抗氧化酶活性等測(cè)定方法

一、試劑配置gESg);3、80%Percol:80ml原液+20ml水;40％Percol:40ml原液＋60ml水;PBS提取液2000ml(3個(gè)處理*2個(gè)品種＊3個(gè)重復(fù)＊20ml＊3次=1080ml),80％Percol200ml;40%Percol200ml。(3個(gè)處理*2個(gè)品種*3個(gè)重復(fù)*3ml＊3次=162ml)二、提取步驟21、10g鮮樣加20ml提取PBS(50mMMESPH6、1,含0、33M山梨糖醇,10mMNaCl,2mMMgCl,22mMEDTA,0.5mMKH2PO4,2mMASA—Na,ASA—Na使用前現(xiàn)配現(xiàn)加)2、快速研磨,使葉片碎成綠豆粒大小,4層紗布過濾,去除殘?jiān)?注意過濾時(shí)不可用力擠壓,以免葉綠體膜破碎)3、濾液2000g3min,小心倒出上清液,將離心管放入離心機(jī)后,使離心機(jī)得加速很快上升到預(yù)定值(水平轉(zhuǎn)頭,加速度調(diào)到9),約經(jīng)30s后很快使其下降停止,整個(gè)離心持續(xù)大約2—3min左右完成;4、沉淀用1ml提取液漂洗表面懸浮物;5、用1ml懸浮液(50mMHEPESpH7。6,含0、33mM山梨糖醇,10mMNaCl,2mMMgCl2,2mMEDTA,0。5mMKH2PO4,2mMASA－Na,ASA-Na使用前現(xiàn)配現(xiàn)加)將沉淀懸浮,在分散葉綠體時(shí)宜用毛筆輕輕刷,或者用手握住離心管在冰塊之間攪動(dòng),使葉綠體由于震動(dòng)分散開來,不要用棉球吸濾,以防被膜壓破。葉綠體懸浮時(shí)要濃點(diǎn),含葉綠素2mg、ml-1以上,這樣有利于保持活性。6、2000g1min;7、沉淀再用懸浮液懸浮;(懸浮液同5,可以不做)8、用Percol試劑進(jìn)行梯度離心(將3ml含有80％Percol(原液按100％算)鋪在10ml離心管下層,再把3ml40％Percol鋪在離心管中層,然后將1ml葉綠體懸浮液輕輕鋪在離心管上層)1500g2-3min(用水平離心頭得離心機(jī),離心機(jī)加速要緩慢上升,加速度調(diào)到1),下降也要緩慢下降,否則會(huì)破碎Percol得濃度梯度層得形成,取出會(huì)瞧到3層綠色帶,最上層為破碎得葉綠體,沉在地層得為粗顆粒,40－80％得Percol之間得界面有一層綠色層為完整得葉綠體;0%得丙酮,搖勻后于1000g離心2min,上清液置于1cm得比色杯,在625nm上比色,按照公式計(jì)算:OD625nm×50/34.5＝葉綠素mg/ml)10、測(cè)定葉綠體得完整性,完整率達(dá)到85-95%;nperoxideintheinactivationofCalv取上述制備得完整葉綠體進(jìn)行如下測(cè)定:抗氧化酶(SOD、POD、CAT、APX)活性測(cè)定方法一、超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定(氮藍(lán)四唑光化還原法)(1)0.05mol/L磷酸緩沖液(PBS,pH7。8):B母液:0.2mol／L磷酸二氫鈉溶液:取NaH2PO4·2H2O(分子量156.01)31.2g。參考文獻(xiàn):李合生主編:植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理與技術(shù)。高等教育出版社,2000:267~268。(2)14。5mM甲硫氨酸溶液:取2、1637gMet用磷酸緩沖液(pH7。8)定容至1000ml。(3)30μMEDTA－Na2溶液:取0。001gEDTA-Na2用磷酸緩沖液定容至100ml、(4)60μM核黃素溶液:取0、0023g核黃素用磷酸緩沖液定容至100ml,避光保存。(5)2。25mM氮藍(lán)四唑(NBT)溶液:取0。1840gNBT用PBS定容至100ml,避光保存。(上述試劑先配好,放到4度冰箱,用之前臨時(shí)按下面得方法配,然后放在4度冰箱中,不要在最上層,避免見光,第一組樣品加好后拿出來加,加完后放回冰箱,第二組得樣品加好后再拿出來加)酶液制備:取0。2g(可視情況調(diào)整)樣品(新鮮葉片或根系)洗凈后置于預(yù)冷得研缽中,加入1。6ml50mmol/L預(yù)冷得磷酸緩沖液(pH7、8)在冰浴上研磨成勻漿,轉(zhuǎn)入離心管中在4℃、12000g下離心20min,(1)反應(yīng)混合液配制(以60個(gè)樣為準(zhǔn)):分別取Met溶液162ml,EDTA－Na2溶液0.6ml(加得量與,磷酸緩沖液5、4ml,NBT溶液6ml,核黃素溶液6ml,混合后搖勻;SOD反應(yīng)混合液:3個(gè)處理*2個(gè)品種＊3次重復(fù)*3ml＊3次測(cè)定=162ml(實(shí)際配置200ml)(2)分別取3ml反應(yīng)混合液與30μl(可視情況調(diào)整,最好先做一個(gè)濃度梯度,瞧加多少合適,如果量太少,最好稀釋后再加,這樣精確)酶液于試管中(盡可能加到試管得底部,要靠著試管壁打下去先加酶液,后加反應(yīng)液,加好后搖一搖,瞧瞧試管上就是不就是有霧氣,最好拿紗布把試管下邊擦一下,免得霧氣擋住光線照過去);(3)將試管置于光照培養(yǎng)箱中在4000lux光照下反應(yīng)20min;(照光很重要,試管要選擇相同規(guī)格得,因?yàn)椴煌迷嚬芡腹饴示褪遣灰粯拥?試管架不要選擇遮光得,這個(gè)最好分組做,同時(shí)幾組做相互之間會(huì)遮光,每一組一個(gè)重復(fù),就就是每一組中都要有所有得處理,且都要有一個(gè)最大管,處理多得話,把根與葉分開做,最大管放在中間)同時(shí)做兩支對(duì)照管,其中1支試管取3ml反應(yīng)混合液加入30μlPBS(不加酶液)照光后測(cè)定作為最大光只加緩沖液置于暗中測(cè)定時(shí)用于調(diào)零。(4)以不照光得對(duì)照管(只有緩沖液并置于暗處)調(diào)零后,避光測(cè)OD560(出現(xiàn)顏色即可測(cè)定)。(5)酶活性計(jì)算:SOD活性單位以抑制NBT光化還原50％所需酶量(測(cè)得樣品值要在最大管得一半左SOD總活性＝[(Ack－AE)×V]／(1/2Ack×W×Vt)SOD比活力=SOD總活性/蛋白質(zhì)含量SOD總活性以鮮重酶單位每克表示(u/gFW);比活力單位以酶單位每毫克蛋白表示;Ack為照光對(duì)照管得吸光度;AE為樣品管得吸光度;V為樣品液總體積(ml,1、6ml,加入PBS得體積);Vt為測(cè)定時(shí)得酶液用量1、過氧化物酶(POD)活性測(cè)定(愈創(chuàng)木酚法))試劑配制:0、2mol/L磷酸緩沖液(pH6、0):分別取A母液(Na2HPO4)123ml與B母液(NaH2PO4)877ml混勻即為1000mlPBS(0。2M,pH6、0);(2)反應(yīng)混合液配制(以60個(gè)樣為準(zhǔn)):POD反應(yīng)混合液:3個(gè)處理＊2個(gè)品種＊3次重復(fù)＊3ml＊3次測(cè)定=162ml(實(shí)際配置200ml,0.076ml,)樣品測(cè)定:SOD測(cè)定前等待5秒,動(dòng)作要快,如果慢得話,要保證每個(gè)樣品從加好樣到開始記時(shí)得時(shí)間相差不大)(4)酶活性計(jì)算:以每minOD值變化(升高)0、01為1個(gè)酶活性單位(u)、POD=(ΔA470×Vt)/(W×Vs×0、01×t)(u/gmin)ΔA470:為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度得變化;W為樣品鮮重(g);t為反應(yīng)時(shí)間(min);Vt為提取酶液總體積(ml,(1.6ml);Vs為測(cè)定時(shí)取用酶液體積(ml,30ul)。)試劑配制:0、15mol／L磷酸緩沖液(pH7。0):取A母液(Na2HPO4)457、5ml與B母液(NaH2PO4)292。5ml混合后用蒸餾水定容至1000ml、(2)反應(yīng)液配制:取200mlPBS(0、15M,pH7.0),加入0、3092ml30%得H2O2(原液)搖勻即可。CAT反應(yīng)液:3個(gè)處理*2個(gè)品種＊3次重復(fù)*3ml*3次測(cè)定=162ml(實(shí)際配置200ml,0、3092ml)(3)樣品測(cè)定:取3ml反應(yīng)液加入0.1ml(可視情況調(diào)整)酶液,以PBS為對(duì)照調(diào)零,測(cè)定OD240(紫(4)酶活性計(jì)算:以每minOD值減少0。01為1個(gè)酶活性單位(u)、CAT=[ΔA240×Vt]/(W×Vs×0。01×t)(u／gmin)ΔA240:為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度得變化;W為樣品鮮重(g);t為反應(yīng)時(shí)間(min);Vt為提取酶液總體積(ml,、6ml);Vs為測(cè)定時(shí)取用酶液體積(ml,0。1ml)。1、試劑配制(按50個(gè)樣計(jì)算):(1)0。05mol/LK2HPO4-KH2PO4緩沖液(pH7。0)得配制:(2)0、1mMEDTA－Na2:取0、01861gEDTA-Na2用PBS溶液定容到500ml(372、24(3)5mMAsA:取0。044g抗壞血酸用PBS溶液定容到50ml(現(xiàn)用現(xiàn)配,176.13g/M5mM×50ml=0.0g／M×0、5L)＝9、703M)、實(shí)際配置ml,0。009305g)5mM得AsA:3個(gè)處理＊2個(gè)品種*3次重復(fù)＊0。1ml＊3次測(cè)定=5。4ml;(實(shí)際配置50ml,0。2、酶活性得測(cè)定(以2ml體系測(cè)定)(1)取0、10ml酶液(可視情況調(diào)整),加入1。70ml含0。1mMEDTA－Na2得PBS(0、05mol／L,pH7。0),再加入0。10ml5mM得AsA,最后加入0、10ml20mMH2O2,立即在20℃下測(cè)定D290(紫外)值在40s內(nèi)(測(cè)定時(shí)間內(nèi)變化大可測(cè)定得時(shí)間短點(diǎn),否則長點(diǎn))得變化,計(jì)算單位時(shí)間內(nèi)AsA減少量與酶活性(室溫下測(cè)定,緩沖液調(diào)零)。計(jì)算公式: △OD/△t×Vr×VTA×d×Vt×W△OD為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度得變化(40秒吸光度－0秒吸光度);△t為反應(yīng)時(shí)間(40秒);Vr為反應(yīng)液體積(2mL);VT提取液體積(1。6mL);A為消光系數(shù)(2、8mM-1.cm-1);d為比色杯厚度(1cm);Vt測(cè)定液體積(0。(1)1mM鹽酸羥胺溶液:稱取0.02085g鹽酸羥胺用蒸餾水定容至300ml;溶解后定容至400ml;實(shí)際配置1mM鹽酸羥胺溶液:3個(gè)處理＊2個(gè)品種＊3次重復(fù)＊1ml*3次測(cè)定＝54ml;(實(shí)際配置100ml,0.00695g)17mM對(duì)氨基苯磺酸:3個(gè)處理＊2個(gè)品種*3次重復(fù)＊1ml＊3次測(cè)定=54ml;(實(shí)際配置100ml,0。2944g)7mMα-萘胺溶液:3個(gè)處理＊2個(gè)品種＊3次重復(fù)＊1ml＊3次測(cè)定=54ml;(實(shí)際配置1002(1)樣品液提取方法同SOD測(cè)定;(2)取0。5ml提取液(酶液)(可視情況調(diào)整用量)中加入0.5mlPBS(0。05M,pH7。8),1ml1mM鹽酸羥;(4)依次先加入1ml17mM對(duì)氨基苯磺酸,再加入1ml7mMα-萘胺,混合后快速搖勻;(7)O2?！康糜?jì)算:由測(cè)得得OD530,查NO2－標(biāo)準(zhǔn)曲線得到[NO2－];根據(jù)羥胺與O2、—得反應(yīng)式:NHNOO得時(shí)間與樣品中得蛋白質(zhì)含量,求得O2.-產(chǎn)生速率(以nmolmin-1mg—1蛋白表示,也可以nmolmin－1g-1鮮重表示)。O2。—產(chǎn)生速率＝(C×V)/(t×W)(nmolmin-1g—1鮮重)C為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得得濃度(umol/L);V為測(cè)定時(shí)所取提取液用量(葉綠體稀釋后得體積);t為反應(yīng)時(shí)間(60min);W為樣品鮮重(葉綠體實(shí)際質(zhì)量g)(1)考馬斯亮藍(lán)溶液配制:稱取100mg考馬斯亮藍(lán),溶于50ml90％乙醇中,加入100ml85%(W/V)得磷酸,再用蒸餾水定容到1L。在過夜后過濾并貯于棕色瓶中,常溫下可在暗中保存一個(gè)月、(2)100μg/ml牛血清蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)溶液:稱取25mgBSA加水溶解后定容至100ml,再從中吸取40ml用蒸餾水定容至100ml(也可取10mgBSA定容至100ml即為100μg／ml標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液)、實(shí)際配置0、05M,pH7。8磷酸緩沖液:3個(gè)處理*2個(gè)品種＊3次重復(fù)＊0.08ml*3次測(cè)定＝0、3456ml;(實(shí)際配置100ml,)考馬斯亮藍(lán)溶液:3個(gè)處理*2個(gè)品種＊3次重復(fù)＊2。9ml＊3次測(cè)定=156。6ml;(實(shí)際配置200ml提取液),再加入2。9ml考馬斯亮藍(lán)溶液,反應(yīng)2min后測(cè)OD595(以100μl緩沖液加2。9ml考馬斯亮藍(lán)為對(duì)照調(diào)零)。(2)蛋白質(zhì)含量計(jì)算:可溶性蛋白質(zhì)含量(mg/g)=(C×VT)／(W×VS×1000)C為標(biāo)準(zhǔn)曲線查得得蛋白質(zhì)含量(μg);VT為提取液總體積(稀釋后得體積ml);VS為測(cè)定時(shí)所用提取液體積(ml,20μl);W為樣品鮮重(g)、一、試劑配制:1、0。2mol/LHClO4:取10.05gHClO4溶解于0。5L得水中;2、4mol/LKOH:取112gKOH溶解于0.5L得水中;3、0、1mol/L,pH6、5得磷酸緩沖液:Na2HPO4·12H2O5、6407g+NaH2PO4·2H2O5、3433g用去4、顯色液:100mL、0。1mol/L、pH6。5得磷酸緩沖液+25μLN,N－二甲基苯胺+10mg4－氨基氨替吡啉;5、過氧化物酶溶液(250U／mL)二、測(cè)定步驟:gmLmolLHClO浴勻漿,于10000×g離心5min(4℃),取上清液,加4mol／LKOH調(diào)pH值為7.5后,再于10000×g離心5min(4℃),取上清液1mL,加0。4mL顯色液與0.1mL過氧化物酶溶液(250U/mL),用島津UV－1601分光光度計(jì)測(cè)定波長550nm(可見)處光密度值得變化,H2O2含量以μmol/gFW表示、(用什么調(diào)零?)三、計(jì)算方法:(要做標(biāo)線?)HOUchida改進(jìn)、(1)1mMGSH標(biāo)準(zhǔn)液10mL(現(xiàn)用現(xiàn)配):稱3。0733mgGSH,加蒸餾水至10mL。(不要)(2)5％磺基水楊酸500mL:25g溶于500mL水中。(3)6mMDTNB:稱取0．118905gDTNB溶于50mLPBS(0。1M,pH7、5)中。(4)2mMNADPH:18.1mgNADPH溶于10mLPBS中、(5)1mMGSSG標(biāo)準(zhǔn)液10mL:6.126mgGSSG加PBS至10mL、(不要)實(shí)際配置0.1MPBS(pH7.5):3個(gè)處理＊2個(gè)品種＊3次重復(fù)*0.5ml＊3次測(cè)定=27ml;(實(shí)際配置50ml)6mMDTNB:3個(gè)處理*2個(gè)品種*3次重復(fù)*0、2ml*3次測(cè)定＝10、8ml;(實(shí)際配置50ml,實(shí)際用量0。1189g)(1U)GRⅢ:3個(gè)處理＊2個(gè)品種＊3次重復(fù)＊0、1ml＊3次測(cè)定=5。4ml;(實(shí)際配置50ml,實(shí)際用量10ml)5%磺基水楊酸:3個(gè)處理＊2個(gè)品種＊3次重復(fù)＊0。01ml＊3次測(cè)定＝0。54ml;(實(shí)際配置10ml)(實(shí)際用量0、5g/10ml)0．5mMPBS:3個(gè)處理＊2個(gè)品種*3次重復(fù)*1.5ml*3次測(cè)定=81ml;(實(shí)際配置100ml)乙醚(二乙醚):3個(gè)處理＊2個(gè)品種＊3次重復(fù)＊10ml*3次測(cè)定=540ml;(實(shí)際配置1000ml)PBSBuffer0。5mM:3個(gè)處理＊2個(gè)品種＊3次重復(fù)＊1。5ml＊3次測(cè)定=81ml;(實(shí)際配置2—乙烯吡啶:3個(gè)處理*2個(gè)品種＊3次重復(fù)*0、2ml*3次測(cè)定=10.8ml;(實(shí)際用量20ml)乙醚:3個(gè)處理*2個(gè)品種*3次重復(fù)＊10ml＊3次測(cè)定=540ml;(實(shí)際用量1000ml)配制濃度為0,0.02mM,0.04mM,0.06mM,0.08mM,0．1mM,0.12mM得標(biāo)準(zhǔn)GSH溶液(吸取上述mLmMNADPHmLUGRsigma從0。1mLGSH啟動(dòng)反應(yīng),測(cè)定650s得A412(OD412),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以PBS代替DTNB作空白。(1)取1g新鮮葉片,加入10μL(可以取0．2g鮮樣,加1、6ml提取液)5%磺基水楊酸,研磨后在1400次(雜質(zhì)會(huì)融到乙醚層中,而乙醚處于整個(gè)反應(yīng)體系得上層,您直接用槍吸取上層乙醚丟棄即可,反復(fù)進(jìn)行兩次即為抽取兩次),此提取液用于分析總谷胱苷肽含量。各取1mL上清液,加入1.5mLPBSBuffer0。5mM(pH7.5),0.2mL2—乙烯吡啶(原裝試劑濃度)混合至乳膠狀,在25℃反應(yīng)1小時(shí),再用5mL乙醚(原裝試劑濃度)抽提2次,此提取液用于分析GSSGGSH即總得谷胱甘肽含量,然后減去氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量得到還原型谷胱甘肽含量(GSH))(2)取反應(yīng)混合液(0、5mL0.1MPBS(pH7、5)(內(nèi)含5mMEDTA),0。2mL6mMDTNB,0、1mL2mMNADPH,0、1mL(1U)GRⅢ(sigma),由加入0。1ml提取液開始反應(yīng),測(cè)OD412,在25℃下,反應(yīng)