霉菌的分離純化和鑒定

霉菌的分離、純化與鑒定現(xiàn)在是1頁\一共有43頁\編輯于星期日怎樣鑒定微生物呢？微生物鑒定主要是要回答兩個問題：

一、它是不是某一種菌？

——針對性；——規(guī)范的檢測鑒定方法；——如：致病菌檢測；

二、它到底是什么菌？——常規(guī)鑒定；——大致的工作步驟；——如：篩菌，潛在用途；2現(xiàn)在是2頁\一共有43頁\編輯于星期日分離資源微生物的基本原則一、微生物可謂無處不在，獲得什么樣的微生物，取決于分離的目的：特定類群微生物的分離（定向分離）；獲取新資源（分離未知菌）；分離“混合菌”（完成某種功能的一組菌）；二、分離的基本原則是：獲得目的菌；排除非目的菌；3現(xiàn)在是3頁\一共有43頁\編輯于星期日總思路流程采樣預(yù)處理初篩復(fù)篩形態(tài)學(xué)觀察生理生化實驗分子生物學(xué)方法1、微生物資源的分布；2、樣品的采集：2h、4℃；1、目的菌的富集培養(yǎng)；2、減少非目的菌；3、目的菌的充分釋放；1、培養(yǎng)基設(shè)計原則；2、分離方法介紹；3、培養(yǎng)條件；1、獲得純培養(yǎng)；2、選擇目的菌株；1、霉菌簡介；2、菌落形態(tài)；3、霉菌制片觀察；18SrRNA1、真菌的系統(tǒng)發(fā)育譜；2、微生物快速鑒定技術(shù)；4現(xiàn)在是4頁\一共有43頁\編輯于星期日一、微生物資源的分布及樣本的采集土壤環(huán)境：每年春季或旱雨季之交，一般在3-5月為佳；通常采集10-40cm深處的土樣；若要分離放線菌和真菌，土樣應(yīng)放到無菌牛皮紙袋中，一般不放在瓶子或塑料袋中；如果要分離細菌，最好要保濕；海洋環(huán)境及濕地：0.5μm的濾膜過濾水樣，以增加出菌率；Ekmann型采泥器或重錘式取樣器采集；樣品裝入無菌瓶內(nèi)，不能密封，在3h內(nèi)用于實驗；極端環(huán)境：盡量存放在與采樣環(huán)境相當(dāng)?shù)臈l件下至菌種分離；植物和動物：確保樣品的完整性，迅速對植物切口進行消毒，并用石蠟封住以防外來菌種入侵，用無菌裝置帶回；如動物糞便的采集應(yīng)在動物排便后馬上收集其中間部分，避免外源污染，置于無菌袋內(nèi)；5現(xiàn)在是5頁\一共有43頁\編輯于星期日二、樣品的預(yù)處理1、目的菌的富集培養(yǎng)根據(jù)目的菌的生理特性，加入其所需要的營養(yǎng)物質(zhì)及微量成分進行誘導(dǎo)增殖，增菌；設(shè)計特定的有利于待分離菌株生長的環(huán)境。——為了分離鐵硫桿菌，可將樣品加硫磺后培養(yǎng)；——為了分離分解纖維素或角蛋白等的酶產(chǎn)生菌，可以將樣品與

高濃度的纖維素或角蛋白（適當(dāng)加入其他成分）在適當(dāng)溫度下保濕培養(yǎng)一段時間，再進行分離；2、減少非目的菌

——若目的菌耐干燥，則可通過干燥減少非目的菌；——若要分離高溫菌，可在特定高溫下震蕩培養(yǎng)若干時間，以減少非耐熱菌的干擾；——加入非目的菌的抑制劑；3、目的菌的充分釋放——使目的菌與樣品基質(zhì)分離：加入活化劑或乳化劑；震蕩及超聲波處理，DDC技術(shù)；酶法或研磨等組織破碎法；6現(xiàn)在是6頁\一共有43頁\編輯于星期日三、初篩設(shè)計選擇性培養(yǎng)基，稀釋涂布，挑選目標(biāo)菌株。1、培養(yǎng)基設(shè)計原則

合適的營養(yǎng)物質(zhì)及濃度配比，如不同的C/N源；各無機鹽比例適當(dāng)；合適的滲透壓或水分活度；適宜的pH等；⑴具體如下：開發(fā)意圖貫穿分離過程，使培養(yǎng)基“只”滿足目的菌的要求，而非目的菌不長；eg.尋找低溫堿性脂肪酶產(chǎn)生菌大劑量加入同類化合物；eg.酒精酵母特殊成分；eg.維生素、氨基酸、無機鹽等抑制劑：真菌抑制劑：放線菌酮、制霉菌素等；細菌抑制劑：青霉素、鏈霉素；萘啶酸可抑制革蘭氏陰性細菌；放線菌分離中，選用重鉻酸鉀做抑制劑能很好的抑制細菌和真菌，幾乎不影響放線菌的生長；7現(xiàn)在是7頁\一共有43頁\編輯于星期日⑵常用培養(yǎng)基◆細菌——牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（肉湯培養(yǎng)基）；

◆放線菌——高氏一號培養(yǎng)基；

◆霉菌——馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）、查氏酵母膏瓊脂培養(yǎng)基(CYA)、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(MEA)、甘油硝酸鹽瓊脂培養(yǎng)基(G25N)、察氏培養(yǎng)基(CA)、孟加拉紅培養(yǎng)基、豆汁培養(yǎng)基、其他；PDA培養(yǎng)基成分：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂15-20g、自來水1000ml、自然PH約6.0察氏培養(yǎng)基成分：硝酸鈉3g、磷酸氫二鉀1g、硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.5g、氯化鉀0.5g、硫酸亞鐵0.01g、蔗糖30g、瓊脂20g、蒸餾水1000ml孟加拉紅培養(yǎng)基成分：蛋白胨5g、葡萄糖10g、磷酸二氫鉀1g、硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.5g、瓊脂20g、1/3000孟加拉紅溶液100ml、蒸餾水1000ml、氯霉素0.1g上述各成分加入蒸餾水中溶解后，再加孟加拉紅溶液。另用少量乙醇溶解氯霉素，加入培養(yǎng)基中，分裝后，121℃滅菌20min

注意事項：①在加入凝固劑之前調(diào)pH值；②加酸堿要緩慢，多攪拌；③加熱殺菌后pH值下降。8現(xiàn)在是8頁\一共有43頁\編輯于星期日2、分離方法介紹獲得微生物純培養(yǎng)的幾種常用方法(一)固體培養(yǎng)基分離方法1.涂布平板法2.稀釋倒平板法3.平板劃線法4.稀釋搖管法特點：操作簡單，是常規(guī)方法；缺點：易因涂布不均使某些部位菌落不能分開，不易于計數(shù)；注：取樣液約；特點：菌落分離均勻，計數(shù)相對準確；缺點：操作相對麻煩，熱敏感菌易被燙死，嚴格厭氧菌生長受限；注：取樣液約1ml；方法：用接菌環(huán)沾取待分離菌或菌液在分離平板上劃線分離；特點：簡單，多用于對已有純培養(yǎng)的確認和再次分離；缺點：無法分離得到不可培養(yǎng)的內(nèi)生細菌；此法最簡便，但可能遺落部分菌株；特點：是稀釋倒平板法的變通形式；缺點：由于菌落形成在瓊脂住中間，觀察和挑取困難；應(yīng)用：在缺乏專業(yè)的厭氧設(shè)備的情況下對嚴格厭氧菌進行分離和觀察；9現(xiàn)在是9頁\一共有43頁\編輯于星期日⑵用液體培養(yǎng)基獲得純培養(yǎng)稀釋法：方法：接種物在液體培養(yǎng)基中進行順序稀釋，以得到高度稀釋的效果，使一支試管中分配不到一個微生物；特點：工作量大，是否獲得純培養(yǎng)依靠統(tǒng)計學(xué)的推測；應(yīng)用：用于不能或不易在固體上生長的菌落；10現(xiàn)在是10頁\一共有43頁\編輯于星期日3、培養(yǎng)條件項目類型溫度培養(yǎng)時間細菌37℃1-2d放線菌28℃5-7d霉菌和酵母菌28℃5-7-14d注：根據(jù)不同培養(yǎng)基性質(zhì)等因素，培養(yǎng)條件有所差異，需視情況而定。11現(xiàn)在是11頁\一共有43頁\編輯于星期日四、復(fù)篩

將獲得的單菌落接種于復(fù)篩培養(yǎng)基，給予一定條件進行培養(yǎng)，對產(chǎn)物產(chǎn)率、性能等相關(guān)標(biāo)準進行評價，即可挑出所需要的菌株；根據(jù)目標(biāo)菌的性質(zhì)進行設(shè)計：分解淀粉分解脂肪透明圈分解纖維素耐高溫低溫耐酸堿高滲透壓產(chǎn)糖產(chǎn)酶效率—發(fā)酵

抑菌效果：濾紙片法、牛津杯法12現(xiàn)在是12頁\一共有43頁\編輯于星期日初篩與復(fù)篩的區(qū)別：◆初篩是指從大量的菌落中隨機挑取進行搖瓶試驗并通過檢測得到一些較優(yōu)菌株；

◆復(fù)篩是指將初篩得到的較優(yōu)菌株再進行多次搖瓶實驗驗證其效價和傳代穩(wěn)定性，并從中得到一兩個或少數(shù)幾個最優(yōu)的菌株；將所得目標(biāo)菌接入斜面中，4℃進行短期保存。斜面保存13現(xiàn)在是13頁\一共有43頁\編輯于星期日五、形態(tài)學(xué)觀察1、霉菌簡介⑴真菌酵母菌霉菌：蕈xùn菌（大型真菌）絲狀真菌的統(tǒng)稱。凡是在營養(yǎng)基質(zhì)上能形成絨毛狀、網(wǎng)狀或絮狀菌絲體的真菌（除少數(shù)外），統(tǒng)稱為霉菌?！穹植枷喈?dāng)廣泛?！袷歉鞣N復(fù)雜有機物的主要分解菌。其是數(shù)量最大的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的主要分解菌?！褚话闱闆r下，在潮濕的環(huán)境下易于生長，特別是偏酸性的基質(zhì)當(dāng)中。培養(yǎng)溫度28-32℃。14現(xiàn)在是14頁\一共有43頁\編輯于星期日⑵分類

目前，真菌學(xué)仍然是微生物學(xué)的薄弱環(huán)節(jié)，還有待進一步深入研究。在系統(tǒng)學(xué)方面，受到公認的分類體系不多。真菌的類群：

接合菌綱：代表種—毛霉、根霉

子囊菌綱：代表種—酵母菌、羊肚菌

擔(dān)子菌綱：代表種—鵝膏菌、傘菌

卵菌綱：代表種—異水霉屬

半知菌綱：代表種—青霉屬、曲霉屬、假絲酵母

真菌：Smith、Alexopoulos、Ainsworth分類系統(tǒng)15現(xiàn)在是15頁\一共有43頁\編輯于星期日代表性霉菌：

①毛霉屬②根霉屬③曲霉屬④青霉屬⑤脈孢菌屬⑥赤霉菌屬16現(xiàn)在是16頁\一共有43頁\編輯于星期日根據(jù)菌絲中是否存在隔膜，可把霉菌菌絲分成兩種類型：無隔膜菌絲：無隔膜，整團菌絲體就是一個單細胞，其中含有多個細胞核，這是低等真菌所具有的菌絲類型；有隔膜菌絲：有隔膜，被隔膜隔開的一段菌絲就是一個細胞，菌絲體由很多個細胞組成，每個細胞內(nèi)有1個或多個細胞核。在隔膜上有1至多個小孔，使細胞之間的細胞質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)可以相互溝通，這是高等真菌所具有的菌絲類型；霉菌的菌體由分枝或不分枝的菌絲構(gòu)成。許多分枝菌絲相互交織在一起構(gòu)成菌絲體。菌絲是中空管狀結(jié)構(gòu)，直徑約2~10μm。

低等真菌特有

高等真菌特有⑶霉菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)17現(xiàn)在是17頁\一共有43頁\編輯于星期日生長在固體培養(yǎng)基上的霉菌菌絲可分為三部分：①營養(yǎng)菌絲：深入培養(yǎng)基內(nèi)，吸收營養(yǎng)物質(zhì)的菌絲；②氣生菌絲：營養(yǎng)菌絲向空中生長的菌絲；③繁殖菌絲：部分氣生菌絲發(fā)育到一定階段，分化為繁殖菌絲，產(chǎn)生孢子。18現(xiàn)在是18頁\一共有43頁\編輯于星期日幾種常見的霉菌形態(tài)鑒定主要依據(jù)

菌名

形態(tài)特征

根霉毛霉犁頭霉菌絲匍匐枝假根孢子囊柄孢子囊囊軸囊托囊領(lǐng)

絮狀乳白色托網(wǎng)狀灰褐色棉絮狀灰白色無有有無有有菌絲任何處可生從假根處匍匐枝弓背生出

圓形圓形，較大洋梨形，較小

有有有無有有有無有菌名形態(tài)特征曲霉青霉無性孢子分生孢子分生孢子分生孢子有無橫隔無無頂囊有無足細胞有無19現(xiàn)在是19頁\一共有43頁\編輯于星期日⑷絲狀真菌的生活史

菌絲產(chǎn)生無性孢子進行無性繁殖

同一菌絲體上產(chǎn)生有性繁殖結(jié)構(gòu)形成有性孢子，進行有性繁殖無性孢子、有性孢子及菌絲斷片都能發(fā)育成新的菌絲和菌絲體厚垣孢子節(jié)孢子分生孢子孢囊孢子卵孢子接合孢子子囊孢子20現(xiàn)在是20頁\一共有43頁\編輯于星期日2、菌落形態(tài)液體培養(yǎng)時的特征：

如果是靜止培養(yǎng)，霉菌往往在表面上生長，液面上形成菌膜。如果是震蕩培養(yǎng)，菌絲有時相互纏繞在一起形成菌絲球，菌絲球可能均勻地懸浮在培養(yǎng)液中或沉于培養(yǎng)液底部。霉菌的菌落大、疏松、干燥、不透明，有的呈絨毛狀、絮狀或網(wǎng)狀。菌體可沿培養(yǎng)基表面蔓延生長。由于不同的真菌孢子含有不同的色素，所以菌落可呈現(xiàn)紅、黃、綠、青綠、青灰、黑、白、灰等多種顏色。霉菌菌落正反面顏色呈現(xiàn)明顯差別。21現(xiàn)在是21頁\一共有43頁\編輯于星期日霉菌在孟加拉紅培養(yǎng)基上的典型特征鏈霉菌

甘油硝酸鹽瓊脂：氣絲微褐色?；z無色至淡黃色，在大部分所用培養(yǎng)基內(nèi)無可溶色素；葡糖天冬素瓊脂：氣絲初白色，后粉褐色。基絲無色至淡褐色；淀粉瓊脂：氣絲白色至微褐色帶微粉色彩。基絲無色至乳脂色帶淡褐色彩；蘋果酸鈣瓊脂：氣絲白色?；z無色。營養(yǎng)瓊脂：氣絲少，白色?；z乳脂色。霉菌在孟加拉紅培養(yǎng)基上典型特征為灰色菌落，有黑色孢子。舉例22現(xiàn)在是22頁\一共有43頁\編輯于星期日斜面接種法斜面接種法主要用于接種純菌，使其增殖后用以鑒定或保存菌種；通常先從平板培養(yǎng)基上挑取分離的單個菌落，或挑取斜面的純培養(yǎng)物接種到斜面培養(yǎng)基上，稱為斜面培養(yǎng)；霉菌的斜面接種：適用于擴散型生長及絨毛狀氣生菌絲類霉菌（如毛霉、根霉等）。常用點接法，即點接在斜面中部偏下方；接種室避免碰到試管壁，防止污染；超凈臺酒精燈附近操作，注意灼燒試管口及棉塞；應(yīng)斜持試管呈45度角，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸濕培養(yǎng)基表面，造成污染；23現(xiàn)在是23頁\一共有43頁\編輯于星期日3、霉菌的制片觀察⑴培養(yǎng)方法①插片法③玻璃紙法②搭片法④印片法(1)制平板、接種(2)插片及培養(yǎng)：用無菌鑷子取無菌蓋玻片，在已接種平板上以45°角斜插入培養(yǎng)基內(nèi)，插人深度約占蓋玻片1/2長度。將插片平板倒置于28℃，培養(yǎng)3～7d；(3)培養(yǎng)后的菌絲體生長在培養(yǎng)基及蓋片上。在缺少營養(yǎng)的蓋片上菌絲稀疏,且易產(chǎn)生抱子,便于鏡檢?！艨捎^察到菌體自然生長狀態(tài)下的特征，且便于觀察不同生長期的形態(tài)。(1)開槽及接種：用無菌打孔器在凝固后的平板培養(yǎng)基上打洞數(shù)個，并將孢子劃線接種至洞內(nèi)邊緣；

(2)搭片及培養(yǎng)：在接種后的洞面上放一無菌蓋玻片，平板倒置28℃，培養(yǎng)3～7d；(3)水封片觀察：取一滴美藍染色液置于載玻片中央，將搭片法培養(yǎng)皿中的蓋玻片取出，將有菌面朝下，放在載玻片上，浸在染色液中，制成水封片，用高倍鏡觀察，并繪圖。(1)玻璃紙前期準備：以無菌操作用鑷子將已滅菌的小塊玻璃紙片鋪在培養(yǎng)基表面，用無菌涂布棒將玻璃紙壓平，不留氣泡，每個平板可鋪5-10塊玻璃紙；

(2)涂布菌液及培養(yǎng)：取0.lml孢子懸液涂布在鋪有玻璃紙的平板培養(yǎng)基表面，接種平板倒置于28℃，培養(yǎng)5～7d；(3)直接玻璃紙觀察：于載玻片上放一小滴蒸餾水，將含菌玻璃紙片剪下一小塊，移至載玻片上，并使有菌面向上，注意不能有氣泡。于顯微鏡下觀察，先用低倍鏡觀察菌的立體生長狀況，再用高倍鏡仔細觀察。◆用鑷子取潔凈載玻片并微微加熱，然后用此微熱載玻片蓋在長有待觀察菌的平皿上，輕輕壓一下；◆注意將載玻片垂直放下和取出，以防載玻片水平移動而破壞菌體的自然形態(tài)；◆反轉(zhuǎn)有印痕的載玻片微微加熱固定，用石炭酸復(fù)紅染色1min，水洗，晾干；◆用油鏡觀察，并繪圖?！粲∑ㄖ饕糜谟^察孢子形態(tài)、排列及其形狀等，方法簡便。⑤小室培養(yǎng)24現(xiàn)在是24頁\一共有43頁\編輯于星期日霉菌的小室培養(yǎng)㈠培養(yǎng)小室準備及滅菌在平皿皿底鋪一張略小于皿底的圓濾紙片，在其上面放一個U型玻棒，在U型玻棒上放一塊載玻片和四塊蓋玻片，蓋上皿蓋，做八個,留兩個空培養(yǎng)皿,包扎后于121℃滅菌30min,烘干備用。㈡

PDA培養(yǎng)基準備在無菌箱中，取已滅菌的馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基注入另兩個已滅菌培養(yǎng)皿中，使之凝固成薄層。用解剖刀切成1cm~1.2cm×1cm~1.2cm的方形瓊脂塊，將其移至培養(yǎng)小室的載玻片上，載玻片兩端各放置一塊。㈢接種無菌操作用接種環(huán)挑取很少量的孢子接種于瓊脂塊的邊緣上，用無菌鑷子將蓋玻片覆蓋在瓊脂塊上。㈣培養(yǎng)通過無菌操作，在培養(yǎng)小室中圓濾紙片上加3ml滅菌的20%甘油（用于保持濕度），蓋上蓋皿，于28℃培養(yǎng)。㈤鏡檢從培養(yǎng)箱中取出載玻片在低倍鏡下觀察四種霉菌菌絲體及孢子的形態(tài)特征，必要時換高倍鏡。*注意事項在載玻片培養(yǎng)觀察中，注意無菌操作，接種量要少并盡可能將分散孢子接種在瓊脂塊邊緣，避免培養(yǎng)后菌絲過于密集影響觀察。25現(xiàn)在是25頁\一共有43頁\編輯于星期日2、染色方法制片時染色液是必須的；常用兩種：乳酸品紅染色和乳酸苯酚棉蘭染色；乳酸品紅染色液

——百萬分之一酸性品紅的乳酸溶液；——染色速度快，尤其是幼齡組織上色快；——胞壁組織清晰，適于顯微攝影；乳酸苯酚油棉藍染色液

——10g石炭酸溶于10ml熱蒸餾水，再加甘油20ml、乳酸10ml，最后，加棉藍cottonblue0.22g即成，為油溶性；——折光率好，背景微藍，細胞不變形，殺菌防腐，且不易干燥，保持時間較長（1896年Amann氏發(fā)明）；——菌絲呈藍色，深度隨菌齡增加而減弱；其他：亞甲藍染色等；26現(xiàn)在是26頁\一共有43頁\編輯于星期日染色效果附：GB4789.16-2003p2227現(xiàn)在是27頁\一共有43頁\編輯于星期日六、生理生化實驗1、真菌的系統(tǒng)發(fā)育有別于系統(tǒng)發(fā)育多樣化的藻類，除卵菌綱這一較為古老的例外，在真核生物的系統(tǒng)發(fā)育樹中，真菌是親緣關(guān)系密切的類群。它們之間僅僅在形態(tài)特征和有性生活史中呈現(xiàn)出有差異的多樣性；真菌的營養(yǎng)要求簡單，屬于低營養(yǎng)微生物，其代謝和合成不像細菌那樣多種多樣；因此，目前真菌的分類仍以形態(tài)特征和有性生活史作為分類的指征。28現(xiàn)在是28頁\一共有43頁\編輯于星期日2、微生物快速鑒定和分析技術(shù)㈠微量多項試驗鑒定系統(tǒng)API20E細菌鑒定系統(tǒng)——鑒定腸桿菌科和部分革蘭氏陰性菌29現(xiàn)在是29頁\一共有43頁\編輯于星期日Enterotube系統(tǒng)該裝置可做下列15種試驗：葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、賴氨酸和鳥氨酸脫羧酶、硫化氫、靛基質(zhì)、乳糖和衛(wèi)矛醇發(fā)酵、苯丙氨酸脫氨酶、尿素酶和檸檬酸鹽、側(cè)金盞花醇、阿拉伯糖、山梨醇和V.P試驗等試驗。查閱專門設(shè)計的結(jié)果判定表。30現(xiàn)在是30頁\一共有43頁\編輯于星期日㈡快速、自動化微生物檢測儀器和設(shè)備微生物快速檢測儀器通用儀器：氣相色譜儀、高壓液相色譜儀、質(zhì)譜儀、X射線衍射儀、核磁共振波譜儀、激光拉曼光譜儀及激光顯微鏡、流式細胞儀等；專用或首先使用的儀器：阻抗測定儀、放射測量儀、微量量熱計、生物發(fā)光測定儀、藥敏測定儀、自動微生物檢測儀；31現(xiàn)在是31頁\一共有43頁\編輯于星期日全自動微生物鑒定系統(tǒng)舉例法國梅里埃公司VITEK-32全自動微生物鑒定/藥物分析系統(tǒng)美國BDPhoenixTM-100全自動微生物鑒定/藥敏檢測系統(tǒng)可以同時對100個標(biāo)本進行鑒定與藥敏測試32現(xiàn)在是32頁\一共有43頁\編輯于星期日鑒定部分：51孔鑒定實驗改良經(jīng)典實驗顯色＋熒光檢測無需附加實驗試劑藥敏部分：85孔藥敏實驗比濁＋氧化還原（專利）實測倍比稀釋MIC值藥物種類與濃度梯度最多耐藥機制檢測同步進行封閉式設(shè)計孔板形狀33現(xiàn)在是33頁\一共有43頁\編輯于星期日重力加樣技術(shù)主要操作步驟掃描板條，輸入資料將檢測板放入儀器（隨意位置）

34現(xiàn)在是34頁\一共有43頁\編輯于星期日七、分子生物學(xué)手段——18SrRNA大量的實驗研究表明：在眾多的生物大分子中，最適合于揭示各類生物親緣關(guān)系的是rRNA，尤其是5SrRNA和16SrRNA，而16SrRNA應(yīng)用更廣泛。這是因為：16SrRNA①rRNA參與生物蛋白質(zhì)的合成過程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物進化的漫長歷程中，其功能保持不變；②在16SrRNA分子中，既含有高度保守的序列區(qū)域，又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域，因而它適用于進化距離不同的各類生物親緣關(guān)系的研究；④16SrRNA普遍存在于真核生物和原核生物中（真核生物中其同源分子是18SrRNA）；③16SrRNA相對分子質(zhì)量大小適中，易于提取，便于序列分析；因此它可以作為測量各類生物進化的工具。35現(xiàn)在是35頁\一共有43頁\編輯于星期日真核生物基因組中編碼核糖體的基因包括28SrDNA、5SrDNA、18SrDNA和5.8SrDNA4種,它們在染色體上頭尾相連、串聯(lián)排列,相互之間由間隔區(qū)分隔；其中18S、5.8S和28SrDNA基因組成一個轉(zhuǎn)錄單元,三者高度保守,適合于較高等級水平的生物群體間的系統(tǒng)分析,其間的間隔區(qū)為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS),包括ITS1及ITS2兩部分,由于進化相對迅速而具多態(tài)性,因而適合于等級水平較低的系統(tǒng)學(xué)研究。真菌鑒定：工作經(jīng)驗+時間=鑒別困難；rDNA-ITS多態(tài)性(包括長度多態(tài)性和序列多態(tài)性)的序列分析,可以從核酸序列中獲得信息來反映生物親緣關(guān)系與分類情況；真菌序列分析36現(xiàn)在是36頁\一共有43頁\編輯于星期日主要步驟增菌培養(yǎng)真菌DNA基因組提取核酸濃度與純度測定——凝膠電泳rDNA-ITS擴增——PCRrDNA-ITS測序與分析將擴增出來的目的核酸片段送專業(yè)生物工程公司純化后進行測序，將測得的序列提交美國NCBI的GENBANK獲取對比指標(biāo)靠前的20個相似序列，通過BLAST工具和DNAMAN軟件進行比對分析，并以Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。37現(xiàn)在是37頁\一共有43頁\編輯于星期日系統(tǒng)發(fā)育樹38現(xiàn)在是38頁\一共有43頁\編輯于星期日八、菌種保藏斜面保藏沙土管保藏斜面每隔3個月至半年需要移植一次；傳代次數(shù)多，菌種易變異及退化；◆將沙或土過篩﹑烘干﹑裝管﹑滅菌﹑然後將菌種制成孢子懸液滴入其中混勻﹐放到盛氯化鈣的干燥器里吸除水分﹐干燥後保存或用火焰封管後保存；◆吸附在干燥沙土上的孢子因缺水而處于休眠狀態(tài)﹐因此可保存較長時期；◆菌種沙土管保藏法多用于能產(chǎn)生孢子的微生物如霉菌、放線菌,可保存2年左右；

39現(xiàn)在是39頁\一共有43頁\編輯于星期日其他方法礦油封藏法麩皮法液體干燥法或真空干燥法冷凍真空干燥法液態(tài)氮超低溫凍結(jié)法40現(xiàn)在是40頁\一共有43頁\編輯于星期