傳染病暴發(fā)疫情應(yīng)急檢測

傳染病暴發(fā)疫情

應(yīng)急檢測現(xiàn)在是1頁\一共有70頁\編輯于星期四一、實(shí)驗(yàn)室檢測在傳染病疫情中的作用公共衛(wèi)生疾病預(yù)防控制體系應(yīng)急反應(yīng)體系醫(yī)療救助體系衛(wèi)生監(jiān)督執(zhí)法體系四個體系教育培訓(xùn)人才隊(duì)伍公共衛(wèi)生立法運(yùn)行保障科研工作依托——國家突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急預(yù)案現(xiàn)在是2頁\一共有70頁\編輯于星期四一、實(shí)驗(yàn)室檢測在傳染病疫情中的作用傳染病暴發(fā)疫情處置流程現(xiàn)在是3頁\一共有70頁\編輯于星期四一、實(shí)驗(yàn)室檢測在傳染病疫情中的作用現(xiàn)在是4頁\一共有70頁\編輯于星期四傳染病疫情的核實(shí)、處置、總結(jié)評價等方面離不開實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果的支持。如傳染病的診斷應(yīng)包括流行病資料、臨床病史、體格檢查和實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果等，再者病原體的檢出是確診傳染病的主要依據(jù)。一、實(shí)驗(yàn)室檢測在傳染病疫情中的作用現(xiàn)在是5頁\一共有70頁\編輯于星期四二、標(biāo)本采集與運(yùn)輸臨床標(biāo)本的采集可以分為：用于病原分離或檢測抗原用的標(biāo)本，包括糞便、咽拭子、痰液、尿液、血液、腦脊液等；用于病原抗體檢測的標(biāo)本，通常包括急性期和恢復(fù)期血清、腦脊液。尸體標(biāo)本：采集有病理變化的臟器或組織。注意無菌操作，盡量避免污染。現(xiàn)在是6頁\一共有70頁\編輯于星期四

1.糞便標(biāo)本采集病人發(fā)病7日內(nèi)的糞便標(biāo)本用于病原檢測。糞便標(biāo)本采集量5～8g/份，采集后立即放入無菌采便管內(nèi)并密封，4℃暫存立即(12h內(nèi))送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標(biāo)本存于－70℃冰箱。（一）標(biāo)本采集現(xiàn)在是7頁\一共有70頁\編輯于星期四

2.肛拭子

采集病人發(fā)病7日內(nèi)的肛拭子標(biāo)本用于病原檢測。用采樣棉簽沾取少量生理鹽水，適度用力插入患者肛門，同一方向旋轉(zhuǎn)采樣棉簽，取出棉簽放入裝有3～5ml保存液（維持液、或生理鹽水，推薦使用維持液）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封?，F(xiàn)在是8頁\一共有70頁\編輯于星期四

3.咽拭子

采集病人發(fā)病3日內(nèi)的咽拭子標(biāo)本，用于病原檢測。用專用采樣棉簽,適度用力拭抹咽后壁和兩側(cè)扁桃體部位,應(yīng)避免觸及舌部;迅速將棉簽放入裝有3～5ml保存液（維持液或生理鹽水）的采樣管中,在靠近頂端處折斷棉簽桿,旋緊管蓋并密封?，F(xiàn)在是9頁\一共有70頁\編輯于星期四

4.皰疹液局部皮膚消毒后(建議使用75%酒精,不能使用碘酒),用消毒針將皰疹挑破用棉簽蘸取皰疹液，迅速將棉簽放入內(nèi)裝3～5ml病毒保存液（維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封?？赏瑫r采集同一病例的多個皰疹作為一份標(biāo)本?，F(xiàn)在是10頁\一共有70頁\編輯于星期四5.血液樣本的采集：作血液病原培養(yǎng)、核酸檢測時,嚴(yán)格用無菌穿刺法采靜脈血，移入無菌的有螺口的抗凝的容器或培養(yǎng)瓶中送檢。6.血清標(biāo)本：采集急性期(發(fā)病0～5d)和恢復(fù)期(發(fā)病14～30d)雙份配對血清用于抗體檢測。檢測IgM時,采集(發(fā)病7～20d)血。靜脈采集3～5ml全血,置于真空無菌采血管中,自凝后,離心分離血清于無菌帶墊圈的血清管中,旋緊管蓋并密封?，F(xiàn)在是11頁\一共有70頁\編輯于星期四7.腦脊液標(biāo)本：出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的病例,要采集腦脊液標(biāo)本,進(jìn)行病原和抗體檢測。采集時間為出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀后3日內(nèi),采集量為1.0～2.0ml。采集后立即裝入無菌帶墊圈的血清管中,旋緊管蓋并密封。8.尿液采集：中段尿采集法，先用肥皂水清洗外陰部，再以無菌水洗凈，一般取首次晨尿的中段尿10～20ml于無菌試管內(nèi)。

現(xiàn)在是12頁\一共有70頁\編輯于星期四9.尸體標(biāo)本的采集：取尸體標(biāo)本時每個標(biāo)本用單獨(dú)的無菌活檢針至少取1～2g感染部位標(biāo)本，放入單獨(dú)的裝有相應(yīng)培養(yǎng)基的無菌容器中。現(xiàn)在是13頁\一共有70頁\編輯于星期四（二）標(biāo)本運(yùn)輸所有采集標(biāo)本4℃暫存立即（12h內(nèi)）送達(dá)實(shí)驗(yàn)室,如不能立即運(yùn)送，用于細(xì)菌分離培養(yǎng)4℃保藏，病毒分離－20℃以下低溫冷凍保藏。臨床標(biāo)本在運(yùn)輸和貯存過程中要避免反復(fù)凍融,如果不能確保－20℃的條件，應(yīng)該在0～8℃運(yùn)輸和保存。標(biāo)本運(yùn)輸時要附有采送樣登記表，包含必要信息,如標(biāo)本編號,發(fā)病日期和標(biāo)本采集日期等。現(xiàn)在是14頁\一共有70頁\編輯于星期四三、現(xiàn)場快速微生物檢查方法直接從臨床標(biāo)本中檢查微生物抗原檢查某些細(xì)菌的專有酶進(jìn)行快速鑒定快速檢測細(xì)菌生化反應(yīng)的色原或熒光底物及成套鑒定系統(tǒng)應(yīng)用不同載體的快速凝集試劑檢查與鑒定微生物快速檢出細(xì)菌的毒素微生物快速檢測儀器

現(xiàn)在是15頁\一共有70頁\編輯于星期四三、現(xiàn)場快速微生物檢查方法

炭疽桿菌抗原檢、抗體測試劑（膠體金法）土拉熱菌抗原、抗體檢測試劑（膠體金法）鼠疫菌抗原、抗體檢測試劑（膠體金法）布魯氏菌抗原、抗體檢測試劑（膠體金法）A型肉毒毒素檢測試劑（膠體金法）B型葡萄球菌腸毒素檢測試劑（膠體金法）沙眼衣原體、肺炎支原體、出血熱等快速檢測試劑優(yōu)點(diǎn)：檢測速度快缺點(diǎn)：假陽性率高現(xiàn)在是16頁\一共有70頁\編輯于星期四三、現(xiàn)場快速微生物檢查方法直接涂片染色后鏡檢適用于形態(tài)和染色上具有特征性的病原菌。例如痰中查見抗酸性細(xì)長桿菌，膿液中發(fā)現(xiàn)革蘭氏陽性葡萄串狀球菌，咽喉假膜中有異染顆粒的棒狀桿菌及霍亂弧菌、艱難梭菌等。優(yōu)點(diǎn)是方便快捷，缺點(diǎn)是適用范圍小?，F(xiàn)在是17頁\一共有70頁\編輯于星期四四、實(shí)驗(yàn)室檢測方法1.病原分離細(xì)菌的分離培養(yǎng)有正常菌群存在部位所取標(biāo)本（如糞便），應(yīng)接種至選擇或鑒別性培養(yǎng)基。無菌部位采集的腦脊液、血液等標(biāo)本，可直接接種至營養(yǎng)豐富的液體或固體培養(yǎng)基。現(xiàn)在是18頁\一共有70頁\編輯于星期四細(xì)菌的鑒定生化鑒定：生化代謝特征是鑒定病原菌的重要方法之一，如糖發(fā)酵試驗(yàn)；現(xiàn)有多種微量、快速、半自動或全自動細(xì)菌生化反應(yīng)試劑盒和檢測儀器,極大方便了菌株鑒定工作.血清鑒定與分型：利用已知的特異抗體的診斷血清可以確定細(xì)菌的種和型。常用方法是玻片凝集實(shí)驗(yàn)，在數(shù)分鐘內(nèi)能可得出結(jié)果?，F(xiàn)在是19頁\一共有70頁\編輯于星期四缺點(diǎn)：耗時長（需48～72h），過程繁瑣。優(yōu)點(diǎn)：能獲得病原菌，特異性為100%，是許多細(xì)菌性傳染病實(shí)驗(yàn)室確診的最重要證據(jù)。因此，在暴發(fā)疫情中要求盡可能進(jìn)行病原菌分離來獲得實(shí)驗(yàn)室確診證據(jù)?，F(xiàn)在是20頁\一共有70頁\編輯于星期四病毒分離培養(yǎng)雞胚培養(yǎng)動物接種組織培養(yǎng)現(xiàn)在是21頁\一共有70頁\編輯于星期四病毒分離（細(xì)胞）

鑒定的一般流程PCRRT-PCR/sequencingTaqManRT-PCRDNAmicroarrayNASBALAMP……結(jié)果判定接種細(xì)胞陰性結(jié)果判定標(biāo)本采集細(xì)胞病變病變觀察(連續(xù)3代)標(biāo)本處理細(xì)胞無病變ELISA檢測免疫熒光中和試驗(yàn)血凝及抑止試驗(yàn)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)...血清學(xué)鑒定分子生物學(xué)鑒定蚊蟲標(biāo)本、血清、CSF、尸檢組織標(biāo)本鑒定現(xiàn)在是22頁\一共有70頁\編輯于星期四病毒形態(tài)學(xué)鑒定觀察CPE，常見的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化為細(xì)胞變圓、壞死、溶解、脫落或形成合胞體。有些病毒能形成包涵體。正常細(xì)胞病變細(xì)胞現(xiàn)在是23頁\一共有70頁\編輯于星期四A：正常Hep-2細(xì)胞；

B：發(fā)生CPE后的Hep-2細(xì)胞；C：正常RD細(xì)胞；

D：發(fā)生CPE后的RD

細(xì)胞現(xiàn)在是24頁\一共有70頁\編輯于星期四2.核酸檢測

RT-PCR檢測方法

聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。能在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。PCR技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉和里程碑。現(xiàn)在是25頁\一共有70頁\編輯于星期四PCR技術(shù)簡史PCR的最早設(shè)想核酸研究已有100多年的歷史。1971年Korana最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想。1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。PCR的改進(jìn)與完善DNA聚合酶：大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段T4DNA聚合酶耐熱DNA聚合酶(一株水生嗜熱桿菌中提取)PCR儀現(xiàn)在是26頁\一共有70頁\編輯于星期四用途廣泛：生命學(xué)科醫(yī)學(xué)工程遺傳工程疾病診斷法醫(yī)學(xué)考古學(xué)Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎現(xiàn)在是27頁\一共有70頁\編輯于星期四RT-PCR基本原理逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴(kuò)增現(xiàn)在是28頁\一共有70頁\編輯于星期四提取核酸模板（病毒RNA模板為例）RNA提取試劑盒方法試劑準(zhǔn)備(按照試劑盒說明書操作)：aCarrierRNA儲存液配制：CarrierRNA凍干粉溶解于無RNA酶水中，儲存液的濃度一般為1ug/uL，并進(jìn)行分裝，避免反復(fù)凍融。bCarrierRNA工作液配置：根據(jù)樣品的數(shù)量計算所需裂解液RL和CarrierRNA溶液的體積，將裂解液RL與CarrierRNA溶液顛倒混勻，即得到CarrierRNA工作液。最好現(xiàn)用現(xiàn)配，工作液2-8℃保存不超過48小時。c緩沖液GD、漂洗液RW為濃縮液，第一次使用前加入無水乙醇（試劑瓶上標(biāo)注的量）混勻，室溫可儲存1年。現(xiàn)在是29頁\一共有70頁\編輯于星期四提取病毒RNA模板：吸取560μl含有CarrierRNA的RL到1.5mlEp離心管中。加140μl1標(biāo)本到上述離心管中，回旋振蕩15秒。室溫（15～25℃）孵育10min。短暫離心一次。加560μl乙醇（96～100％）到離心管中，蓋上離心管帽，回旋振蕩15秒。短暫離心一次。從離心管中吸取630μl溶液至Rnase-free吸附柱CR2中，6000g（8000rpm）離心1min。棄掉濾液，將套管套回原吸附柱中。加500μl緩沖液GD，6000g（8000rpm）離心1min。棄掉濾液，將套管套回原吸附柱中。加500μl漂洗液RW，6000g（8000rpm）離心1min。棄掉濾液，將套管套回原吸附柱中。13400g（12000rpm）離心3min。棄掉濾液，將套管套回原吸附柱中。打開吸附柱蓋子，室溫放置3min，使吸附膜完全變干。將吸附柱放入一個新的1.5ml無RNA酶離心管中，加入60μlRnase－freeddH2O，蓋上蓋子，在室溫孵育5min，6000g（8000rpm）離心1min。提取的病毒RNA模板可立即進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，或貯存于－70℃?zhèn)溆谩，F(xiàn)在是30頁\一共有70頁\編輯于星期四全自動核酸提取簡介現(xiàn)在是31頁\一共有70頁\編輯于星期四現(xiàn)在是32頁\一共有70頁\編輯于星期四現(xiàn)在是33頁\一共有70頁\編輯于星期四現(xiàn)在是34頁\一共有70頁\編輯于星期四現(xiàn)在是35頁\一共有70頁\編輯于星期四現(xiàn)在是36頁\一共有70頁\編輯于星期四RT－PCR反應(yīng)條件:50℃40分鐘；94℃5分鐘；94℃30秒，50℃40秒，65℃50秒，35個循環(huán)；65℃10分鐘。（總時間約170分鐘）現(xiàn)在是37頁\一共有70頁\編輯于星期四電泳分析結(jié)果用1×TAE配制２%的瓊脂糖凝膠，加熱融解后，加入GOLDVIEW(５ｕＬ/100mL),待凝膠冷卻至50～70℃左右，倒入膠槽，等膠凝固后放在電泳裝置上；在帕拉膜（Parafilm）上加上6×電泳載樣緩沖液（每個反應(yīng)需1μl）。再加上5μl的PCR反應(yīng)產(chǎn)物與之混合；將電泳緩沖液倒在電泳裝置中，用吸尖將樣品與載樣緩沖液的混合溶液加到孔中；蓋上蓋子，接通電源，以5V/cm電壓（恒定電壓）電泳，大約35-40min，直到溴酚藍(lán)跑到凝膠的底部的時候，停止電泳；現(xiàn)在是38頁\一共有70頁\編輯于星期四5.在紫外透射儀下觀察PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，并照相作記錄?，F(xiàn)在是39頁\一共有70頁\編輯于星期四RT-PCR質(zhì)量控制提取RNA：選擇一個EV71陽性標(biāo)本同時提取作對照；PCR擴(kuò)增：選擇至少一個EV71陽性標(biāo)本RNA同時擴(kuò)增作對照；電泳分析：選擇合適的Marker（500～1000bp)現(xiàn)在是40頁\一共有70頁\編輯于星期四實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)實(shí)時熒光定量PCR定義：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實(shí)現(xiàn)了實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，對起始模板進(jìn)行定量分析的方法?，F(xiàn)在是41頁\一共有70頁\編輯于星期四分類(DNA產(chǎn)物的熒光標(biāo)記)：

非特異性熒光標(biāo)記：

1、SYBRGreen

特異性熒光標(biāo)記：

2、TaqMan

3、分子信標(biāo)

(MolecularBeacon)現(xiàn)在是42頁\一共有70頁\編輯于星期四TaqMan---水解型雜交探針

5′端標(biāo)記有報告基團(tuán)(Reporter,R)，如FAM、VIC等；

3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)；探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光；

Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針?，F(xiàn)在是43頁\一共有70頁\編輯于星期四TaqMan法工作原理現(xiàn)在是44頁\一共有70頁\編輯于星期四TaqManPCR體系的構(gòu)成：引物、TaqMan探針、dNTPs、Taq聚合酶、模板、相應(yīng)的緩沖體系等?，F(xiàn)在是45頁\一共有70頁\編輯于星期四典型的RealtimePCR四階段:

現(xiàn)在是46頁\一共有70頁\編輯于星期四熒光閾值(threshold)設(shè)定:threshold=10×SD(cycle6-15)現(xiàn)在是47頁\一共有70頁\編輯于星期四Ct值：

C代表Cycle,t代表threshold,即每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。現(xiàn)在是48頁\一共有70頁\編輯于星期四熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:現(xiàn)在是49頁\一共有70頁\編輯于星期四結(jié)果分析條件設(shè)定和結(jié)果判斷:對照結(jié)果：陰性對照應(yīng)為陰性；陽性對照應(yīng)為陽性；Ct值無數(shù)值的（與陰性對照應(yīng)一致）標(biāo)本為陰性樣本；Ct值≤35.0的樣本為陽性；Ct值≥35.0的樣本建議重做。重做結(jié)果無數(shù)值者為陰性，否則為陽性?，F(xiàn)在是50頁\一共有70頁\編輯于星期四熒光PCR特點(diǎn)靈敏度高特異性強(qiáng)全封閉PCR過程，無需后處理，降低污染機(jī)會。即時反映擴(kuò)增過程，更適用于定量?？蓪?shí)現(xiàn)一管多檢（如：雙通道、三通道檢測）儀器自動分析，更快獲得結(jié)果。探針設(shè)計有一定難度，較難達(dá)到一管多檢的要求。出現(xiàn)污染，更難處理。現(xiàn)在是51頁\一共有70頁\編輯于星期四3.血清學(xué)方法ELISA－酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)底物（TMB）酶標(biāo)二抗病毒特異性抗體病毒分離物（抗原）

ELISA用于檢測病毒分離物，既可以鑒定病毒種類，也可以鑒定出病毒的血清學(xué)亞類。本方法的特異性和敏感性都比較高，而且適用于大量的樣本檢測，這對于新分離病毒的初步鑒定工作具有非常重要的意義?，F(xiàn)在是52頁\一共有70頁\編輯于星期四TypesofELISA:DirectELISA;IndirectELISA;Sandwich/CaptureELISAABasicELISACoatingantigenBlockremainingbindingsitesWashoutexcessreagentAddingsamplesAddingsubstrateReadingPrintingresultsAddingsecondaryantibody現(xiàn)在是53頁\一共有70頁\編輯于星期四注意事項(xiàng)待檢病毒分離物在檢測前需要56℃，30分鐘進(jìn)行滅活；所有使用的抗體在－20℃條件保存，若短期內(nèi)（1～2周）經(jīng)常使用，可暫儲存于4℃，避免反復(fù)凍融；加樣時，按規(guī)定的量加到微孔板孔的下1/3處，應(yīng)避免濺出和產(chǎn)生氣泡；加每份標(biāo)本應(yīng)更換吸頭，避免交叉污染；溫育時，最好使用水浴法或濕盒法，避免產(chǎn)生邊緣效應(yīng)；微孔板不可疊加放置；測OD值前將微孔板底部的水吸干，避免OD值出現(xiàn)負(fù)值或損壞濾光片；移液槍的加樣誤差一般應(yīng)在±10％以內(nèi)；水浴箱允許有±1℃的誤差；洗板機(jī)洗板后的殘液量一般不超過2μL，達(dá)到人工扣板不濕即可；酶標(biāo)儀經(jīng)常維護(hù)光學(xué)部分，防止霉變，并且定期檢測校正；ELISA鑒定病毒的程度依賴于抗體的特異性程度病毒組特異性抗體——病毒屬/組病毒特異性多克隆抗體——病毒種（易受血清學(xué)交叉反應(yīng)影響）病毒特異性單克隆抗體——病毒種類病毒血清型特異性抗體——病毒種類及血清型別現(xiàn)在是54頁\一共有70頁\編輯于星期四IFA－免疫熒光技術(shù)

免疫熒光技術(shù)于1942年發(fā)明，該技術(shù)在醫(yī)學(xué)和微生物學(xué)研究中的應(yīng)用越來越廣泛。間接免疫熒光法具有安全、快速、簡便、結(jié)果直觀、敏感性和特異性較高等優(yōu)點(diǎn)，它同樣可以檢測病毒種類和亞類。IFA檢測病毒分離物示意圖FITC標(biāo)記的抗IgG抗體特異性病毒抗體細(xì)胞內(nèi)的病毒現(xiàn)在是55頁\一共有70頁\編輯于星期四IFA鑒定病毒的程度依賴于抗體的特異性程度現(xiàn)在是56頁\一共有70頁\編輯于星期四注意事項(xiàng)：制片時感染病毒的細(xì)胞生長不宜過密，在試驗(yàn)操作過程中，切勿損傷細(xì)胞；每次試驗(yàn)必須設(shè)立嚴(yán)格對照；不要正對著抗原片的孔沖洗，以免將細(xì)胞沖落；熒光標(biāo)記抗體的濃度要合適，過高會造成非特異性熒光；熒光染色標(biāo)本完成封片后，應(yīng)立即鏡檢，若沒有立即鏡檢的條件,或要保留備查,應(yīng)將標(biāo)本置于4℃、密閉、避光等；觀察熒光時，要將細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征和特異熒光的強(qiáng)度結(jié)合起來綜合判斷，不可偏廢；現(xiàn)在是57頁\一共有70頁\編輯于星期四中和試驗(yàn)

中和試驗(yàn)是病毒在活體內(nèi)或細(xì)胞培養(yǎng)中被特異性抗體中和而失去感染性的一種試驗(yàn)。中和抗體是作用于病毒表面抗原(衣殼或包膜)的抗體，同種不同型病毒間一般無交叉，特異性高，而且抗體在體內(nèi)維持時間長。中和抗體陽性不一定表示正在感染中，也可能因以前有過隱性感染所致。因此，中和試驗(yàn)適用于人群免疫情況的調(diào)查，在臨床診斷上較少使用?，F(xiàn)在是58頁\一共有70頁\編輯于星期四未知病毒的鑒定過程與方法現(xiàn)場流行病學(xué)提出病原學(xué)假設(shè)病毒類細(xì)菌類寄生蟲類。。。標(biāo)本采集病原分離光鏡電鏡免疫學(xué)方法分子生