人感染高致病性禽流感監(jiān)測(cè)實(shí)施計(jì)劃方案

-.z**省2010年度人感染高致病性禽流感監(jiān)測(cè)實(shí)施方案為做好人感染高致病性禽流感〔下簡(jiǎn)稱“人禽流感〞〕疫情防控工作，我國(guó)于2004年起在全國(guó)建立了不明原因肺炎病例監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，在發(fā)生人禽流感病例和/或動(dòng)物禽流感疫情后開(kāi)展了主動(dòng)應(yīng)急監(jiān)測(cè)。上述監(jiān)測(cè)系統(tǒng)對(duì)我國(guó)人禽流感病例的發(fā)現(xiàn)、調(diào)查、實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)以及疫情控制等方面發(fā)揮了重要作用。目前的監(jiān)測(cè)結(jié)果說(shuō)明，禽類接觸史和活禽市場(chǎng)可能是人感染高致病性禽流感病毒的重要高危因素。2007年以來(lái)我省陸續(xù)在**市、株洲市、**市、**市、永州市的局部縣〔市、區(qū)〕選點(diǎn)開(kāi)展了職業(yè)暴露人群高致病性禽流感監(jiān)測(cè)工程工作，對(duì)監(jiān)測(cè)感染來(lái)源、確定感染高危因素、部署人禽流感疫情防控工作提供了重要的科學(xué)依據(jù)，并已成為一項(xiàng)常規(guī)監(jiān)測(cè)工程工作。2009年我省流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)已擴(kuò)大到全省14個(gè)市州，各市州疾病預(yù)防控制中心流感實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力顯著提高。按照上級(jí)要求，為進(jìn)一步做好我省人禽流感監(jiān)測(cè)工作，根據(jù)形勢(shì)變化及時(shí)調(diào)整工作部署，特制訂本方案。一、監(jiān)測(cè)目的1、加強(qiáng)不明原因肺炎病例的發(fā)現(xiàn)、追蹤、排查和疫情處理等工作，完善人禽流感監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，提高全省監(jiān)測(cè)水平，及時(shí)發(fā)現(xiàn)人禽流感疫情。2、了解我省職業(yè)暴露人群高致病性禽流感病毒〔H5N1〕的感染狀況。3、了解我省高致病性禽流感病毒在環(huán)境中的分布情況。二、監(jiān)測(cè)點(diǎn)的設(shè)置全省14個(gè)市州疾病預(yù)防控制中心均開(kāi)展本項(xiàng)監(jiān)測(cè)工作。職業(yè)暴露人群人禽流感監(jiān)測(cè)點(diǎn)按照監(jiān)測(cè)場(chǎng)所分為四類，即：城鄉(xiāng)活禽市場(chǎng)類、規(guī)模家禽〔含水禽〕養(yǎng)殖場(chǎng)類、農(nóng)村家禽散養(yǎng)戶集中地區(qū)類、野生留鳥(niǎo)棲息地類。每個(gè)市州監(jiān)測(cè)其中兩類，兩類監(jiān)測(cè)點(diǎn)可設(shè)在同一個(gè)縣〔市、區(qū)〕*圍內(nèi)。為保證監(jiān)測(cè)場(chǎng)所的覆蓋，省疾病預(yù)防控制中心統(tǒng)一規(guī)劃監(jiān)測(cè)點(diǎn)設(shè)置，見(jiàn)表1。表1各市州職業(yè)暴露人群高致病性禽流感監(jiān)測(cè)點(diǎn)分類設(shè)置要求市州監(jiān)測(cè)點(diǎn)分類**市城鄉(xiāng)活禽市場(chǎng)、規(guī)模家禽〔含水禽〕養(yǎng)殖場(chǎng)株洲市城鄉(xiāng)活禽市場(chǎng)、規(guī)模家禽〔含水禽〕養(yǎng)殖場(chǎng)**市城鄉(xiāng)活禽市場(chǎng)、規(guī)模家禽〔含水禽〕養(yǎng)殖場(chǎng)**市農(nóng)村家禽散養(yǎng)戶集中地區(qū)、野生留鳥(niǎo)棲息地**市農(nóng)村家禽散養(yǎng)戶集中地區(qū)、野生留鳥(niǎo)棲息地**市規(guī)模家禽〔含水禽〕養(yǎng)殖場(chǎng)、野生留鳥(niǎo)棲息地**市農(nóng)村家禽散養(yǎng)戶集中地區(qū)、野生留鳥(niǎo)棲息地**市城鄉(xiāng)活禽市場(chǎng)、農(nóng)村家禽散養(yǎng)戶集中地區(qū)**市城鄉(xiāng)活禽市場(chǎng)、野生留鳥(niǎo)棲息地**市城鄉(xiāng)活禽市場(chǎng)、規(guī)模家禽〔含水禽〕養(yǎng)殖場(chǎng)永州市農(nóng)村家禽散養(yǎng)戶集中地區(qū)、野生留鳥(niǎo)棲息地**市規(guī)模家禽〔含水禽〕養(yǎng)殖場(chǎng)、野生留鳥(niǎo)棲息地**市農(nóng)村家禽散養(yǎng)戶集中地區(qū)、規(guī)模家禽〔含水禽〕養(yǎng)殖場(chǎng)湘西自治州城鄉(xiāng)活禽市場(chǎng)、農(nóng)村家禽散養(yǎng)戶集中地區(qū)發(fā)生過(guò)動(dòng)物和/或人禽流感疫情的市州，優(yōu)先在疫情發(fā)生地或其周邊縣〔市、區(qū)〕設(shè)立監(jiān)測(cè)點(diǎn)。選定后，應(yīng)記錄監(jiān)測(cè)點(diǎn)的根本信息，包括：整體環(huán)境特點(diǎn)，從業(yè)人員總體情況，禽類養(yǎng)殖、販賣和屠宰等情況〔規(guī)模、數(shù)量等〕，近期禽類免疫情況,近期禽類發(fā)病情況，日常環(huán)境清潔和平安措施等。三、監(jiān)測(cè)內(nèi)容和方法〔一〕不明原因肺炎病例監(jiān)測(cè)1、按照?全國(guó)不明原因肺炎病例監(jiān)測(cè)、排查和管理方案?，現(xiàn)場(chǎng)參與或指導(dǎo)縣〔區(qū)、市〕疾病預(yù)防控制中心對(duì)所轄區(qū)域內(nèi)報(bào)告的不明原因肺炎病例的調(diào)查、采樣，篩查可能的SARS病例和人禽流感病例及其它傳染性呼吸道疾病。2、落實(shí)對(duì)聚集性不明原因肺炎病例的密切接觸者登記、追蹤和醫(yī)學(xué)觀察等防控措施。3、病例相關(guān)標(biāo)本應(yīng)根據(jù)要求和需要送至具備相關(guān)檢測(cè)條件的實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展檢測(cè)。14個(gè)市州疾病預(yù)防控制中心均應(yīng)開(kāi)展檢測(cè)。標(biāo)本采集后分裝為一式三份，一份市州疾病預(yù)防控制中心檢測(cè)，二份送省疾病預(yù)防控制中心供復(fù)核和上送國(guó)家流感中心。4、全年開(kāi)展不明原因肺炎病例監(jiān)測(cè)工作。各市州分別于2010年4月、7月、10月中旬提交階段小結(jié)〔季度總結(jié)〕，2011年1月底前提交年度監(jiān)測(cè)工作總結(jié)?！捕陈殬I(yè)暴露人群血清流行病學(xué)監(jiān)測(cè)1、監(jiān)測(cè)對(duì)象在設(shè)置的監(jiān)測(cè)點(diǎn)內(nèi)按照監(jiān)測(cè)類型選擇以下適當(dāng)人群，每類監(jiān)測(cè)點(diǎn)至少各監(jiān)測(cè)100人,每個(gè)市(州)全年共計(jì)監(jiān)測(cè)至少200名適宜對(duì)象：〔1〕城鄉(xiāng)活禽市場(chǎng)類：活禽批發(fā)市場(chǎng)、城鄉(xiāng)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)或菜市場(chǎng)中直接與禽類接觸的人員。〔2〕規(guī)模家禽〔含水禽〕養(yǎng)殖場(chǎng)類：家禽規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)〔戶〕中直接與禽類接觸的人員?！?〕農(nóng)村家禽散養(yǎng)戶集中地區(qū)類：家禽散養(yǎng)戶的家庭成員?！?〕野生留鳥(niǎo)棲息地類：野生留鳥(niǎo)棲息地中與留鳥(niǎo)或其排泄物有接觸的人員。2、監(jiān)測(cè)時(shí)間各監(jiān)測(cè)點(diǎn)在每年冬春季開(kāi)展監(jiān)測(cè)工作。2010年3月底前完成監(jiān)測(cè)對(duì)象的流行病學(xué)調(diào)查、標(biāo)本采集等現(xiàn)場(chǎng)工作。標(biāo)本采集后1個(gè)月內(nèi)完成檢測(cè)工作。3、監(jiān)測(cè)內(nèi)容與方法〔1〕流行病學(xué)調(diào)查收集調(diào)查對(duì)象的根本情況、禽類接觸史等內(nèi)容，填寫“職業(yè)暴露人群血清流行病學(xué)監(jiān)測(cè)調(diào)查問(wèn)卷〞〔見(jiàn)附表1〕，在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)完成后1周內(nèi)將血清標(biāo)本及登記表、調(diào)查問(wèn)卷〔包括紙質(zhì)表格和EpiData格式數(shù)據(jù)庫(kù)〕送省疾病預(yù)防控制中心流行病防治科、微生物檢驗(yàn)科。?！?〕標(biāo)本采集、運(yùn)送各市〔州〕疾病預(yù)防控制中心每年按照規(guī)定的監(jiān)測(cè)類型至少采集200名適宜對(duì)象的血清標(biāo)本(每個(gè)市州每個(gè)規(guī)定的監(jiān)測(cè)類型至少100份)標(biāo)本。采集監(jiān)測(cè)對(duì)象的空腹靜脈血5ml，填寫“職業(yè)暴露人群血清標(biāo)本登記表〞〔見(jiàn)附表2〕。別離血清，無(wú)菌條件下分裝為3份，其中1份由市〔州〕疾病預(yù)防控制中心在標(biāo)本采集完成后1個(gè)月內(nèi)完成抗體檢測(cè)，另外2份隨同登記表送省疾病預(yù)防控制中心，由省中心復(fù)核并上送國(guó)家流感中心。血清標(biāo)本應(yīng)置－20℃〔3〕實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)各網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用單放射免疫擴(kuò)散溶血實(shí)驗(yàn)〔SRH〕和/或馬血球血凝抑制實(shí)驗(yàn)〔HI〕進(jìn)展H5N1抗體檢測(cè)〔見(jiàn)2〕。標(biāo)本采集后要求1個(gè)月內(nèi)完成檢測(cè)工作，填寫“職業(yè)暴露人群血清流行病學(xué)檢測(cè)結(jié)果表〞〔見(jiàn)附表3〕，檢測(cè)完畢后1周內(nèi)將檢測(cè)結(jié)果和需上送的標(biāo)本一起提交省疾病預(yù)防控制中心流行病防治科、微生物檢驗(yàn)科，由省疾病預(yù)防控制中心匯總后統(tǒng)一上報(bào)國(guó)家流感中心。國(guó)家流感中心應(yīng)用微量中和實(shí)驗(yàn)〔MN〕對(duì)全部陽(yáng)性標(biāo)本和隨機(jī)抽取的5%陰性標(biāo)本進(jìn)展復(fù)核，并向各網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室及時(shí)反響復(fù)核結(jié)果?！踩陈殬I(yè)暴露人群病原學(xué)監(jiān)測(cè)各監(jiān)測(cè)縣要加強(qiáng)對(duì)職業(yè)暴露人群的安康教育和主動(dòng)監(jiān)測(cè)。對(duì)職業(yè)暴露人群中出現(xiàn)的流感樣病癥患者，應(yīng)教育其向鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院、疾病預(yù)防控制中心報(bào)告。所在地的縣級(jí)疾病預(yù)防控制中心應(yīng)及時(shí)采集其相關(guān)標(biāo)本，并及時(shí)送市〔州〕疾病預(yù)防控制中心開(kāi)展實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作。通過(guò)此項(xiàng)工作的開(kāi)展，在我省逐步建立職業(yè)暴露人群病原學(xué)監(jiān)測(cè)工作體系。標(biāo)本信息、檢測(cè)結(jié)果均應(yīng)錄入“中國(guó)流感監(jiān)測(cè)信息系統(tǒng)〞，“標(biāo)本來(lái)源〞歸類為“其他〞，“采集醫(yī)院〞則選擇到病例所在的鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院。在確保生物平安前提下，有條件的網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)季節(jié)性流感病毒核酸陽(yáng)性或甲型H1N1流感病毒核酸陽(yáng)性標(biāo)本開(kāi)展病毒別離工作，并按相應(yīng)要求及時(shí)報(bào)告和上送毒株。〔四〕環(huán)境標(biāo)本高致病性禽流感病原學(xué)監(jiān)測(cè)1、監(jiān)測(cè)對(duì)象職業(yè)暴露人群血清流行病學(xué)監(jiān)測(cè)點(diǎn)的水、禽類〔含留鳥(niǎo)〕糞便及籠具外表等環(huán)境標(biāo)本。2、監(jiān)測(cè)時(shí)間全年監(jiān)測(cè)，每年的1、4、7、10月各采集標(biāo)本1次。2010年1月標(biāo)本到2011年1月補(bǔ)采。防止在監(jiān)測(cè)點(diǎn)消毒后2日內(nèi)開(kāi)展標(biāo)本采集。3、監(jiān)測(cè)方法〔1〕標(biāo)本采集各市州疾病預(yù)防控制中心每個(gè)季度采集標(biāo)本1次，每個(gè)監(jiān)測(cè)縣每次共采集各類標(biāo)本至少10份〔應(yīng)分布在不同場(chǎng)所〕,每個(gè)市州每季度完成至少20份，同時(shí)填寫“環(huán)境標(biāo)本采樣登記表〞〔附表4〕。標(biāo)本采集種類及方法見(jiàn)附錄1?！?〕標(biāo)本運(yùn)輸、處理標(biāo)本采集后應(yīng)在4℃條件下48小時(shí)內(nèi)運(yùn)送至市〔州〕疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室收到標(biāo)本后應(yīng)立即進(jìn)展標(biāo)本處理〔見(jiàn)附錄1〕，并將標(biāo)本分為3份，1份由市〔州〕疾病預(yù)防控制中心進(jìn)展核酸檢測(cè)，另外2份標(biāo)本每個(gè)季度隨同“環(huán)境標(biāo)本采樣登記表〞〔附表4〕和“環(huán)境標(biāo)本病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果表〞〔附表5〕送省疾病預(yù)防控制中心，由省中心復(fù)核并上送國(guó)家疾病預(yù)防控制中心。。留樣標(biāo)本要求在－70〔3〕實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)各市〔州〕疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室收到標(biāo)本后1周內(nèi)對(duì)標(biāo)本進(jìn)展A型流感病毒核酸檢測(cè)，A型流感病毒核酸陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)一步進(jìn)展H5N1亞型檢測(cè)，填寫“環(huán)境標(biāo)本病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果表〞。對(duì)于所有A型流感病毒核酸陽(yáng)性的標(biāo)本，各監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室在完成檢測(cè)后24小時(shí)內(nèi)將檢測(cè)結(jié)果報(bào)告省疾控中心，并及時(shí)將標(biāo)本送省疾病預(yù)防控制中心進(jìn)展復(fù)核。國(guó)家流感中心將對(duì)全部陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)展復(fù)核，并在標(biāo)本收到后48小時(shí)及時(shí)向省疾控中心及網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)展反響。四、數(shù)據(jù)收集及結(jié)果報(bào)送省疾病預(yù)防控制中心負(fù)責(zé)編寫、下發(fā)統(tǒng)一的EpiData數(shù)據(jù)庫(kù)〔附表1～附表5〕。市州疾病預(yù)防控制中心負(fù)責(zé)組織各監(jiān)測(cè)點(diǎn)相關(guān)數(shù)據(jù)錄入工作，嚴(yán)格按照雙錄入的要求統(tǒng)一錄入，數(shù)據(jù)經(jīng)核對(duì)校驗(yàn)無(wú)誤后以電子方式按時(shí)報(bào)省疾病預(yù)防控制中心流行病防治科〔：hncdclbk163.〕。相關(guān)紙質(zhì)表格也應(yīng)一并報(bào)送省疾病預(yù)防控制中心。五、職責(zé)分工及組織實(shí)施〔一〕省疾病預(yù)防控制中心1、制定本省的實(shí)施方案，負(fù)責(zé)監(jiān)測(cè)工作的實(shí)施，包括監(jiān)測(cè)點(diǎn)的選擇、監(jiān)測(cè)人員的技術(shù)培訓(xùn)和指導(dǎo)，以及數(shù)據(jù)收集整理和統(tǒng)計(jì)分析。2、對(duì)各市州、各監(jiān)測(cè)點(diǎn)工作情況定期或不定期進(jìn)展督導(dǎo)、考核及評(píng)估。每個(gè)監(jiān)測(cè)年度完畢后，向中國(guó)疾病預(yù)防控制中心提交全省的監(jiān)測(cè)工作報(bào)告。3、及時(shí)向各市州反響國(guó)家流感中心對(duì)相關(guān)標(biāo)本的復(fù)核檢測(cè)結(jié)果?！捕掣魇兄菁膊☆A(yù)防控制中心1、負(fù)責(zé)監(jiān)測(cè)工作的實(shí)施，包括監(jiān)測(cè)場(chǎng)所的選擇、人員的技術(shù)培訓(xùn)和指導(dǎo)、標(biāo)本的采集以及數(shù)據(jù)收集、整理、錄入、上報(bào)和分析。2、對(duì)采集標(biāo)本進(jìn)展實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，并及時(shí)提交檢測(cè)結(jié)果。按監(jiān)測(cè)方案的要求及時(shí)上送各類標(biāo)本進(jìn)展復(fù)核。3、5月底前將監(jiān)測(cè)點(diǎn)根本信息、職業(yè)暴露人群血清流行病學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果及工作總結(jié)報(bào)省疾病預(yù)防控制中心流行病防治科、微生物檢驗(yàn)科，省疾病預(yù)防控制中心匯總后報(bào)國(guó)家流感中心。4、2011年1月底前向省疾病預(yù)防控制中心提交2010年度監(jiān)測(cè)工程工作總結(jié)。〔三〕監(jiān)測(cè)點(diǎn)所在縣〔市、區(qū)〕疾病預(yù)防控制中心在市州疾病預(yù)防控制中心的指導(dǎo)下，積極配合、參與監(jiān)測(cè)工程有關(guān)工作。所承當(dāng)具體工作任務(wù)由各市州疾病預(yù)防控制中心確定。六、考核和評(píng)估衛(wèi)生部、中國(guó)疾病預(yù)防控制中心將對(duì)各省、各監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)工作進(jìn)展年度考核、評(píng)估。在省衛(wèi)生廳的組織領(lǐng)導(dǎo)下，由省疾病預(yù)防控制中心制定方案并具體實(shí)施對(duì)各市州的考核、評(píng)估。各地工作開(kāi)展情況和考核評(píng)估結(jié)果在?**疾病監(jiān)測(cè)質(zhì)量月報(bào)?上公布。七、附表和附錄附表1、職業(yè)暴露人群血清流行病學(xué)監(jiān)測(cè)調(diào)查問(wèn)卷附表2、職業(yè)暴露人群血清標(biāo)本登記表附表3、職業(yè)暴露人群血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果表附表4、環(huán)境標(biāo)本采樣登記表附表5、環(huán)境標(biāo)本病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果表附錄1、標(biāo)本的采集、處理、保存與運(yùn)輸附錄2、實(shí)驗(yàn)室操作方法簡(jiǎn)介附錄3、**省流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室編號(hào)規(guī)則附表1、職業(yè)暴露人群血清流行病學(xué)監(jiān)測(cè)調(diào)查問(wèn)卷省市縣編碼□□□□□□血清標(biāo)本編號(hào)B□□□□□□□□□一、一般情況1、**：〔：〕2、性別：①男性②女性3、年齡：周歲4、現(xiàn)住址：5、職業(yè)：①幼托兒童②散居兒童③學(xué)生〔大中小學(xué)〕④教師⑤保育員及保姆⑥餐飲食品業(yè)⑦商業(yè)效勞⑧醫(yī)務(wù)人員⑨工人eq\o\ac(○,10)民工eq\o\ac(○,11)農(nóng)民eq\o\ac(○,12)牧民eq\o\ac(○,13)漁〔船〕民eq\o\ac(○,14)干部職員eq\o\ac(○,15)離退人員eq\o\ac(○,16)家務(wù)及待業(yè)eq\o\ac(○,17)其他eq\o\ac(○,18)不詳二、暴露情況〔可多項(xiàng)選擇〕6、職業(yè)暴露人群種類：①散養(yǎng)戶②規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)從業(yè)人員③活禽批發(fā)市場(chǎng)人員④農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)或菜市場(chǎng)活禽交易人員⑤家禽屠宰加工廠人員⑥野生留鳥(niǎo)棲息地接觸鳥(niǎo)類人員⑦其他7、暴露方式：①喂養(yǎng)②清掃禽舍③加工〔宰殺、拔毛、洗切、腌制、烹飪〕④食用⑤捕殺⑥運(yùn)輸⑦捕捉⑧銷售⑨其他8、如為養(yǎng)殖人員，禽類養(yǎng)殖方式：①雞羽1〕散養(yǎng)2〕圈養(yǎng)②鴨羽1〕散養(yǎng)2〕圈養(yǎng)③鵝羽1〕散養(yǎng)2〕圈養(yǎng)④鴿子羽1〕散養(yǎng)2〕圈養(yǎng)⑤其他羽1〕散養(yǎng)2〕圈養(yǎng)9、近一個(gè)月來(lái)，接觸禽種類：①雞②鴨③鵝④鴿子⑤野禽⑥其他10、所接觸的禽類是否接種過(guò)禽流感疫苗.①是②否③不詳11、近一個(gè)月以來(lái)，是否接觸過(guò)病死禽.①是②否③不詳〔1〕病死禽種類：①雞羽②鴨羽③鵝羽④鴿子羽⑤其他羽〔2〕接觸方式為：〔可多項(xiàng)選擇〕①喂養(yǎng)②清掃禽舍③加工〔宰殺、拔毛、洗切、腌制、烹飪〕④食用⑤捕殺⑥運(yùn)輸⑦捕捉⑧其他〔3〕接觸病死禽時(shí)是否有防護(hù)措施.①是②否③不詳如果有，采取的措施有：〔可多項(xiàng)選擇〕①戴口罩〔N95口罩、過(guò)濾口罩、棉紗口罩、一次性外科口罩〕②戴面罩③穿防護(hù)服〔規(guī)*、不規(guī)*〕④防護(hù)眼鏡⑤手套⑥帽子⑦白大衣⑧其它〔4〕接觸病死禽的持續(xù)時(shí)間：天〔月日到月日〕累計(jì)暴露：小時(shí)12、近1個(gè)月是否出現(xiàn)過(guò)發(fā)熱.①是②否③不詳〔1〕發(fā)熱起始時(shí)間月日，共持續(xù)天，最高體溫℃〔2〕發(fā)熱時(shí)是否伴有其它不適病癥.①是②否③不詳出現(xiàn)病癥起始時(shí)間月日，共持續(xù)天，主要病癥有：①頭痛②咽痛③鼻塞④肌肉酸痛⑤腹痛⑥腹瀉⑦其它13、近1年是否接種過(guò)流感疫苗.①是②否③不詳調(diào)查人員單位：調(diào)查人員：調(diào)查日期：審核人員：審核日期：附表2、職業(yè)暴露人群血清標(biāo)本登記表采集地點(diǎn)：縣〔市、區(qū)〕鄉(xiāng)〔鎮(zhèn)〕標(biāo)本編號(hào)**年齡性別現(xiàn)住址采樣日期標(biāo)本量備注注：1.采集地點(diǎn)：填寫標(biāo)本采集地的禽類場(chǎng)所名稱2.標(biāo)本編號(hào)原則：〔1〕血清標(biāo)本代號(hào)：B〔2〕年份：10，表示2010年〔3〕網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室流水號(hào)，見(jiàn)附錄3〔4〕實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本編號(hào)從001開(kāi)場(chǎng)例如：**市疾病預(yù)防控制中心標(biāo)本B1055001**市疾病預(yù)防控制中心標(biāo)本B104306001采集人：采集單位：送檢日期：附表3、職業(yè)暴露人群血清流行病學(xué)檢測(cè)結(jié)果表檢測(cè)單位：1.檢測(cè)方法：馬血球HI〔〕、SRH〔〕2.使用抗原：參考血清名稱：3實(shí)驗(yàn)結(jié)果標(biāo)本編號(hào)檢測(cè)結(jié)果標(biāo)本狀態(tài)備注HI滴度SRH直徑注：標(biāo)本狀態(tài)：溶血，乳糜血，黃疸，血清少檢測(cè)者：檢測(cè)日期：復(fù)核者：附表4、環(huán)境標(biāo)本采樣登記表采集地點(diǎn)：縣〔市、區(qū)〕鄉(xiāng)〔鎮(zhèn)〕村〔居委會(huì)〕標(biāo)本編號(hào)采集日期采集地點(diǎn)標(biāo)本種類備注注：標(biāo)本編號(hào)原則：〔1〕環(huán)境標(biāo)本代號(hào)：C〔2〕年份：10，表示2010年〔3〕網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室流水號(hào)，見(jiàn)附錄3〔4〕實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本從001開(kāi)場(chǎng)例如：**市疾病預(yù)防控制中心標(biāo)本C1055001**市疾病預(yù)防控制中心標(biāo)本C104306001采集人：采樣單位：送檢日期：附表5、環(huán)境標(biāo)本病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果表檢測(cè)單位：采用的檢測(cè)方法：One-stepPCR：RealtimePCR：One-step試劑盒Real-time試劑盒：引物來(lái)源：檢測(cè)結(jié)果標(biāo)本編號(hào)采樣日期檢測(cè)結(jié)果備注A型B型H5N1其他陰性操檢測(cè)日期：復(fù)核者：附錄1、標(biāo)本的采集、處理、保存與運(yùn)輸一、標(biāo)本采集與處理血清標(biāo)本取真空負(fù)壓采血管，做好標(biāo)記，采集監(jiān)測(cè)對(duì)象空腹靜脈血5mL。然后置于室溫?cái)?shù)小時(shí)待血完全凝固。1500rpm～2000rpm離心10min，收集血清分裝于3支帶外螺旋蓋的凍存管中，做好標(biāo)記。2.環(huán)境標(biāo)本環(huán)境標(biāo)本采樣液可使用Hank's或Eagle's等培養(yǎng)液參加以下抗菌素和0.5%BSA：氨芐青霉素(2*106IU/L)、鏈霉素(200mg/L)、多粘菌素B(2*106IU/L)、慶大霉素(250mg/L)、制霉菌素(0.5*106IU/L)、鹽酸氧氟沙星(60mg/L)、磺胺甲基異惡唑(0.2g/L)。標(biāo)本采集后應(yīng)在4℃各網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室收到標(biāo)本后1周內(nèi)完成對(duì)標(biāo)本的核酸檢測(cè)，首先進(jìn)展A型流感病毒核酸檢測(cè)，對(duì)于A型陽(yáng)性標(biāo)本需進(jìn)一步進(jìn)展H5N1亞型檢測(cè)。〔1〕水標(biāo)本在禽類活動(dòng)或籠具旁的水溝或水池的不同部位共收集水標(biāo)本15-20ml置于50ml外螺旋蓋的管內(nèi)。水樣標(biāo)本到實(shí)驗(yàn)室后應(yīng)在采樣管中參加上述抗生素和0.5%BSA，再進(jìn)展分裝。呼吸道和環(huán)境標(biāo)本要在無(wú)菌條件下反復(fù)吹打收集的溶液，以便打碎粘液和固體，置4℃〔2〕籠具外表標(biāo)本用沾有采樣液的帶有聚丙烯纖維頭的拭子擦拭籠具外表3-5個(gè)不同部位，然后將擦拭過(guò)的拭子放入含5ml采樣液的采樣管中，尾部棄去。分裝前務(wù)必充分震蕩。二、標(biāo)本保存和運(yùn)輸1．標(biāo)本保存血清標(biāo)本可置4℃存放3天，存放超過(guò)3天需置-20環(huán)境原始標(biāo)本可置4℃存放2天，存放超過(guò)3天需置-702.標(biāo)本運(yùn)輸各網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室在完成檢測(cè)后1周內(nèi)將原始樣本送省疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)科復(fù)核。運(yùn)輸中，標(biāo)本應(yīng)放入專用運(yùn)輸箱內(nèi)〔或疫苗冷藏包〕，放入冰排，然后以柔軟物質(zhì)填充，內(nèi)襯具吸水和緩沖能力的材料。同時(shí)寄送標(biāo)本登記表。運(yùn)輸要求符合國(guó)家生物平安有關(guān)規(guī)定。病原學(xué)標(biāo)本按B類感染性物質(zhì)進(jìn)展運(yùn)輸，航空采用UN3373包裝。三、**省疾病預(yù)防控制中心標(biāo)本接收單位和聯(lián)系方式聯(lián)系：0731－84305932：0731－84305931結(jié)果提交：hncdclbk163.附錄2、實(shí)驗(yàn)室操作方法簡(jiǎn)介一、馬紅細(xì)胞血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)禽流感抗體〔一〕生物平安要求禽流感H5N1亞型檢測(cè)抗原的滅活需要在BSL-3級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)展。其余操作均在BSL-2級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)展?！捕巢牧?．抗原：滅活的H5N1流感病毒。2．血清：〔1〕陽(yáng)性對(duì)照血清；陰性對(duì)照血清〔2〕待檢血清3．其他主要試劑：〔1〕馬紅細(xì)胞〔1:1的比例保存于阿氏液中，建議采血后72小時(shí)內(nèi)使用〕〔2〕磷酸鹽緩沖液〔PH7.2PBS〕：0.01M；〔3〕牛血清白蛋白〔BSA〕；〔4〕霍亂濾液〔RDE〕4．其他：〔1〕“V〞型96孔微量板〔2〕37℃及56℃水浴鍋〔3〕臺(tái)式離心機(jī)〔4〕多道可調(diào)加樣器〔5〕離心管〔三〕質(zhì)量控制1、對(duì)照血清每塊96孔板上均需要設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，同批次的陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果滴度應(yīng)保持2倍以內(nèi)。2、紅細(xì)胞對(duì)照實(shí)驗(yàn)可根據(jù)紅細(xì)胞對(duì)照來(lái)判斷反響時(shí)間，盡可能在每塊96孔板上設(shè)計(jì)一孔紅細(xì)胞對(duì)照〔PBS+1%紅細(xì)胞懸液〕。3、病毒回滴一個(gè)紅細(xì)胞凝集單位指能引起等量標(biāo)準(zhǔn)化的紅細(xì)胞凝集時(shí)病毒的量。進(jìn)展紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)時(shí)一般用4個(gè)紅細(xì)胞凝集單位〔指25μL體積中含有4個(gè)紅細(xì)胞凝集單位〕的病毒量?！菜摹硨?shí)驗(yàn)步驟1、血清處理〔1〕用單道加樣器吸出1體積血清置于無(wú)菌Eppendorf管內(nèi)，換滴頭參加4體積RDE，吹打混勻。〔2〕置37℃〔3〕從37℃水浴取出后置56℃〔4〕馬紅細(xì)胞吸附：瞬時(shí)離心，待冷卻后參加清洗后的濃紅細(xì)胞達(dá)20%〔每100μLRDE處理過(guò)的血清參加20μL清洗后的濃紅細(xì)胞〕?；靹蚝笫覝匚?h。〔5〕2000rpm離心5min?！?〕小心吸取上清液至干凈離心管中備用。如不需立即檢測(cè)可放4℃2．馬紅細(xì)胞的采集及1%馬紅細(xì)胞懸液的配備〔1〕在注射器里放入一定體積的阿氏液，從頸靜脈處采集馬血后放入容器中，輕柔混勻，如阿氏液缺乏則需補(bǔ)足〔阿氏液和紅細(xì)胞的比例為1:1〕。〔2〕采集的馬紅細(xì)胞應(yīng)放入冰箱4℃〔3〕在配置1%馬紅細(xì)胞懸液前需清洗紅細(xì)胞液。首先參加5mL紅細(xì)胞〔沉積在容器底部的紅細(xì)胞〕至50mL離心管。參加45mLPBS-0.5%BSA使總體積到達(dá)50mL，輕柔混勻?！?〕2000rpm(600×g)離心5min。〔5〕吸掉上清液后，連續(xù)重復(fù)步驟〔3〕-〔4〕兩次?！?〕為了精準(zhǔn)馬血球的濃度，取濃縮后的馬血球1ml于1.5ml離心管中，3600g〔8000rpm〕離心10min，吸取壓縮后血球的上清并統(tǒng)計(jì)出吸取上清的體積，計(jì)算實(shí)際的血球百分比〔一般到達(dá)未壓縮前體積的60-75%〕。將完全壓縮后的馬血球棄去?！?〕計(jì)算最終的血球量使?jié)舛鹊竭_(dá)完全壓縮后的1%，取所需洗好馬血球的體積參加PBS-0.5%BSA中，每次用前輕輕混勻后使用。3．制備用于紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)的4個(gè)紅細(xì)胞凝集單位的抗原〔1〕將微量板橫向放置：垂直方向稱列，如孔A1～H1稱為第一列；平行方向稱行，如A1～A12稱為A行。標(biāo)記好標(biāo)準(zhǔn)診斷抗原及加樣順序。1〕吸取50μLPBS參加微量板的第二列至最后一列，于第一列參加100μL標(biāo)準(zhǔn)診斷病毒。2〕從第一列取50μL病毒液，依次從第二列至第八列做2倍系列稀釋。最后一列每孔棄去50μL稀釋后的病毒液。3〕每孔參加50μL1%的紅細(xì)胞懸液，輕彈微量板，使紅細(xì)胞與病毒充分混合。4〕室溫孵育45～60min，觀察紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象并記錄結(jié)果。5〕結(jié)果判定：紅細(xì)胞凝集滴度的判定以出現(xiàn)完全凝集的最高稀釋度為終點(diǎn)，其稀釋度的倒數(shù)即為病毒的紅細(xì)胞凝集滴度。紅細(xì)胞完全凝集以“+〞記錄；無(wú)凝集或局部凝集“-〞記錄?！?〕制備4個(gè)紅細(xì)胞凝集抗原時(shí)：首先計(jì)算出紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)所需的病毒抗原的總量。如每份血清作8孔稀釋，每孔用抗原25μL抗原，則測(cè)定一份血清需0.2mL抗原。根據(jù)參比血清的份數(shù)計(jì)算出實(shí)驗(yàn)所需病毒抗原量，然后配制抗原。〔3〕計(jì)算出病毒稀釋度。用病毒紅細(xì)胞凝集滴度〔HA滴度〕除以8，得到的商即為4個(gè)紅細(xì)胞凝集單位的稀釋度。如，*病毒的HA滴度為64，除以8等于8。按1:8〔1mL病毒液加7mLPBS〕稀釋該病毒即可得到4個(gè)凝集單位/25μL的抗原病毒量?！?〕為了保證紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)中抗原用量一致并且準(zhǔn)確無(wú)誤，新配制的4個(gè)凝集單位抗原須復(fù)核滴定：取50μL稀釋好的抗原，用等量PBS做倍比稀釋〔同病毒滴定〕后參加50μL紅細(xì)胞懸液，至室溫孵育45～60min后觀察凝集結(jié)果。如只有前4孔出現(xiàn)凝集，說(shuō)明每50μL病毒含有8個(gè)凝集單位〔即25μL中含有4個(gè)紅細(xì)胞凝集〕，該病毒稀釋準(zhǔn)確，可以用于紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)。如第5孔也出現(xiàn)凝集，說(shuō)明每50μL病毒含有16個(gè)凝集單位，該抗原必須等量稀釋。如只有前3孔凝集，說(shuō)明每50μL病毒僅含有4個(gè)凝集單位，病毒量需要加倍。此外，4個(gè)凝集單位抗原必須每次用前新配制。4．紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)〔HI〕檢測(cè)血清抗體將微量板橫向放置：垂直方向稱列，如孔A1～H1稱為第一列；平行方向稱行，如A1～A12稱為A行。標(biāo)記好待檢病毒的實(shí)驗(yàn)室編號(hào)及加樣順序?！?〕每孔參加25μLPBS?！?〕A1參加25μL標(biāo)準(zhǔn)診斷血清作為陽(yáng)性對(duì)照；A2參加25μLH5N1陰性血清作為陰性對(duì)照?！?〕自A3孔開(kāi)場(chǎng)分別參加25μL待檢血清；〔4〕用多道加樣器吸取25μL血清〔A1-A12〕，由A行至H行做2倍系列稀釋血清，至H行后棄去25μL。系列稀釋時(shí)需注意每一次稀釋都應(yīng)混合均勻?！?〕參加25μL含4個(gè)凝集單位的抗原。〔6〕混勻后室溫孵育30min。〔7〕每孔參加50μL1%馬紅細(xì)胞懸液，輕彈微量板，使紅細(xì)胞與病毒充分混合?！?〕室溫孵育45-60min，觀察紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)結(jié)果。〔9〕結(jié)果判定當(dāng)特定的抗體與相應(yīng)的紅細(xì)胞凝集抗原結(jié)合后，可以抑制病毒引起的紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。紅細(xì)胞凝集抑制效價(jià)是指抑制紅細(xì)胞凝集出現(xiàn)時(shí)血清的最高稀釋度的倒數(shù)。如1:80稀釋的血清孔不出現(xiàn)凝劑〔紅細(xì)胞凝集完全抑制〕，1:160稀釋的血清孔出現(xiàn)凝集〔無(wú)紅細(xì)胞凝集抑制〕，該血清對(duì)測(cè)定病毒的紅細(xì)胞凝集抑制效價(jià)為80。人血清對(duì)H5N1抗原的抑制效價(jià)≥1:160可判定為陽(yáng)性〔參考WHO推薦標(biāo)準(zhǔn)〕，但還需要用另一種血清學(xué)方法驗(yàn)證。二、流感/禽流感單放射免疫擴(kuò)散溶血技術(shù)抗體檢測(cè)〔一〕生物平安要求抗原的制備和血清滅活根據(jù)所從事病毒的種類在相應(yīng)的生物平安級(jí)別實(shí)驗(yàn)室進(jìn)展，SRH檢測(cè)在生物平安二級(jí)〔BSL-2〕實(shí)驗(yàn)室進(jìn)展操作。〔二〕材料1．Alsever’s液2．pH7.2PBS緩沖液3．10%疊氮鈉〔sodiumazide，NaN3〕溶液4．5×10-4mol/LKIO4〔過(guò)碘酸鉀〕溶液11.5mgKIO4參加pH7.2PBS溶液至100mL，完全溶解后置4℃保存。5．1%瓊脂糖6．1%雞紅細(xì)胞懸液7．濃雞紅細(xì)胞〔洗滌后去掉上清的雞紅細(xì)胞〕8．補(bǔ)體的制備至少6只安康成年豚鼠，采血前一天下午禁食，第二天上午從心臟采血，每只可采5～10mL，每只采完后速至冰上，多只豚鼠血清混勻后使用，當(dāng)天別離血清，分裝，置-70℃冰箱中保存。由于補(bǔ)體耐熱性差，因此，操作時(shí)盡量在4℃條件下進(jìn)展。9．抗原一般采用接種雞胚尿囊腔后收獲的流感/禽流感病毒液，甲醛滅活的病毒需在-70℃10．參比血清抗H5N1病毒兔血清及普通流感病毒參比兔血清。11．測(cè)定血清血清檢測(cè)前56℃30min滅活去除血清中不耐熱的非特異性抑制素和補(bǔ)體；血清從56℃水浴箱中取出，置室溫冷卻，每管加終濃度為20%的濃雞紅細(xì)胞，混勻，置室溫1h或4℃過(guò)夜，1500rpm離心10min，棄沉淀物，留上清。紅細(xì)胞吸附的目的是去除人血清中可能含有對(duì)雞紅細(xì)胞的嗜異性抗體〔Forssman’santibody〕。12．免疫擴(kuò)散板13．打孔器，孔徑為2mm和3mm的打孔器。14．小燒杯，帶蓋的可裝擴(kuò)散板的塑料盒。15．測(cè)量放大鏡〔帶有每個(gè)刻度0.1mm的刻度尺〕或一般透明并帶刻度的尺子。根據(jù)測(cè)量的溶血圈直徑，可按以下公式計(jì)算出溶血圈面積〔S〕：S1=πR12S2=πR22S=S1-S2如用3mm孔徑，測(cè)量的溶血圈直徑為8mm，代入上述公式就可算出溶血圈面積：S1=πR12=π×42=3.1416×16=50.27〔mm2〕S2=πR22=π×1.52=3.1416×2.25=7.07〔mm2〕S=S1-S2=50.27-7.07=43.20〔mm2〕〔三〕實(shí)驗(yàn)步驟1．病毒抗原紅細(xì)胞凝集滴度的測(cè)定及1000個(gè)紅細(xì)胞凝集單位計(jì)算〔1〕病毒抗原紅細(xì)胞凝集滴度的測(cè)定采用雞血球，按常規(guī)流感病毒96孔微孔板進(jìn)展病毒滴度測(cè)定?！?〕1000個(gè)紅細(xì)胞凝集單位計(jì)算根據(jù)紅細(xì)胞凝集滴度算出1000個(gè)紅細(xì)胞凝集單位所需測(cè)定病毒的量。如病毒滴定時(shí)紅細(xì)胞凝集滴度為64，則按以下公式計(jì)算：0.05:64=*:1000,*=〔0.05×1000〕/64=50/64=0.78〔mL〕也就是說(shuō)，每0.1mL濃的雞紅細(xì)胞中需要參加0.78mL測(cè)定的病毒溶液。按這個(gè)比例算出實(shí)驗(yàn)所需的病毒量。2．溶解1%瓊脂糖并恒溫于60℃使用PH7.2的PBS同時(shí)參加1‰NaN3以防止細(xì)菌生長(zhǎng)。煮沸或者用微波爐使1%瓊脂糖完全溶解，速置60℃水浴箱中，分裝于小燒杯中，2.9mL/杯，置60℃水浴箱中。根據(jù)工作量計(jì)算出所需燒杯的數(shù)量。3．紅細(xì)胞處理按每塊擴(kuò)散板需50μl濃的雞紅細(xì)胞，計(jì)算出工作中所需的濃紅細(xì)胞容量，將所需的濃雞紅細(xì)胞放入帶尖底的15mL離心管中，參加等容量的5×10-4mol/LKIO4，混勻，置室溫15min。KIO4處理的目的是使病毒吸附到紅細(xì)胞外表后不會(huì)游離下來(lái)。4．加病毒抗原按每0.1mL濃雞紅細(xì)胞需1000個(gè)紅細(xì)胞凝集單位病毒抗原的比例，參加KIO4處理過(guò)的紅細(xì)胞，混之，置室溫10min，1500rpm離心3min，棄上清，用至少5倍量于沉淀物的pH7.2PBS沖洗，1500rpm離心10min，棄上清，參加與紅細(xì)胞等量的pH7.2的PBS。5．把所需的擴(kuò)散板平排好，并標(biāo)明標(biāo)記。6．溶血板制備用吸管將步驟中紅細(xì)胞輕輕吹勻，而后吸出100μL放入恒溫在60℃水浴箱中含2.9mL瓊脂糖的燒杯，置水浴中搖勻，而后迅速倒入擴(kuò)散板中，并迅速用燒杯鋪平之。待第一塊板鋪完后，按同法鋪第二塊板，直至全鋪完。溶血板凝固后應(yīng)為紅細(xì)胞均勻分布的透明凝膠板，假設(shè)出現(xiàn)芝麻樣顆粒、濃淡不均的血絲等，均應(yīng)重新進(jìn)展鋪板。7．打孔待瓊脂糖完全凝固〔一般置室溫15~20min〕后打孔，診斷用打3mm直徑孔，血清流行病學(xué)調(diào)查打2mm直徑孔。打完后用針頭將孔中瓊脂挑出，然后蓋上板蓋。8．加樣孔徑3mm的一般10μL/孔，孔徑2mm的為4~5μL/孔，每批實(shí)驗(yàn)必須要有陽(yáng)性和陰性血清對(duì)照；配對(duì)血清應(yīng)在同一板上進(jìn)展，以便減少板間的誤差。9．?dāng)U散當(dāng)每塊板加完樣本，馬上蓋上板蓋。待全部板加完樣本并蓋上板蓋，平放在帶有濕度的盒子中，置4℃冰箱擴(kuò)散16～18h。10．加補(bǔ)體補(bǔ)體從-70℃冰箱取出，用自來(lái)水龍頭沖之，讓其速溶。溶后速置冰上，用冷的pH7.2PBS進(jìn)展1:3或1:4稀釋，即1mL補(bǔ)體稀釋成3mL或4mL。將擴(kuò)散板從冰箱取出，平放實(shí)驗(yàn)桌上，每板平鋪稀釋好的補(bǔ)體1mL，平放帶有濕度的盒中，無(wú)需板蓋，平放35~37℃孵箱4h。正常紅細(xì)胞對(duì)照板，除病毒用pH7.2PBS替代外，其余操作步驟完全與實(shí)驗(yàn)板一樣。11．結(jié)果觀察和判斷4h以后，從孵箱中取出，倒掉補(bǔ)體，進(jìn)展結(jié)果觀察?！?〕陽(yáng)性對(duì)照血清應(yīng)出現(xiàn)清晰，而不是模糊或不透明的溶血圈，并溶血圈面積比預(yù)實(shí)驗(yàn)的不能相差1.5倍或以上；陰性對(duì)照血清不應(yīng)出現(xiàn)任何溶血圈。〔2〕正常紅細(xì)胞對(duì)照板不應(yīng)出現(xiàn)任何溶血圈。〔3〕恢復(fù)期血清溶血圈面積應(yīng)為急性期的≥2倍表示有意義的差異；兩者相差＜1.5倍為實(shí)驗(yàn)誤差；兩者相差1.5倍或以上但不到2倍，需重復(fù)測(cè)定，如仍相差1.5倍或以上但不到2倍，可判為有意義差異。如重復(fù)測(cè)定相差為＜1.5倍，表示為實(shí)驗(yàn)誤差。不配對(duì)血清測(cè)定時(shí)，2mm孔徑的，溶血圈直徑需≥4mm〔溶血圈面積≥9.42mm2〕；3mm孔徑的，溶血圈直徑需≥5mm〔溶血圈面積≥12.57mm2〕可認(rèn)為是陽(yáng)性血清。12．考前須知〔1〕抗原量一定要掌握準(zhǔn)確，量過(guò)大一方面使測(cè)定敏感性下降，另一方面由于過(guò)量的病毒顆粒吸附在紅細(xì)胞外表，紅細(xì)胞不易吹散開(kāi)，鋪板時(shí)易出現(xiàn)芝麻樣顆粒，過(guò)少的紅細(xì)胞溶解不清晰或不溶解?！?〕血清盡量防止反復(fù)凍融，因反復(fù)凍融會(huì)產(chǎn)生抗補(bǔ)體影響溶血圈的清晰度?！?〕雙份配對(duì)的血清應(yīng)在同一塊板上進(jìn)展測(cè)定，以便防止板間的誤差。〔4〕陽(yáng)性對(duì)照血清，有時(shí)由于滴度過(guò)高，出現(xiàn)很大的溶血圈，把鄰近的孔覆蓋，因此，最好靠近它的孔不加樣本或?qū)㈥?yáng)性血清進(jìn)展適當(dāng)稀釋，如1∶5稀釋，而后使用之?！?〕對(duì)患者進(jìn)展血清學(xué)診斷時(shí)，建議用3mm孔徑的孔，因用2mm孔徑有時(shí)會(huì)出現(xiàn)重疊溶血圈影響結(jié)果準(zhǔn)確的判斷。進(jìn)展血清流行病學(xué)調(diào)查時(shí)建議用2mm孔徑。〔6〕測(cè)量溶血圈直徑時(shí)，應(yīng)測(cè)量最清晰的，因標(biāo)準(zhǔn)的溶血圈常為靠近孔邊緣出現(xiàn)清晰透亮的溶血圈，它的外圍出現(xiàn)不十分清晰的溶血圈，此溶血圈外圍又有個(gè)清晰的溶血圈，這是要測(cè)量的直徑。測(cè)量時(shí)，尺子要挨在擴(kuò)散板上?！?〕正常紅細(xì)胞對(duì)照板所出現(xiàn)的溶血圈面積與實(shí)驗(yàn)板幾乎一樣大小，說(shuō)明嗜異性抗體未完全去除干凈，應(yīng)再用雞紅細(xì)胞進(jìn)展再吸附來(lái)去除之；如對(duì)照板所出現(xiàn)的溶血圈面積比實(shí)驗(yàn)板小2倍或以上，一般不影響對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷?！?〕瓊脂糖最好用高純度，低熔點(diǎn)，在有效期內(nèi)，新鮮配制的，配好后保存期不超過(guò)一個(gè)月，因保存期過(guò)長(zhǎng)，鋪板時(shí)易造成瓊脂板出現(xiàn)裂縫?！?〕一定要加1‰NaN3以防止細(xì)菌生長(zhǎng)，因細(xì)菌會(huì)造成非特異性溶血?！?0〕溫度一定要控制好，因補(bǔ)體不耐熱，操作補(bǔ)體時(shí)間盡量要縮短，并在4℃下操作；補(bǔ)體一定為≥〔11〕禽類血清不結(jié)合豚鼠補(bǔ)體，不應(yīng)用雞的抗血清作為陽(yáng)性對(duì)照血清。〔12〕如缺乏時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)展觀察和測(cè)量，可將實(shí)驗(yàn)板置4℃冰箱，至少一星期進(jìn)展測(cè)量不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；溶血板制備完后，平放帶濕度的盒中，置4三、A型流感病毒RT-PCR檢測(cè)〔一〕生物平安要求分裝標(biāo)本、裂解病毒需在BSL-2級(jí)實(shí)驗(yàn)室生物平安柜內(nèi)操作。核酸檢測(cè)區(qū)域要分出試劑配制、核酸提取、擴(kuò)增、檢測(cè)的不同分區(qū)?！捕持饕牧?．提RNAKit：QIAGENRNeasyMiniKit〔catalog*74104〕2．β－巰基乙醇〔SIGMAβ-MercaptoethanolLot062K0115〕3．70％乙醇4．RT-PCRKit：QIAGENOnestepRT-PCRKit〔catalog*210212〕5．PromegaRNasinRibonucleaseInhibitor〔catalog*N2111〕6．檢測(cè)引物：ForwordandReversePrimers〔均為10μM〕，序列如下：類型序列甲型通用FluA-M-F30FluA-M-R2645’-TTCTAACCGAGGTCGAAACG-3’5’-ACAAAGCGTCTACGCTGCAG-3’〔三〕實(shí)驗(yàn)步驟1．RNA提取〔1〕根據(jù)標(biāo)本數(shù)量分裝RLT液：從Kit中取出RLT液，用1.5mL離心管分裝，每管500μL〔在體系配制區(qū)操作〕?！?〕加標(biāo)本100ul到裂解液中?！?〕每管分別參加5μLβ-巰基乙醇，混勻后依次參加600μL70%的乙醇，充分混勻?！?〕從Kit中取出帶濾柱的2mL收集管，翻開(kāi)包裝將其做好標(biāo)記。取步驟2中的混合液600μL參加濾柱中，12000rpm，離心15s，棄收集管中的離心液?！?〕濾柱仍放回收集管上，將步驟2剩余的混合液全部吸入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄離心液。〔6〕于濾柱中參加700μLWashBufferRW1液，12000rpm，離心15s。〔7〕從QIAGENRNeasyMiniKit中取一支干凈的2mL收集管，將離心后的濾柱移到新的收集管上，于濾柱中參加500μLWashBufferRPE液，12000rpm，離心15s?！?〕棄收集管中的離心液，再于濾柱中參加500μLWashBufferRPE液，13000~14000rpm，離心2min?！?〕將濾柱移到一個(gè)干凈的1.5mLeppendorf管上，向?yàn)V柱中參加30~50μL的Rnase-freeWater，室溫靜置1~3min?！?0〕12000rpm，離心1min，收集離心液即為提取的病毒RNA，立即做實(shí)驗(yàn)或-20℃注意：BufferRPE使用之前加無(wú)水乙醇。2．反響體系配制〔1〕實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：檢測(cè)標(biāo)本RNA時(shí)，陰性對(duì)照用無(wú)菌水，陽(yáng)性對(duì)照用病毒RNA?！?〕PCR反響體系配制〔在體系配制區(qū)配反響液〕組分體積〔μL〕5×RT-PCRBuffer5×n10mMdNTPMi*ture1×nRT-PCREnzymeMi*1×nRNaseInhibitor0.1×n上游引物0.5×n下游引物0.5×nRNaseFreeWater11.9×nTotal20×n2〕將上述反響液混勻，分裝到0.2mLPCR小管中，每管20μL，分別做好標(biāo)記。3〕加RNA模板〔在核酸提取區(qū)〕將上述分裝好的PCR小管分別參加模板。首先參加陰性對(duì)照管〔5μL無(wú)菌水〕，然后分別加標(biāo)本RNA〔每管5μL〕，最后參加陽(yáng)性對(duì)照RNA〔每管5μL〕?！?〕RT-PCR將上述加好模板的反響管混勻，短暫離心后放入PCR儀進(jìn)展RT-PCR擴(kuò)增，反響程序如下：1〕60℃作用1min，2〕42℃作用10min，3〕4〕95℃作用15min，5〕94℃變性30s，6〕507〕72℃延伸1min，回到第5步，34個(gè)循環(huán)，8〕72℃9〕4℃〔4〕RT-PCR產(chǎn)物檢測(cè)：1〕將制備好的1.5％瓊脂糖凝膠入電泳槽〔帶梳子孔的一端在陰極〕，倒入電泳液〔1×TBE〕浸過(guò)膠面即可。2〕PCR產(chǎn)物各取10μL，參加2μL上樣緩沖液〔6×LoadingBuffer〕，混勻后參加電泳膠孔內(nèi)先加Marker〔DL－2000〕5μL，然后依次加標(biāo)本PCR產(chǎn)物，再加陰性對(duì)照，最后加陽(yáng)性對(duì)照產(chǎn)物〕。3〕觀察結(jié)果并用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。〔四〕結(jié)果判斷在系統(tǒng)成立，即陰陽(yáng)性參考均正常的條件下，判斷結(jié)果，陽(yáng)性各條帶為：甲型〔210bp〕出現(xiàn)特異性條帶，判為陽(yáng)性結(jié)果。未出現(xiàn)條帶，或不在上述位置出現(xiàn)非特異性條帶，均判為陰性結(jié)果。四、A型流感病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量〔Real-time〕RT-PCR技術(shù)，是指在RT-PCR反響體系中參加熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)RT-PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)展定量或定性分析的方法。如下是幾個(gè)在結(jié)果判斷中涉及到的幾個(gè)概念：圖1：Real-TimeRT-PCR反響標(biāo)準(zhǔn)曲線1．閾值〔threshold〕：PCR反響前15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光閾值的缺省設(shè)置是6～15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。2．基線〔baseline〕：指PCR反響指數(shù)擴(kuò)增前平均本底熒光信號(hào)值，通常取6～15