固定化酶固定化細(xì)胞

固定化酶固定化細(xì)胞第1頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞酶催化劑的優(yōu)點(diǎn)：專(zhuān)一性強(qiáng)，反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)速度較快。弱點(diǎn)：溶液酶在反應(yīng)后，分離困難，重復(fù)利用困難；溶液酶穩(wěn)定性差，易失活。1969出現(xiàn)了固定化酶技術(shù)。固定化酶就是把原來(lái)游離的水溶性酶，固定于某一局部的空間或者固定于載體上。概述第2頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞發(fā)展歷史1953年，德國(guó)，Grubhofer、Schleith，聚氨基苯乙烯樹(shù)脂為載體，重氮法；1969年，日本，千畑一郎，固定化氨基?；?，從DL-氨基酸連續(xù)生產(chǎn)L-氨基酸，首次工業(yè)規(guī)模應(yīng)用固定化酶，促使酶工程作為一個(gè)獨(dú)立的學(xué)科從發(fā)酵工程中脫離出來(lái)；1971年，第一次國(guó)際酶工程會(huì)議確定固定化酶統(tǒng)一英文名稱(chēng)為ImmobilizedEnzyme。第3頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞1973年，日本首次在工業(yè)上成功應(yīng)用固定化大腸桿菌菌體中天門(mén)冬氨酸酶，由反丁烯二酸連續(xù)生產(chǎn)L-天門(mén)冬氨酸。1976年，法國(guó)首次用固定化酵母細(xì)胞生產(chǎn)啤酒和酒精；1978年，日本用固定化枯草桿菌細(xì)胞生產(chǎn)淀粉酶，開(kāi)始了固定化細(xì)胞產(chǎn)酶的先例。1979年，固定化毛地黃細(xì)胞和長(zhǎng)春花細(xì)胞成功；1982年，日本首次研究用固定化原生質(zhì)體生產(chǎn)谷氨酸。第4頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞固定化酶：酶的固定化：將酶和菌體與不溶性載體結(jié)合的過(guò)程；固定化酶：在一定空間內(nèi)呈閉鎖狀態(tài)存在的酶，能連續(xù)進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后的酶可回收重復(fù)使用；概念發(fā)展“水不溶酶”（waterinsolubleenzyme)“固相酶”（solidphaseenzyme)1971年第一屆國(guó)際酶工程會(huì)議正式采用“固定化酶（immobilizedenzyme)”第5頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞固定化酶的特點(diǎn)具有生物催化劑的功能，又有固相催化劑的功能。①可多次使用；②反應(yīng)后，酶底物產(chǎn)物易分開(kāi)，產(chǎn)物中無(wú)殘留酶，易純化，產(chǎn)品質(zhì)量高；③反應(yīng)條件易控制；④酶的利用效率高；⑤比水溶性酶更適合于多酶反應(yīng)；第6頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞水溶性酶水不溶性載體水不溶性酶（固定化酶）固定化技術(shù)第7頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞固定化酶生物反應(yīng)器實(shí)際應(yīng)用中，固定化酶可以裝在反應(yīng)器中，連續(xù)生產(chǎn)有利于生產(chǎn)的自動(dòng)化，提高生產(chǎn)率。鑒于此，70年代以來(lái)，該技術(shù)受到各國(guó)學(xué)者的矚目，紛紛開(kāi)展固定化酶的研究。第8頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞第一節(jié)酶、細(xì)胞的固定化方法及固定化后的性質(zhì)一、固定化的原則和方法酶催化作用依靠它的高級(jí)結(jié)構(gòu)及活性中心。固定化時(shí)，活性中心的必需基團(tuán)應(yīng)避免參加反應(yīng)；避免高溫、強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑以及高濃度鹽的處理，保護(hù)靠氫鍵、離子鍵、疏水鍵等弱鍵維系的酶蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)。盡可能在溫和條件下進(jìn)行固定化反應(yīng)。第9頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞固定化方法：載體結(jié)合法；交聯(lián)法；包埋法；其他方法；載體結(jié)合法：將酶（細(xì)胞）固定在不溶性載體上?？抗矁r(jià)結(jié)合、離子結(jié)合、和物理吸附。常用的載體：纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等多糖衍生物顆?；蚨嗫撞ＡУ?。交聯(lián)法：使酶與具有兩個(gè)以上官能團(tuán)的試劑（如：戊二醛）進(jìn)行反應(yīng)，應(yīng)用化學(xué)鍵把酶固定。第10頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞包埋法：將酶包在凝膠微小格子內(nèi)，或是將酶包裹在半透性聚合物膜內(nèi)的固定化方法。常用的凝膠為聚丙烯酰胺、海藻酸鈣、膠原、卡拉膠等。包埋法簡(jiǎn)單，可適用于大多數(shù)酶。第11頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞第12頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞第13頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞固定化方法與載體的選擇依據(jù)⑴固定化酶應(yīng)用的安全性；⑵固定化酶在操作中的穩(wěn)定性；⑶固定化的成本；固定化酶的形狀⑴顆粒狀固定化酶；⑵纖維狀固定化酶；⑶膜狀固定化酶；⑷管狀固定化酶；第14頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞二、固定化酶、細(xì)胞的性質(zhì)1、固定化后的活性酶經(jīng)固定化后，活力降低。原因是：a.

酶和載體結(jié)合時(shí)，活性中心的氨基酸也或多或少地參與了結(jié)合，使得酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生部分變化，酶活力有一部分喪失。b.

由于載體的存在，有空間位阻，影響底物和酶接觸，酶的活性得不到全部表達(dá)。細(xì)胞固定化后，一般酶活力不下降。細(xì)胞內(nèi)酶受細(xì)胞膜、壁的保護(hù)。第15頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞固定化酶結(jié)構(gòu)的改變第16頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞2、穩(wěn)定性酶或細(xì)胞被固定化后，由于載體的存在，酶分子的結(jié)構(gòu)或細(xì)胞被約束，對(duì)外部惡劣環(huán)境的敏感性下降，使其穩(wěn)定性增加（對(duì)熱、對(duì)各種化學(xué)試劑等）。而且有時(shí)穩(wěn)定性增加的幅度比較大。第17頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞3、催化特征a.底物專(zhuān)一性：當(dāng)?shù)孜餅榇蠓肿訒r(shí)，酶或細(xì)胞對(duì)底物專(zhuān)一性下降；當(dāng)?shù)孜餅樾》肿訒r(shí)，酶或細(xì)胞對(duì)底物專(zhuān)一性變化不大。b.最適pH：依固定化載體與酶分子、細(xì)胞上所分布電荷的相互作用不同而異。有的變化，有的不變化，有的向pH小的方向移動(dòng)，有的向pH大的方向移動(dòng)。第18頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞c.反應(yīng)的最適溫度固定化酶、細(xì)胞的最適溫度往往升高，升高的幅度不同，2~15℃不等。d.動(dòng)力學(xué)常數(shù)固定化酶的表觀Km(app)與游離酶的Km相比有些不變，有的變化很大。第19頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞原因可能是：載體間的靜電作用，以及擴(kuò)散效應(yīng)。如果固定化酶區(qū)域的底物濃度比外部液相主體溶液高，Km(app)下降。相反，用包埋法的固定化酶的Km(app)值，可較游離酶多兩個(gè)數(shù)量級(jí)。這是由于凝膠中的擴(kuò)散效應(yīng)使底物濃度減少，導(dǎo)致內(nèi)部底物濃度低于外部區(qū)域的濃度，Km(app)上升。對(duì)于固定化細(xì)胞，情況類(lèi)似。Vmax

一般不變化。第20頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞第二節(jié)固定化酶、固定化細(xì)胞的應(yīng)用在上世紀(jì)70年代初，出現(xiàn)固定單一的酶，催化單一反應(yīng)；隨后同時(shí)固定兩種酶或兩種以上的酶，以及固定化酶和輔酶，催化復(fù)雜一些的反應(yīng)；再后來(lái)發(fā)展起來(lái)的固定化細(xì)胞技術(shù)，使得不易提取的不穩(wěn)定的酶的利用有了方便條件，還可以利用活細(xì)胞的完整代謝體系來(lái)完成復(fù)雜的反應(yīng)，如乙醇的生產(chǎn)。第21頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞在固定化酶、固定化細(xì)胞的研究中發(fā)展起來(lái)的親和層析技術(shù)，已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了利用酶和微生物進(jìn)行催化反應(yīng)的范疇。例如抗體抗原的提純是利用了特異的免疫吸附反應(yīng)。固定化酶和細(xì)胞技術(shù)的顯著特點(diǎn)：p801.連續(xù)反應(yīng)；2.獲得的產(chǎn)物純度高；3.固定化酶或細(xì)胞可重復(fù)使用，減少了浪費(fèi)；4.易實(shí)現(xiàn)自控…第22頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞應(yīng)用實(shí)例：DL-氨基酸的光學(xué)拆分。人體只能利用L-氨基酸，所以L-氨基酸在食品醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用非常廣泛，并且需要量不斷增加。化學(xué)合成法是生產(chǎn)氨基酸的方法之一，該法成本低，但生產(chǎn)出來(lái)的氨基酸是DL外消旋體。要想把L-氨基酸分離出來(lái)，需要進(jìn)行光學(xué)拆分。外消旋體：對(duì)映體的右旋體和左旋體等量混合后，它們的旋光性相互抵消，不再有旋光性。這樣的混合物稱(chēng)為外消旋體，以D、L表示。外消旋體可以用適當(dāng)方法拆開(kāi)或分開(kāi)。第23頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞外消旋化：在一般情況下，和不對(duì)稱(chēng)碳原子相連的四個(gè)原子或原子團(tuán)，不能隨意調(diào)換位置，因此對(duì)映體不能相互轉(zhuǎn)換，旋光度維持不變。但在熱、光、或者化學(xué)試劑的影響下，不對(duì)稱(chēng)碳原子上的原子或原子團(tuán)可發(fā)生調(diào)換現(xiàn)象，使旋光物質(zhì)轉(zhuǎn)化為它的對(duì)映體，最后得到外消旋體，原來(lái)100%的左旋體，經(jīng)變化后，變成50%左旋體和50%的右旋體，這種現(xiàn)象稱(chēng)為外消旋化。第24頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞DL-氨基酸光學(xué)拆分中，以酶法最佳，它是利用酰化氨基酸水解酶，制備純度高的L-aa，且收率高。

氨基?；疎DL-R-CHCOOH+H2OL-R-CHCOOH+D-R-CHCOOH

不對(duì)稱(chēng)水解

NH2

NH2

NHCOR′

溶解度小?；?DL-aaL-aa

?；疍-aa

外消旋化外消旋體第25頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞泵儲(chǔ)罐反應(yīng)產(chǎn)物離心機(jī)消旋反應(yīng)器固定化酶柱子晶體L-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-Ala固定化酶光學(xué)拆分DL-氨基酸生產(chǎn)流程第26頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞1969年，日本，千鈿一郎成功地利用固定化?；被崴饷?，由?；?DL-氨基酸連續(xù)生產(chǎn)L-aa獲得成功。這是世界上固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用的第一個(gè)實(shí)例。各種光學(xué)活性氨基酸都用這種方法生產(chǎn)。該項(xiàng)技術(shù)成功的關(guān)鍵是制造出適合于工業(yè)化要求的固定化酶。第27頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞果葡糖漿的生產(chǎn)第28頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞葡萄糖不能直接代替蔗糖，因甜度不夠，但葡萄糖和果糖是同分異構(gòu)體，葡萄糖可以異構(gòu)為果糖。高果糖漿的甜味是蔗糖的2倍。這一應(yīng)用是目前世界上使用固定化酶規(guī)模最大的生產(chǎn)上的實(shí)例。(高果糖漿)第29頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞L-蘋(píng)果酸的生產(chǎn)：p85第30頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞消血栓：纖溶酶是異源蛋白質(zhì)，在人體內(nèi)引起免疫反應(yīng)，無(wú)法長(zhǎng)期使用。酶的不穩(wěn)定性使其在較短的時(shí)間內(nèi)失活。用包埋法制備的酶固定化技術(shù)可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物質(zhì)能自由進(jìn)出。第31頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞人工腎：原理：將病人血液中的尿素經(jīng)脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶和微膠囊活性炭組成人工腎。第32頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞酶?jìng)鞲衅鞴潭ɑ负碗娀瘜W(xué)傳感器的結(jié)合。優(yōu)點(diǎn)：①既有不溶性酶體系的優(yōu)點(diǎn)，又具有電化學(xué)電極的高靈敏度；②酶的專(zhuān)一反應(yīng)性，使其具有較高的選擇性，能夠直接在復(fù)雜試樣中進(jìn)行測(cè)定。1967年Updike等采用酶的固定化技術(shù)，將葡萄糖氧化酶固定在疏水膜上，然后再和氧電極結(jié)合，組裝成了世界上第一個(gè)生物傳感器葡萄糖氧化酶電極。第33頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞酶電極示意圖?-D-葡萄糖＋O2→D-葡萄糖酸-1,5-內(nèi)酯＋H2O2半透膜酶膠層感應(yīng)電極根據(jù)反應(yīng)中消耗的O2、生成的葡萄糖酸和H2O2的量，可以用氧電極、pH電極和H2O2電極來(lái)測(cè)定葡萄糖的含量。第34頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞生物識(shí)別元件是酶、抗原(體)、細(xì)胞器、組織切片和微生物細(xì)胞等生物分子經(jīng)固定化后形成的一種膜結(jié)構(gòu)，對(duì)被測(cè)定的物質(zhì)有選擇性的分子識(shí)別能力。生物傳感器(酶?jìng)鞲衅?原理由生物識(shí)別單元（如酶、微生物、抗體等）和物理轉(zhuǎn)換器相結(jié)合所構(gòu)成的分析儀器。換能器將識(shí)別元件上進(jìn)行的生化反應(yīng)中消耗或生成的化學(xué)物質(zhì)，或產(chǎn)生的光或熱等轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，并呈現(xiàn)一定的比例關(guān)系。第35頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞第36頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞酶?jìng)鞲衅鞴ぷ髟硎疽鈭D酶?jìng)鞲衅髦饕晒潭ɑ改ず妥儞Q器組成：固定化酶膜：選擇性地“識(shí)別”并催化被檢測(cè)物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；變換器：把催化反應(yīng)中底物或產(chǎn)物的變量轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，通過(guò)儀表顯示出來(lái)。

第37頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞固定化技術(shù)的限制：5個(gè)方面見(jiàn)p88

第38頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞第三節(jié)固定化酶、細(xì)胞反應(yīng)動(dòng)力學(xué)影響固定化酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的因素可歸納下列幾個(gè)方面：酶活性與酶分子的三維空間結(jié)構(gòu)有關(guān)。酶分子被固定時(shí)，其構(gòu)象將發(fā)生改變，酶活性部位的三維結(jié)構(gòu)可能改變，從而改變酶的活性。1、酶分子構(gòu)相的改變和載體屏障效應(yīng)第39頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞1.酶分子構(gòu)相的改變和載體屏障效應(yīng)載體的存在引起屏蔽效應(yīng)，使酶分子的活性基團(tuán)不易與底物或效應(yīng)物接觸，從而影響固定化酶的活性。第40頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞2.微環(huán)境效應(yīng)—分配效應(yīng)固定化酶處于主體溶液中，形成非均相反應(yīng)系統(tǒng)。在固定化酶附近的環(huán)境稱(chēng)為微環(huán)境，而主體溶液則稱(chēng)為大環(huán)境。由于載體和底物的疏水性、親水性以及靜電作用，使微環(huán)境與大環(huán)境有不同的性質(zhì)，從而形成底物和各種效應(yīng)物的不均勻分布，這種效應(yīng)稱(chēng)為分配效應(yīng)。第41頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞3.擴(kuò)散阻力用固定化酶進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，底物必須從主體溶液傳遞到固定化酶內(nèi)部的催化部位。反應(yīng)后，產(chǎn)物又沿著相反路線從酶的催化部位傳遞到主體溶液。這些傳遞過(guò)程包括被動(dòng)分子擴(kuò)散和對(duì)流擴(kuò)散，傳遞過(guò)程中存在著一個(gè)擴(kuò)散速率限制因素。這種擴(kuò)散限制效應(yīng)在擴(kuò)散效率很低時(shí)，而酶的催化活力又相當(dāng)高時(shí)特別顯著。第42頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞固定化酶、細(xì)胞催化系統(tǒng)是一種非均相反應(yīng)系統(tǒng)，包括：底物從反應(yīng)液移向載體表面（外擴(kuò)散）底物從載體表面移向酶活性中心（內(nèi)擴(kuò)散）酶反應(yīng)產(chǎn)物由反應(yīng)位點(diǎn)移向載體表面（內(nèi)擴(kuò)散）產(chǎn)物移到反應(yīng)液中（外擴(kuò)散）總的反應(yīng)速度取決于最慢的步驟限速步驟有可能是外擴(kuò)散、內(nèi)擴(kuò)散或酶反應(yīng)。存在的擴(kuò)散效應(yīng)會(huì)使固定化酶、固定化細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)行為偏離其液態(tài)下的動(dòng)力學(xué)行為。第43頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞4.外擴(kuò)散及對(duì)酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響外擴(kuò)散發(fā)生在固定化酶周?chē)奶幱谕顟B(tài)的液膜層。由于存在外擴(kuò)散阻力，底物將在固定化酶周?chē)纬蓾舛忍荻取鲗拥暮穸仍谝欢ㄏ薅葍?nèi)，它受固定化酶界面周?chē)芤旱南鄬?duì)速度的影響。外擴(kuò)散限制隨反應(yīng)體系攪拌速度的增加而減少。第44頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞存在外擴(kuò)散限制的固定化酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程為：Vm=K·E，E為固定化酶濃度Km(app)：表觀米氏常數(shù)，=Km+α/KLKL=De/y(見(jiàn)p94)在操作上使流體的湍動(dòng)程度大，能改變或消除外擴(kuò)散的影響。第45頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞5.內(nèi)擴(kuò)散及對(duì)酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響內(nèi)擴(kuò)散阻力發(fā)生在多孔性固定化酶載體的內(nèi)部，它是底物傳遞到固定化酶內(nèi)部時(shí)的一種擴(kuò)散限制效應(yīng)。在微環(huán)境內(nèi)底物的消耗和產(chǎn)物的積累程度，和這些物質(zhì)的分子量大小有關(guān)。大分子物質(zhì)在多孔介質(zhì)中擴(kuò)散時(shí)，其擴(kuò)散系數(shù)較小，以致在微環(huán)境中形成嚴(yán)重的底物枯竭和產(chǎn)物的大量積累，這會(huì)嚴(yán)重影響酶促反應(yīng)速度。第46頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散限制對(duì)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響，比外擴(kuò)散更為突出，因?yàn)橥鈹U(kuò)散限制可以通過(guò)攪拌來(lái)基本消除，而內(nèi)擴(kuò)散限制無(wú)法消除。在固定化酶、固定化細(xì)胞的內(nèi)部，不存在流體流動(dòng)，其傳質(zhì)完全依賴于分子被動(dòng)擴(kuò)散作用。定義η為有效系數(shù)：第47頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞固定化酶、細(xì)胞的反應(yīng)速度：Sa

：載體表面底物濃度η是與內(nèi)擴(kuò)散系數(shù)Φ有關(guān)的因子R為固定化顆粒半徑第48頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞6.擴(kuò)散的判定判斷出固定化酶、固定化細(xì)胞在反應(yīng)過(guò)程中究竟屬于哪種擴(kuò)散效應(yīng)，對(duì)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的解析和應(yīng)用非常重要。最簡(jiǎn)單的判斷方法是Arrhenius圖解法，見(jiàn)p96。第49頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞第四節(jié)固定化酶、細(xì)胞反應(yīng)器1.影響酶反應(yīng)速度的因素，通常有下列三方面：（1）濃度因素酶濃度、底物濃度、產(chǎn)物濃度濃度因素是所有影響因素中最基本的因素；是均相酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的主要內(nèi)容。第50頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞（2）外部反應(yīng)環(huán)境因素反應(yīng)環(huán)境的溫度、壓力、pH以及溶劑的介電常數(shù)、離子強(qiáng)度等。（3）內(nèi)部結(jié)構(gòu)因素底物和酶的結(jié)構(gòu)。第51頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞2.酶反應(yīng)器的設(shè)計(jì)原理及操作參數(shù)為了設(shè)計(jì)酶反應(yīng)器以及確定反應(yīng)操作條件，首先必須了解：反應(yīng)速度特性以及溫度、pH等因素的影響，建立反應(yīng)速率方程式；反應(yīng)器的形式和反應(yīng)器內(nèi)流體流動(dòng)狀態(tài)以及傳熱特點(diǎn)；產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量。物料平衡、熱量平衡、反應(yīng)速率和流動(dòng)特性等各關(guān)系式都可同時(shí)應(yīng)用于反應(yīng)器設(shè)計(jì)。參與反應(yīng)的各組分均服從于質(zhì)量守恒定律，這是設(shè)計(jì)的出發(fā)點(diǎn)。第52頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞表示反應(yīng)器性能的重要操作參數(shù)：空間時(shí)間、轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)率；當(dāng)有副反應(yīng)發(fā)生時(shí)，選擇率也是重要的參數(shù)。①空間時(shí)間τ（簡(jiǎn)稱(chēng)空時(shí)，spacetime）表示反應(yīng)物在連續(xù)操作反應(yīng)器內(nèi)停留的時(shí)間?？諘r(shí)的倒數(shù)稱(chēng)為空速(spacevelocity)。第53頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞PFR:CSTR:VR：反應(yīng)器容積(L)；Q：加入反應(yīng)器的底物溶液體積流量。第54頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞②轉(zhuǎn)化率x，又稱(chēng)為反應(yīng)率。表示加入反應(yīng)器中底物的轉(zhuǎn)化率。間歇操作:S0:初始濃度；St:經(jīng)反應(yīng)時(shí)間t后的濃度連續(xù)操作:Sin:流入反應(yīng)器溶液中的底物濃度Sout:流出反應(yīng)器溶液中的底物濃度第55頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞③生產(chǎn)率Pr（生產(chǎn)能力productivity）反應(yīng)器單位體積單位時(shí)間內(nèi)的產(chǎn)物生成量。間歇式反應(yīng)器：連續(xù)式反應(yīng)器：第56頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞④選擇率Ssp(selectivity)當(dāng)反應(yīng)過(guò)程中有副反應(yīng)發(fā)生，還生成其它產(chǎn)物時(shí)，通常使用選擇率這個(gè)概念。

Ssp是實(shí)際轉(zhuǎn)化成目的產(chǎn)物量與全部底物可生成產(chǎn)物的理論量之比。式中asp代表1摩爾底物能生成目的產(chǎn)物P的理論量（摩爾），其數(shù)值取決于反應(yīng)的計(jì)量式第57頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞3.理想的均相酶反應(yīng)器的動(dòng)力學(xué)對(duì)三種最基本的反應(yīng)器型式進(jìn)行討論。間歇全混流反應(yīng)罐（BSTR）活塞流反應(yīng)器（PFR）全混流反應(yīng)器（CSTR）第58頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞（1）PFR的操作特性方程物料在PFR反應(yīng)器中的停留時(shí)間dlFFS0

S

dV=Adll=0l=LS+dSS以底物S進(jìn)行物料衡算：流入量=流出量+反應(yīng)量+積累量FS

F（S+dS）-rsdV0dlFFS0

S

dV=Adll=0l=LS+dSS第59頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞邊界條件：L=0，S=S0；l=L，S=S，積分：這是BSTR和PFR的酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)操作方程式。將米氏方程代入，積分。第60頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞（2）CSTR的操作特性方程穩(wěn)態(tài)時(shí)，對(duì)于底物S進(jìn)行物料衡算：流入量=流出量+反應(yīng)量+積累量

FS0

FSt-rsV0FFS0

St

第61頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞將米氏方程代入整理：CSTR操作特性方程為：第62頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞工程上要求，在最短的操作時(shí)間內(nèi)，用最少量的（固定化）酶，達(dá)到最大的產(chǎn)物生成量、最高的底物轉(zhuǎn)化率，以使生產(chǎn)成本最低。(這些條件稱(chēng)之為反應(yīng)器效率。)下面比較CSTR和PFR的反應(yīng)器效率：（3）PFR和CSTR反應(yīng)器的生產(chǎn)時(shí)間比較為了方便比較，把操作方程改寫(xiě)為：第63頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞x應(yīng)在80﹪以上。達(dá)同樣的轉(zhuǎn)化率，F(xiàn)值差別很大。而且S0/Km越小，差別越顯著。結(jié)論：PFR的停留時(shí)間小于CSTR的停留時(shí)間同一反應(yīng)，工藝條件相同，轉(zhuǎn)化率相同，PFR和CSTR所需的時(shí)間不同。轉(zhuǎn)化率越高，兩者差距越大。第64頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞（4）PFR和CSTR反應(yīng)器的用酶量比較第65頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞反應(yīng)器體積一定，達(dá)到相同轉(zhuǎn)化率時(shí)，ECSTR/EPFR

與轉(zhuǎn)化率的比較轉(zhuǎn)化率x愈高，Km/S0

越大，用酶量的差別越大。第66頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞在給定的反應(yīng)體系下，反應(yīng)器中的裝酶量為定值，達(dá)一定x下反應(yīng)器所需酶量愈少；反應(yīng)器的反應(yīng)有效容積也就愈大?？梢?jiàn)PFR的生產(chǎn)能力比CSTR的大。第67頁(yè)，共79頁(yè)，2023年，2月20日，星期四生物工程專(zhuān)業(yè)課程生化工程第七章固定化酶固定化細(xì)胞第五節(jié)固定化酶、細(xì)胞反應(yīng)器及其動(dòng)力學(xué)1.固定化酶、細(xì)胞反應(yīng)器反應(yīng)器的類(lèi)型和特點(diǎn)(1)間歇式攪拌罐反應(yīng)器用于游離酶反應(yīng)后隨即放料。(2)連續(xù)流動(dòng)攪拌罐反