fā)酵罐直接取樣。因取樣量不同,影響顏色反應(yīng)和渾濁程度的觀察。如果連續(xù)3個(gè)時(shí)間的酚紅肉湯無菌樣發(fā)生顏色變化或產(chǎn)生渾濁,或斜面連續(xù)3個(gè)時(shí)間樣品長(zhǎng)出雜菌即判斷為染菌。有時(shí)酚紅肉湯反應(yīng)不明顯,要結(jié)合鏡檢確認(rèn)連續(xù)3個(gè)時(shí)間樣品染菌，即判為染菌。各級(jí)種子罐的染菌判斷亦參照上述規(guī)定。對(duì)肉湯和無菌斜面的觀察及保存期的規(guī)定,發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后應(yīng)取無菌樣，以后每隔8小時(shí)取無菌樣一次，直至放罐。無菌試驗(yàn)的肉湯和雙碟應(yīng)保存并觀察至本罐批放罐后12小時(shí)，確認(rèn)無雜菌污染后方可棄去。無菌檢查時(shí)間應(yīng)每6小時(shí)觀察一次無菌試驗(yàn)樣品，以便能及早發(fā)現(xiàn)染菌。第32頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三染菌率的統(tǒng)計(jì)

以發(fā)酵罐染菌罐批(次)為基準(zhǔn),染菌罐批(次)應(yīng)包括染菌重消后的重復(fù)染菌的灌（批）次在內(nèi)。發(fā)酵總過程(全周期)無論前期或后期染菌,均作“染菌”論處。發(fā)酵罐染菌罐批(次)染菌率(％)＝－－－－－－－－－－X100%

總投罐批(次)第33頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三染菌后的處理污染雜菌的處理發(fā)酵罐污染雜菌后,依據(jù)染菌時(shí)間、所染雜菌的危害性及時(shí)進(jìn)行處理,同時(shí)對(duì)所涉及的設(shè)備也要及時(shí)處理種子罐染菌后都不能往下道工序移種,要及時(shí)用高壓蒸汽直接滅菌后經(jīng)過濾處理放下水第34頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三發(fā)酵罐染菌的處理發(fā)酵罐前期染菌,污染的雜菌對(duì)產(chǎn)生菌的危害性大,采用蒸汽滅菌經(jīng)過濾處理后放掉;如果危害性不大,可用重新滅菌、重新接種的方式處理,如營(yíng)養(yǎng)成分消耗較多,可放掉部分培養(yǎng)液補(bǔ)入部分新培養(yǎng)基后進(jìn)行滅菌,重新接種；如污染的雜菌量少且生長(zhǎng)緩慢,可以繼續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)下去,但要時(shí)刻注意雜菌數(shù)量和代謝的變化。在發(fā)酵的中后期染菌,一是加入適量的殺菌劑,如呋喃西林或某些抗生素,抑制雜菌的生長(zhǎng)。二是降低培養(yǎng)溫度或控制補(bǔ)料量來控制雜菌的生長(zhǎng)速度。如果采用上述兩種措施仍不見效,就要考慮提前放罐第35頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三染菌后的設(shè)備處理

染菌后的罐體用甲醛等化學(xué)物質(zhì)處理,再用蒸汽滅菌〈包括各種附屬設(shè)備〉。在再次投料之前,要徹底清洗罐體、附件,同時(shí)進(jìn)行嚴(yán)密程度檢查,以防滲漏。染菌后的處理尤為重要，很多大面積染菌都是由于處理不徹底而造成的系統(tǒng)污染，造成無法及時(shí)處理好各個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)連續(xù)污染。第36頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三污染噬菌體的處理抗生素等產(chǎn)品發(fā)酵過程中有時(shí)出現(xiàn)噬菌體污染,輕者造成生產(chǎn)能力大幅度下降,重者造成停產(chǎn)。一般噬菌體污染后往往出現(xiàn)發(fā)酵液突然轉(zhuǎn)稀,泡沫增多,早期鏡檢發(fā)現(xiàn)菌體染色不均勻，在較短時(shí)間內(nèi)菌體大量自溶,最后僅殘留菌絲斷片,平皿培養(yǎng)出現(xiàn)典型的噬菌斑,溶氧濃度回升提前,營(yíng)養(yǎng)成分很少消耗,產(chǎn)物合成停止等現(xiàn)象。發(fā)酵過程中污染噬菌體后，一般做如下處理：1.發(fā)酵液用高壓蒸汽滅菌后放掉,嚴(yán)防發(fā)酵液任意流失；2.全部停產(chǎn),對(duì)環(huán)境進(jìn)行全面的清洗和消毒,斷絕噬菌體的寄生基礎(chǔ)；3.更換生產(chǎn)菌種,不斷篩選抗噬菌體菌種,防止噬菌體的重復(fù)污染。污染烈性噬菌體時(shí)出現(xiàn)上述現(xiàn)象。如果污染溫和噬菌體時(shí),其反應(yīng)溫和,平皿培養(yǎng)不出現(xiàn)明顯的噬菌斑,只出現(xiàn)部分菌體自溶,生化指標(biāo)變化不顯著,生產(chǎn)能力降低,對(duì)生產(chǎn)的危害亦是嚴(yán)重的,但不易被發(fā)現(xiàn)。防止溫和噬菌體污染的方法同上所述。第37頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三染菌原因分析

從染菌的規(guī)模和時(shí)間分析在發(fā)酵過程中,如果是種子罐和發(fā)酵罐同時(shí)大面積染菌,雜菌的主要來源可能是空氣凈化系統(tǒng),如空氣過濾器失效或空氣管道滲漏造成的。其次考慮種子制備工序。如果只是發(fā)酵罐大面積染菌,除考慮空氣凈化系統(tǒng)帶菌外,還要重點(diǎn)考查接種管道、補(bǔ)料系統(tǒng)。發(fā)酵培養(yǎng)基采用連續(xù)滅菌工藝時(shí),還要嚴(yán)格檢查連消系統(tǒng)是否帶入雜菌。如果是部分發(fā)酵罐在發(fā)酵早期染菌,可能是培養(yǎng)基滅菌不徹底,或種子罐帶菌,或接種管道滅菌不徹底造成的。如果是發(fā)酵的中后期染菌,重點(diǎn)分析補(bǔ)料系統(tǒng)和加消沫劑系統(tǒng)，個(gè)別發(fā)酵罐連續(xù)染菌,就從單個(gè)罐體查找雜菌來源,如罐內(nèi)是否有“死角”或冷卻系統(tǒng)有滲漏。當(dāng)然還要檢查附件,個(gè)別罐批的散在性染菌,其原因很難追查,要具體情第38頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三從雜菌類型分析發(fā)酵過程染菌,多種菌型出現(xiàn)的機(jī)率多,單菌型機(jī)率較少。染的是耐熱芽孢桿菌時(shí),這與培養(yǎng)基滅菌不徹底或設(shè)備內(nèi)部有“死角”關(guān)系甚大?？諝庵幸泊嬖谘挎邨U菌,污染的雜菌是不耐熱的球菌或桿菌時(shí),可從空氣凈化系統(tǒng)和冷卻系統(tǒng)進(jìn)行追查。第39頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三制服染菌的要點(diǎn)1.種子帶菌或懷疑種子帶菌9.648.接種管穿孔。0.292.接種時(shí)罐壓降至大氣壓力0.199.閥門泄漏1.453.精養(yǎng)基消毒不透0.79110.攪拌軸封的泄漏2.094.總空氣系統(tǒng)帶菌l9.611.罐蓋泄漏l.545.泡沫升至罐頂0.4812.其它設(shè)備泄漏10.136.央套穿孔12.3613.操作問題l0.15'7.蛇管穿孔5.8914.原因不明24.91從上表可以看出的抗生素發(fā)酵染菌原因分析的統(tǒng)計(jì)資料看,空氣凈化系統(tǒng)帶菌是導(dǎo)致染菌的主要因素。但仔細(xì)分析,設(shè)備穿孔和滲漏等造成的染菌占33.85％，占第1位。第40頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三對(duì)空氣凈化系統(tǒng)的要求防止空氣凈化系統(tǒng)帶菌的主要措施有提高空氣進(jìn)口的空氣潔凈度；除盡壓縮空氣中夾帶的油和水,保持過濾介質(zhì)的除菌效率。現(xiàn)在公空氣系統(tǒng)應(yīng)該有了很大的進(jìn)步，不存在油的問題，但在夏秋兩季，由于空氣濕度較大可能出現(xiàn)預(yù)過濾器放出水的現(xiàn)象，因此各個(gè)車間應(yīng)根據(jù)車間情況，定時(shí)放水。另外,在過濾器滅菌時(shí)要防止過濾介質(zhì)被沖翻或燒灼,還要防止發(fā)酵液倒流入空氣過濾器內(nèi)。第41頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三對(duì)設(shè)備的要求發(fā)酵罐及其附屬設(shè)備應(yīng)做到無“滲漏”,無“死角”。設(shè)備、管道等存在死角有以下幾種可能：發(fā)酵設(shè)備由于如焊接等制作不當(dāng)引起的死角，管道安裝不當(dāng)造成的死角，罐底部堆積的固形物形成硬塊從而包埋臟物，罐底的加強(qiáng)板長(zhǎng)期受壓縮空氣頂吹而腐蝕受損或裂縫等造成滅菌不徹底的死角。所以凡與物料、空氣、下水道連接的管件閥門應(yīng)保證嚴(yán)密不漏,蛇管和夾層應(yīng)定期試漏。連續(xù)滅菌設(shè)備要定時(shí)拆卸清洗。無菌操作室和菌種培養(yǎng)間定期消毒,以保持無菌狀態(tài)。第42頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三分析案例－－大觀霉素大觀霉素發(fā)酵生產(chǎn)的染菌率較低。個(gè)別發(fā)酵罐染菌后，生長(zhǎng)代謝所受影響也較小，大多能正常周期放罐，發(fā)酵單位所受損失也不大。99年出現(xiàn)的幾批染菌罐卻表現(xiàn)出了很大異常：確定染菌后，發(fā)酵罐PH開始急劇下降，糖耗快，氨氮降低，發(fā)酵單位開始下滑，只能提前放罐。嚴(yán)重影響正常。本文從染菌原因分析，給制服無菌提供了一個(gè)新思路，為國(guó)內(nèi)抗生素生產(chǎn)廠家對(duì)制服染菌有借鑒作用。第43頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三一：染菌特征1：發(fā)酵罐培養(yǎng)至50小時(shí)左右，33小時(shí)后的無菌肉湯跟蹤樣開始變色，確認(rèn)染菌。此后，發(fā)酵罐PH開始急劇下滑，糖耗快，氨氮下降，發(fā)酵單位停止增長(zhǎng)，60小時(shí)左右提前放罐。2：變色肉湯涂片鏡檢：短桿菌。3：發(fā)酵液（周期60小時(shí)左右）涂片鏡檢：桿菌，已經(jīng)形成芽孢。第44頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三二：雜菌分離、培養(yǎng)1：把變色肉湯接入無菌紅色肉湯，37℃恒溫培養(yǎng)。24小時(shí)后肉湯變黃，表明這種菌代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì)。2：向變色肉湯中加入2滴5M的NaOH溶液，搖勻（PH為10），放置10分鐘。把該肉湯接入無菌肉湯，37℃恒溫培養(yǎng)48小時(shí)，肉湯仍不變色。說明這種雜菌對(duì)堿性環(huán)境的耐受性較差。第45頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三3：用細(xì)菌培養(yǎng)基對(duì)這種雜菌進(jìn)行平板分離，雜菌菌落具有細(xì)菌菌落的典型特征。挑取單菌落接入肉湯，培養(yǎng)特征與直接從染菌罐接入的肉湯中的雜菌一致。鏡檢，雜菌呈短桿狀，可觀察到部分菌體進(jìn)行二分裂繁殖。4：把雜菌接入菌種效價(jià)跟蹤用的發(fā)酵瓶，培養(yǎng)情況與發(fā)酵罐的代謝情況類似。第46頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三5：把雜菌接入空白發(fā)酵瓶，培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行平板分離及肉湯檢測(cè)，結(jié)果證明這種菌能在發(fā)酵瓶中存活、生長(zhǎng)繁殖。由于發(fā)酵瓶和發(fā)酵罐的營(yíng)養(yǎng)成分、培養(yǎng)條件一致，因此可以用發(fā)酵瓶來模擬雜菌在發(fā)酵罐中的生長(zhǎng)情況。第47頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三

三：雜菌耐熱性實(shí)驗(yàn)用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基培養(yǎng)這種菌，吸取定量體積的菌液分別接入11支無菌肉湯。取1支作對(duì)照，另10支每2支為1組，分別在100℃沸水浴中加熱5分鐘，10分鐘，15分鐘，20分鐘，25分鐘。37℃恒溫培養(yǎng)24小時(shí)，只有加熱25分鐘的兩支肉湯不變色。說明這種菌的耐熱性較強(qiáng)。第48頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三

四：染菌時(shí)間判斷把雜菌接入空白發(fā)酵瓶，在不同培養(yǎng)時(shí)間取樣，進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算出發(fā)酵瓶?jī)?nèi)的菌體數(shù)。該菌的繁殖方式為二分裂，根據(jù)培養(yǎng)時(shí)間和菌體數(shù)目的對(duì)應(yīng)關(guān)系，可以計(jì)算出該菌在發(fā)酵瓶?jī)?nèi)繁殖一代所需的時(shí)間（代時(shí)）。1：制備菌體稀釋液（濃度約每毫升幾百個(gè)）從平板上挑取單菌落，按梯度稀釋法制得菌體稀釋液（約520個(gè)/毫升）。第49頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三2：代時(shí)的確定吸取1毫升稀釋液接入空白發(fā)酵瓶（30毫升培養(yǎng)基），發(fā)酵瓶培養(yǎng)條件與發(fā)酵罐培養(yǎng)條件保持一致。在不同時(shí)間取樣，進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。計(jì)算出對(duì)應(yīng)的菌濃和菌體數(shù)，如下表。第50頁，共56頁，2023年，2月20日，星期三根據(jù)公式X2=X1ⅹ2（t2?t1）/T,t2-t1=3.322ⅹTⅹlg（X2/X1）和上表數(shù)據(jù)，計(jì)算得到代時(shí)（T）約為1.1小時(shí)。其中，X1為時(shí)間t1時(shí)的菌體數(shù)量，X2為時(shí)間t2時(shí)的菌體數(shù)量，T為代時(shí)（繁殖一代所需的時(shí)間）。培養(yǎng)時(shí)間(小時(shí))取樣量（毫升）菌落數(shù)（個(gè)）菌濃（個(gè)/毫升