生物藥物分析與檢驗(yàn)酶分析法

教學(xué)目的和要求

熟悉：

1．酶活力的測(cè)定方法

2．酶法分析的測(cè)定方法了解：酶分析法的原理第一頁(yè)，共78頁(yè)。概述1.酶的概念是生物體內(nèi)產(chǎn)生并具有催化活性的一類(lèi)蛋白質(zhì)，由于表現(xiàn)出特異的催化功能，因此酶被稱(chēng)為生物催化劑。2.酶的應(yīng)用：在體外進(jìn)行催化反應(yīng)①用以制造某些產(chǎn)品②用以去除某些物質(zhì)③用以識(shí)別某種化合物屬于“酶分析法”④用以測(cè)定某種物質(zhì)第二頁(yè)，共78頁(yè)。酶是由活細(xì)胞產(chǎn)生的具有催化作用的特殊物質(zhì)，又稱(chēng)生物催化劑。除極個(gè)別RNA為催化自身反應(yīng)的酶外，其余所有的酶都是蛋白質(zhì)。生物體內(nèi)一切生化反應(yīng)都需要酶的催化才能進(jìn)行！性能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)人造催化劑。產(chǎn)物（product，P）底物（substrate，S）酶的概念第三頁(yè)，共78頁(yè)。酶是特殊的催化劑

(1)生物大分子

(2)催化條件溫和

(3)強(qiáng)酸、堿或高溫下失活

(3)高選擇性

(4)高催化效率機(jī)理：降低反應(yīng)活化能，提高反應(yīng)速度，不改變平衡點(diǎn)。只起催化作用，本身不消耗。酶的特點(diǎn)概括如下：第四頁(yè)，共78頁(yè)。概述3.酶分析法包括兩種類(lèi)型：一是以酶作為分析對(duì)象，這類(lèi)分析方法稱(chēng)為“酶活力測(cè)定”。二是以酶作為分析手段，用以測(cè)定樣品中用一般化學(xué)方法難于檢測(cè)的物質(zhì)，通常將這類(lèi)分析方法稱(chēng)為“酶法分析”；第五頁(yè)，共78頁(yè)。4.兩類(lèi)酶分析法的區(qū)別相同：從原理到方法不同：酶活力測(cè)定法中，是以酶為分析對(duì)象。使用的底物應(yīng)該過(guò)量。酶法分析中，是以酶為分析工具或分析試劑,被檢化合物（如：底物）是反應(yīng)的限制因素第六頁(yè)，共78頁(yè)。酶法分析的優(yōu)點(diǎn)1用于復(fù)雜組分中結(jié)構(gòu)或物理化學(xué)性質(zhì)比較相近的同類(lèi)物質(zhì)的分離鑒定和分析。2特異性強(qiáng)、干擾少、操作簡(jiǎn)單、樣品和試劑用量少，測(cè)定快速精確，靈敏度高等特點(diǎn)。3通過(guò)了解酶對(duì)底物的特異性，可以預(yù)料可能發(fā)生的干擾反應(yīng)并設(shè)法糾正。4可用偶聯(lián)反應(yīng)。5無(wú)污染或污染很少的分析方法。第七頁(yè)，共78頁(yè)。共同點(diǎn)：原理和方法相同，以酶的專(zhuān)一高效催化某化學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過(guò)測(cè)定酶反應(yīng)的速率或生成物濃度來(lái)檢測(cè)相應(yīng)物質(zhì)的含量。第八頁(yè)，共78頁(yè)。第一節(jié)酶活力測(cè)定法

一、基本概念二、酶促反應(yīng)的條件三、酶活力的測(cè)定方法四、測(cè)定過(guò)程中應(yīng)注意的問(wèn)題第九頁(yè)，共78頁(yè)。一、基本概念1.酶活力：指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。2.酶活力的測(cè)定：是測(cè)定一個(gè)被酶所催化的化學(xué)反應(yīng)的速度。3.酶活力測(cè)定的目的：通過(guò)酶反應(yīng)速度的測(cè)定，求得酶的濃度或含量第十頁(yè)，共78頁(yè)。酶活力(enzymeactivity)的測(cè)定

酶活力是指酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力，酶活力的大小可以用在一定條件下所催化的某一化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速率來(lái)表示，酶催化的反應(yīng)速率愈大，酶的活力愈高；反應(yīng)速率愈小，酶的活力就愈低。兩者呈線性關(guān)系。所以測(cè)定酶的活力就是測(cè)定酶促反應(yīng)的速率。第十一頁(yè)，共78頁(yè)。酶催化的反應(yīng)速率可用單位時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來(lái)表示。在實(shí)際酶活測(cè)定中一般以測(cè)定產(chǎn)物的增加量為準(zhǔn)。V=[p]/t[p]=vt 第十二頁(yè)，共78頁(yè)。引起酶促反應(yīng)速率降低的原因(1)底物濃度的降低；(2)產(chǎn)物濃度增加加速了逆反應(yīng)的進(jìn)行；(3)產(chǎn)物對(duì)酶的抑制或激活作用(4)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)引起酶本身部分分子失活等。因此測(cè)定酶活力，應(yīng)測(cè)定酶促反應(yīng)的初速率，反應(yīng)初速率與酶量呈線性關(guān)系，因此可以用初速率來(lái)測(cè)定制劑中酶的含量。第十三頁(yè)，共78頁(yè)。檢驗(yàn)酶反應(yīng)和測(cè)定系統(tǒng)是否適宜的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)得的反應(yīng)速度必須和酶濃度間有線性的比例關(guān)系第十四頁(yè)，共78頁(yè)。一、基本概念4.酶反應(yīng)的速度：用單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)底物的減少或產(chǎn)物的增加來(lái)表示，酶反應(yīng)的速度愈快所表示的酶活力愈高。5.測(cè)定酶活力的方法：可用物理法、化學(xué)法或酶分析法等方法。第十五頁(yè)，共78頁(yè)。一、基本概念6.常用的酶分析法第一，終點(diǎn)法第二，取樣測(cè)定法第三，連續(xù)測(cè)定法第十六頁(yè)，共78頁(yè)。一、基本概念7.酶的活性單位（國(guó)際單位U）：在25℃及最適條件下，每分鐘能轉(zhuǎn)化一個(gè)微摩爾(μmol)底物的酶量定為一個(gè)活性單位。8.酶的比活性：為一毫克(mg)酶的活性單位數(shù)目。

第十七頁(yè)，共78頁(yè)。國(guó)際酶活力單位1961年,國(guó)際生物化學(xué)協(xié)會(huì)酶學(xué)委員會(huì)提出采用統(tǒng)一的“國(guó)際單位”(U)來(lái)表示酶活力，規(guī)定為：在最適反應(yīng)條件(溫度25℃)下，每分鐘內(nèi)催化1微摩爾(umo1)底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量,定為一個(gè)酶活力單位，即

1U=1umol／min。第十八頁(yè)，共78頁(yè)。酶的比活力(specificactivity)比活力:每mg蛋白質(zhì)所含的酶活力單位數(shù)表示，比活力=活力U／mg蛋白=總活力U/總蛋白mg有時(shí)用每g酶制劑或每m1酶制劑含有多少個(gè)活力單位來(lái)表示(U／g或U／ml)。比活力大小的含義：可用來(lái)比較每單位質(zhì)量蛋白質(zhì)的催化能力。比活力愈大，表示酶的純度愈高。第十九頁(yè)，共78頁(yè)?；盍挝?U)與比活力U＝速度單位每小時(shí)催化1克底物每小時(shí)催化1ml某濃度溶液每分鐘催化1ug底物酶產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)中常使用比活力單位質(zhì)量酶產(chǎn)品中酶活力稱(chēng)比活力。

u/mg酶蛋白

u/ml酶蛋白國(guó)際單位（IU）：在實(shí)驗(yàn)規(guī)定的條件下（25℃，最適pH、最適底物濃度時(shí)），1ul標(biāo)本，以每分鐘能催化1微摩爾底物的酶量為1個(gè)國(guó)際單位。第二十頁(yè)，共78頁(yè)。酶促反應(yīng)速度的測(cè)定方法產(chǎn)物濃度變化曲線提問(wèn)：為什么反應(yīng)速度會(huì)隨時(shí)間減?。看鸢福?.[S]降低；

2.酶受到產(chǎn)物抑制提問(wèn)：用哪一個(gè)速度來(lái)表示該酶促反應(yīng)的速度特征呢？反應(yīng)初速度Vo反應(yīng)初速度表示酶活力。提問(wèn)：僅用反應(yīng)初速度大小對(duì)比酶活力行嗎？答案：不行，還與酶的加入量及條件有關(guān)。第二十一頁(yè)，共78頁(yè)。酶活力測(cè)定實(shí)例首先確定反應(yīng)條件

20℃、pH=7，底物濃度6g/l（過(guò)量），加入2mg固體脂肪酶第二確定活力單位

如每小時(shí)催化1克底物

1u=1g/h第三測(cè)算反應(yīng)初速度

作產(chǎn)物甘油隨時(shí)間增加的曲線，量出反應(yīng)初速度值，換算為脂肪的消耗速度如

8g/h第四換算活力

8g/h

/

1g/h=8u第五計(jì)算比活

8u/2mg酶蛋白=4u/mg酶蛋白脂肪脂肪酶甘油+脂肪酸第二十二頁(yè)，共78頁(yè)。二、酶促反應(yīng)的條件基本要求：反應(yīng)系統(tǒng)中除了待測(cè)酶的濃度是影響速度的惟一因素外，其他因素都處于最適于酶發(fā)揮催化作用的水平。

第二十三頁(yè)，共78頁(yè)。確定反應(yīng)條件時(shí)應(yīng)考慮：

（1）底物

選用的底物在物理化學(xué)性質(zhì)上和產(chǎn)物不同。一般選用底物的濃度[S]=100Km

一般選擇Km小的作測(cè)定的底物。

第二十四頁(yè)，共78頁(yè)。（2）pH值注意選擇適宜的反應(yīng)pH值，并將反應(yīng)維持在這一pH值。例：丙酮酸乳酸乳酸脫氫酶第二十五頁(yè)，共78頁(yè)。pH對(duì)酶反應(yīng)的影響第二十六頁(yè)，共78頁(yè)。

pH影響酶活力的原因

(1)過(guò)酸或過(guò)堿可以使酶的空間結(jié)構(gòu)破壞，引起酶構(gòu)象的改變，酶活性喪失。(2)當(dāng)pH改變不很劇烈時(shí)，酶雖未變性，但活力受到影響。影響了底物的解離狀態(tài)；影響酶分子活性部位上有關(guān)基團(tuán)的解離；影響到中間絡(luò)合物ES的解離狀態(tài)，不利于催化生成產(chǎn)物。第二十七頁(yè)，共78頁(yè)。二、酶促反應(yīng)的條件

（3）溫度

實(shí)驗(yàn)中溫度變動(dòng)應(yīng)控制在±0.1℃以?xún)?nèi)。酶反應(yīng)的溫度通常選用25℃、30℃、37℃。

（4）輔助因子為了提高酶在反應(yīng)系統(tǒng)中的穩(wěn)定性，有些也需要某些相應(yīng)的物質(zhì)。

第二十八頁(yè)，共78頁(yè)。最適溫度

機(jī)理：溫度導(dǎo)致酶蛋白變性溫度對(duì)酶反應(yīng)的影響第二十九頁(yè)，共78頁(yè)。溫度對(duì)酶反應(yīng)的影響在最適溫度之前，一般溫度越高，反應(yīng)速度就越快。酶的固體狀態(tài)比在溶液中對(duì)溫度的耐受力要高。通常酶制劑以固體保存為佳。第三十頁(yè)，共78頁(yè)。（5）空白和對(duì)照

空白

指雜質(zhì)反應(yīng)和自發(fā)反應(yīng)引起的變化量，提供未知因素的影響

對(duì)照作為比較或標(biāo)定的標(biāo)準(zhǔn)。第三十一頁(yè)，共78頁(yè)。三、酶活力的測(cè)定方法按取樣及檢測(cè)的方式（一）取樣測(cè)定法（二）連續(xù)測(cè)定法第三十二頁(yè)，共78頁(yè)。（一）取樣測(cè)定法1.取樣測(cè)定法：求得單位時(shí)間內(nèi)酶促反應(yīng)變化量的方法。

2.常用的檢測(cè)方法：紫外-可見(jiàn)分光光度法、熒光分析法等。第三十三頁(yè)，共78頁(yè)。取樣測(cè)定法

在酶反應(yīng)開(kāi)始后不同的時(shí)間，從反應(yīng)系統(tǒng)中取出一定量的反應(yīng)液，并用適當(dāng)?shù)姆椒ǎㄌ砑用傅淖冃詣┗蚴姑甘Щ睿┩Ｖ蛊浞磻?yīng)后，再根據(jù)產(chǎn)物和底物在化學(xué)性質(zhì)上的差別，選用適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法進(jìn)行定量分析，求得單位時(shí)間內(nèi)酶促反應(yīng)變化量的方法。第三十四頁(yè)，共78頁(yè)。取樣測(cè)定法取樣測(cè)定法一直沿襲至今是因?yàn)椋翰恍枰厥鈨x器幾乎所有酶反應(yīng)都可根據(jù)產(chǎn)物或底物的化學(xué)性質(zhì)找出具體的測(cè)定方法由于色源底物和熒光源底物的發(fā)展，可在原來(lái)的底物分子上接上相應(yīng)的有色基團(tuán)、發(fā)色基團(tuán)或熒光基團(tuán)。第三十五頁(yè)，共78頁(yè)。3、終止酶反應(yīng)：添加酶的變性劑三氯醋酸：紫外光區(qū)有吸收高氯酸：對(duì)酸和氧化劑敏感的對(duì)象不適用第三十六頁(yè)，共78頁(yè)。4、特點(diǎn)：不需要特殊儀器容易找到具體測(cè)定方法色源底物和熒光源底物發(fā)展快第三十七頁(yè)，共78頁(yè)。

（二）連續(xù)測(cè)定法1.連續(xù)測(cè)定法：基于底物和產(chǎn)物在物理化學(xué)性質(zhì)上的不同，在反應(yīng)過(guò)程中對(duì)反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行直接連續(xù)檢測(cè)的方法。2.常用的檢測(cè)方法第三十八頁(yè)，共78頁(yè)。連續(xù)測(cè)定法基于底物和產(chǎn)物在物理化學(xué)性質(zhì)上的不同，在反應(yīng)過(guò)程中對(duì)反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)的方法。連續(xù)測(cè)定法的準(zhǔn)確性和測(cè)定效率比較好第三十九頁(yè)，共78頁(yè)。酶活不能反映酶的使用效果只能用于產(chǎn)品質(zhì)量的控制第四十頁(yè)，共78頁(yè)。測(cè)定過(guò)程中應(yīng)注意的問(wèn)題產(chǎn)物的測(cè)定反應(yīng)速度的測(cè)定測(cè)定要達(dá)到的要求第四十一頁(yè)，共78頁(yè)。酶反應(yīng)進(jìn)程曲線012345605101520t/minc/mg/mL5040302010酶量生化藥物制劑檢驗(yàn)程序第四十二頁(yè)，共78頁(yè)。生化藥物制劑檢驗(yàn)程序酶濃度曲線的關(guān)系00.10.20.30.40.50.60102030405060酶量反應(yīng)速率t=15t=10t=5t/min第四十三頁(yè)，共78頁(yè)。酶分析法的檢測(cè)方法第四十四頁(yè)，共78頁(yè)。最常用的方法介紹如下：(1)紫外-可見(jiàn)分光光度法(2)熒光分析法(3)旋光度法(4)酶偶聯(lián)測(cè)定法(5)其他檢測(cè)法酶分析法的檢測(cè)方法第四十五頁(yè)，共78頁(yè)。一、紫外-可見(jiàn)分光光度法

NAD+(煙酰胺-腺嘌呤二核苷酸，又稱(chēng)為輔酶I)和NADP+(煙酰胺-腺嘌呤磷酸二核苷酸,又稱(chēng)為輔酶II)是維生素?zé)燉０返难苌?，第四十六?yè)，共78頁(yè)。還原氧化NAD+NADH在338.5nm與340.5nm之間有一個(gè)最大吸收峰300-400nm無(wú)吸收第四十七頁(yè)，共78頁(yè)。丙酮酸+NADH+H+LDH乳酸+NAD+例1、例

2、天冬氨酸+a-草酰酮戊二酸谷氨酸+草酰乙酸GOT草酰乙酸+NADH+H蘋(píng)果酸+NAD+MDH第四十八頁(yè)，共78頁(yè)。酶偶聯(lián)測(cè)定法：是應(yīng)用過(guò)量、高度專(zhuān)一的“偶聯(lián)工具酶”使被測(cè)酶反應(yīng)能連續(xù)進(jìn)行到某一可直接、連續(xù)、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確測(cè)定階段的方法。被測(cè)反應(yīng)偶聯(lián)指示反應(yīng)①第四十九頁(yè)，共78頁(yè)。被測(cè)反應(yīng)肌激酶輔助反應(yīng)丙酮酸激酶指示反應(yīng)乳酸脫氫酶②第五十頁(yè)，共78頁(yè)。二、熒光分析法三華勃氏呼吸儀檢壓法四、放射性同位素測(cè)定法第五十一頁(yè)，共78頁(yè)。華勃氏微量呼吸儀（瓦氏呼吸儀）

第五十二頁(yè)，共78頁(yè)。五電化學(xué)法（electrochemical）pH測(cè)定法：用高靈敏度的pH計(jì)，跟蹤反應(yīng)過(guò)程中H+變化的情況，用pH的變化來(lái)測(cè)定酶的反應(yīng)速率。離子選擇電極法：測(cè)定某些酶的酶活力，用氧電極可以測(cè)定一些耗氧的酶反應(yīng)，如葡糖氧化酶的活力就可用這個(gè)方法很方便地測(cè)定。第五十三頁(yè)，共78頁(yè)。第二節(jié)酶法分析

一、終點(diǎn)測(cè)定法二、反應(yīng)速度法第五十四頁(yè)，共78頁(yè)。一、原理是在以待測(cè)物質(zhì)為底物的酶反應(yīng)中，如果能使底物能夠接近完全地轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，而且底物或產(chǎn)物又具有某種特征性質(zhì)，通過(guò)直接測(cè)定轉(zhuǎn)化前后底物的減少量，產(chǎn)物的增加量或輔酶的變化就可以定量待測(cè)物——平衡法

第五十五頁(yè)，共78頁(yè)。

用于復(fù)雜組分中結(jié)構(gòu)或物理化學(xué)性質(zhì)比較相近的同類(lèi)物質(zhì)的分離鑒定和分析。特異性強(qiáng)、干擾少、操作簡(jiǎn)單、樣品和試劑用量少，測(cè)定快速精確，靈敏度高等特點(diǎn)。通過(guò)了解酶對(duì)底物的特異性，可以預(yù)料可能發(fā)生的干擾反應(yīng)并設(shè)法糾正?？捎门悸?lián)反應(yīng)。無(wú)污染或污染很少的分析方法。優(yōu)點(diǎn)：第五十六頁(yè)，共78頁(yè)。一、終點(diǎn)測(cè)定法1.原理：先借助酶反應(yīng)（單獨(dú)的反應(yīng)或幾種酶構(gòu)成的偶數(shù)酶反應(yīng)）使被測(cè)物質(zhì)定量地進(jìn)行轉(zhuǎn)變，然后在轉(zhuǎn)化完成后，測(cè)定底物、產(chǎn)物或輔酶物質(zhì)（第二底物）等的變化量。2.一般采用的測(cè)定方法：①光吸收、熒光之類(lèi)的分光光度法②測(cè)定氣體產(chǎn)生與吸收的測(cè)壓量氣法（華勃氏呼吸儀檢壓法）③檢知pH值變化的滴定法④同位素跟蹤測(cè)定法第五十七頁(yè)，共78頁(yè)。（一）終點(diǎn)法條件

1．酶的底物特異性（專(zhuān)一性）：具有高度的底物專(zhuān)一性，有一些酶是呈族特異性；

2．反應(yīng)的平衡：酶反應(yīng)若平衡十分偏向進(jìn)行方向，則可方便地用終點(diǎn)測(cè)定法檢測(cè)；但若反應(yīng)的平衡并不十分偏向進(jìn)行方向，或者偏向逆方向，此時(shí)由于反應(yīng)不能完全，因而反應(yīng)就不能正確定量，解決這一問(wèn)題，通常可采取一些措施。第五十八頁(yè)，共78頁(yè)。反應(yīng)的平衡谷氨酸+NAD++H2Oa-酮戊二酸+NADH+NH+谷氨酸脫氫酶NADH+丙酮酸乳酸+NAD+乳酸脫氫酶第五十九頁(yè)，共78頁(yè)。3．反應(yīng)液中的酶量：要使酶反應(yīng)在短時(shí)間內(nèi)完成，只有使用對(duì)底物親和性很大的酶（即Km要小），酶用量（即Vmax）必須大才能達(dá)到此點(diǎn)。工作中，在10min內(nèi)反應(yīng)完成99%，則常數(shù)K以1.0min-1為宜。

4．反應(yīng)產(chǎn)物抑制：如果產(chǎn)物對(duì)反應(yīng)本身有抑制作用，則會(huì)妨礙反應(yīng)進(jìn)行，在這種情況下可將該產(chǎn)物除去或者和再生系統(tǒng)偶聯(lián)等辦法解決。第六十頁(yè)，共78頁(yè)。反應(yīng)產(chǎn)物抑制S+ATPP+ADP丙酮酸丙酮酸激酶磷酸烯醇式丙酮酸S激酶第六十一頁(yè)，共78頁(yè)。（二）終點(diǎn)法種類(lèi)1．單酶反應(yīng)定量法：（1）底物減少量的測(cè)定：在以待測(cè)物質(zhì)為底物的酶反應(yīng)中，如果底物能接近完全地轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，且又具有某種特征性質(zhì)（例如特征的吸收譜帶）時(shí)，則就可能簡(jiǎn)便地通過(guò)直接測(cè)定底物的減少量，而定量待測(cè)物。第六十二頁(yè)，共78頁(yè)。（二）終點(diǎn)法種類(lèi)（2）產(chǎn)物增加量的測(cè)定：在以被測(cè)物為底物的酶的反應(yīng)中，如果底物基本上都能轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物，而產(chǎn)物又具有可以專(zhuān)一地進(jìn)行定量測(cè)定的性質(zhì)，那么根據(jù)產(chǎn)物增加就能檢知底物的量。（3）輔酶變化量的測(cè)定：以NAD或NADP為輔酶的脫氫酶反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定340nm吸收度的變化，就能對(duì)作為相應(yīng)脫氫酶底物的物質(zhì)進(jìn)行定量分析。第六十三頁(yè)，共78頁(yè)。1.羥基丙酮酸的定量測(cè)定羥基丙酮酸+NADH+HD—甘油酸+NAD+L-谷氨酸+NAD++H2O甘油酸脫氫酶2.L-谷氨酸的定量測(cè)定a-酮戊二酸+NADH+NH4+谷氨酸脫氫酶第六十四頁(yè)，共78頁(yè)。2．和指示酶反應(yīng)偶聯(lián)的定量法（1）以脫氫酶為指示劑：用來(lái)作為偶聯(lián)指示劑的酶中應(yīng)用得最廣泛的是以NAD或NADP為輔酶的脫氫酶類(lèi)（2）以脫氫酶以外的酶作指示劑：參與某些色素氧化還原的酶中有的可用作指示劑，反應(yīng)的進(jìn)行可由吸收度的變化來(lái)測(cè)定。第六十五頁(yè)，共78頁(yè)。2、和指示酶反應(yīng)偶聯(lián)的定量法①以脫氫酶為指示劑1-磷酸-葡萄糖6-磷酸-葡萄糖磷酸葡萄糖變位酶1，6-二磷酸葡萄糖6-磷酸-葡萄糖+NADP6-磷酸-葡萄糖醛酸+NADPH+H+6-磷酸-葡萄糖脫氫酶第六十六頁(yè)，共78頁(yè)。D-2-磷酸甘油酸磷酸烯醇丙酮酸烯醇化酶磷酸烯醇丙酮酸+ADP丙酮酸激酶丙酮酸+ATP丙酮酸+NADH+H+乳酸脫氫酶乳酸+NAD+第六十七頁(yè)，共78頁(yè)。②以脫氫酶以外的酶為指示劑D-葡萄糖的定量測(cè)定葡萄糖葡萄糖醛酸+H2O2H2O2+4-氨基安替比林酚醌亞膠色素+4H2O葡萄糖氧化酶過(guò)氧化物酶第六十八頁(yè)，共78頁(yè)。二、反應(yīng)速度法反應(yīng)速度法是在一定條件下（一定pH值和溫度），測(cè)定反應(yīng)的初速度，而反應(yīng)的初速度與被測(cè)物質(zhì)的濃度成正比關(guān)系，因此可根據(jù)初速度計(jì)算被測(cè)物質(zhì)的量，也可利用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照法計(jì)算被測(cè)物質(zhì)的量。第