基因組序列的功能解析

基因組序列的功能解析第1頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)在基因組中識別基因一、識別候選基因1.生物信息分析基因的序列特征雙鏈DNA有6個ORFs閱讀方式（1）開放閱讀框架

(ORF，openreadingframe)從起始密碼至終止密碼第2頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四（2）ORF的平均長度大腸桿菌：317個密碼,酵母菌：483個密碼,人：約450個密碼.在原核生物中直接尋找ORF有效。在真核生物中不能直接尋找ORF。第3頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四在真核生物中不能直接尋找ORF的原因：●62%的人類基因被間隔開●有內含子，斷裂基因●許多外顯子短于100個密碼，甚至有些少于50個密碼第4頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四（3）對ORF掃描軟件的修正1）密碼偏愛在某種生物中并不是所有密碼都被均等使用。2）外顯子-內含子邊界3）上游調控序列:CpG島:40–50%的人類基因和脊椎動物基因中，5’上游的GC含量高第5頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四4）尋找同源序列到其他模式生物中尋找同源序列。如果模式生物的同源序列已經被鑒定為某個功能基因的話…..主要用途是對新序列進行功能分析.第6頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四2.通過實驗技術識別基因

檢測是否轉錄RNA分子.起始密碼上游的數10個堿基，終止密碼下游的上百個堿基.包括：第7頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四（1）核酸雜交實驗1）Northernblotting選擇性剪接或者多基因家族都能產生多個RNA轉錄物mRNA一般都是從一個組織或器官中得到的第8頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四2）zoo-blot(gardenblot）用Southernblot把一個物種的DNA片斷與相關的其他物種的編碼基因DNA雜交Probesample第9頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四（2）cDNA測序（3）PCR技術從cDNA文庫（cDNAlibrary）中篩選。1）RT-PCR(reversetranscriptasePCR)2）RACE(rapidamplificationofcDNAends)第10頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四RACE第11頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四（3）尋找外顯子-內含子邊界.1）mRNA-DNA雜交2）外顯子捕獲需要特殊的載體第12頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四二、確定某個基因的功能1.生物信息學分析預測基因功能通過生物信息學分析和實驗研究

.同源性查詢:原理：功能相似的基因具有相似的序列（1）序列同源性反映了共同祖先的進化關系直系同源體（Orthologous）:來自不同的物種的同源基因旁系同源體（Paraloguos）:來自同一個生物的同源基因第13頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四（2）同源性分析揭示基因或片斷的功能可以分析DNA序列，但一般需要把DNA轉化成氨基酸序列進行分析。核酸序列76%相同(偶然事件)氨基酸序列只有28%相同！1）完整序列比對第14頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四2）部分序列分析尋找共同擁有的結構域（domain）.如tudordomain

結構域是序列功能的核心。第15頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四（3）同源性分析在酵母基因組計劃中的應用30%

是通過同源性分析預測的

酵母基因組含有約6000個基因,其中30%

是通過常規(guī)的遺傳實驗確定的.第16頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四2.用實驗確定基因功能（1）通過基因失活分析基因功能將基因突變，觀察由此引起的表型變化。1）同源重組失活“Lossoffunction”第17頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四酵母的刪除盒用抗生素抗性基因替換酵母的某一處基因組序列第18頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四基因敲除（knockout）小鼠胚胎干細胞（EScells）注射到小鼠胚胎嵌合體互相交配純合體敲除小鼠有些基因是至死基因，只能得到雜合體第19頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四2）非同源重組的基因失活1）轉座子標簽：把轉座序列插入到基因中，使基因失活。讓轉座子帶上應答元件，在外界的誘導下轉座。缺點：不能準確失活一個基因，因為轉座是個隨機事件。第20頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四人工誘導轉座：給Ty1

的上游加上半乳糖誘導的啟動子第21頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四2）RNA干涉（RNAinterference）與目標基因序列互補的短雙鏈RNA能降解目標基因的mRNA.在線蟲1號染色體上，2769個預測的基因中的2500分別被進行了RNA干涉第22頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四缺點：在哺乳動物中只能對單細胞進行處理，因為RNA在體內的存在時間有限。第23頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四（2）通過基因超表達分析基因功能“Gainoffunction”第24頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四3.未知基因編碼的蛋白質功能的精細研究（1）定向突變刪除或改變基因序列中的一部分Site-directedmutagenesis(體外定點突變):刪除一段插入一段突變個別堿基

第25頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四1）寡核苷酸定點突變第26頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四2）同源重組導入突變基因

兩步取代：第一步:用標記基因取代原基因第二步:用突變基因取代標記基因

失去標記獲得標記第27頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四（2）報告基因（Reportergenes）和免疫組織化學reportergenes舉例確定基因表達的部位和時空特征.基因基因產物方法lacZ

β-半乳糖苷酶組織化學testuidA

β-葡糖苷酸酶組織化學testlux

熒光素酶生物發(fā)光GFP綠色熒光蛋白熒光第28頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四1）報告基因2）免疫組織化學測定待測基因的啟動子確定基因產物在細胞內的位置第29頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四研究不同組織的不同發(fā)育階段、不同疾病的轉錄物和翻譯產物三、研究基因組的整體活性第30頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四1.研究轉錄物組（1）基因表達系列分析（SAGE）鑒定細胞中的全部mRNA的相對豐度。③

把cDNA序列與基因組序列比較①把mRNA轉為cDNA②

把cDNA文庫中的每個克隆都測序轉錄物組學(transcriptomics)：是一門在整體水平上研究細胞中基因轉錄的情況及轉錄調控規(guī)律的學科.第31頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四基因表達系列分析(SAGE)12-bp短序列足夠特異412=16777216bpBsmFI切割10–14bp的下游.5′-AGCT-3′從每個cDNA末端釋放平均長度12bp第32頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四（2）基因芯片cDNADNA第33頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四2.研究蛋白質組研究一個細胞中全部蛋白質的技術。（1）蛋白質組學①蛋白質電泳第一向:區(qū)分分子量的標準電泳第二向:區(qū)分電荷的標準電泳雙向凝膠電泳:第34頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四②質譜

鑒定蛋白質點的性質.基質輔助激光解吸飛行時間質譜(MALDI-TOF):質荷比（Mass-to-chargeratio）分析分子量，然后推導氨基酸組成第35頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四第36頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四（2）鑒定蛋白質的相互作用如果知道位置蛋白與某個已知蛋白相互作用的話，就能推測其功能。①噬菌體展示噬菌體展示文庫:將未知基因與噬菌體表面蛋白融合，表達到噬菌體表面第37頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四第38頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四②酵母雙雜交系統(tǒng)第39頁，共41頁，2023年，2月20日，星期四（3）蛋白質相互作用圖畫出蛋白質組中所有組分的相互作用圖。①細菌Helicobacterpylori:畫出了1200個相互作用(占蛋白質組的一半）②酵母

1870個蛋