微生物的遺傳變異與育種遺傳物質(zhì)的物質(zhì)基礎(chǔ)

微生物的遺傳變異與育種遺傳物質(zhì)的物質(zhì)基礎(chǔ)第1頁/共189頁第十章微生物的遺傳變異與育種

第一節(jié)

遺傳物質(zhì)的物質(zhì)基礎(chǔ)第2頁/共189頁遺傳(heredity)：親代生物傳遞給子代一套實現(xiàn)與其相同形狀的遺傳信息。

特點：具穩(wěn)定性。遺傳型（genotype）：又稱基因型，指某一生物個體所含有的全部基因的總和是一種內(nèi)在可能性或潛力。

第3頁/共189頁變異(variation):

生物體在外因或內(nèi)因的作用下，遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或數(shù)量發(fā)生改變而導(dǎo)致表型改變。變異的特點：a。群體一般為10-6～10-10；b.形狀變化的幅度大；c.變化后形成的新性狀是穩(wěn)定遺傳的。

第4頁/共189頁表型（phenotype）：指生物體所具有的一切外表特征和內(nèi)在特性的總和;

是具一定遺傳型的生物在一定條件下所表現(xiàn)出的具體性狀。遺傳型

+環(huán)境條件

表型

。

第5頁/共189頁

飾變（modification）：指不涉及遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變而只發(fā)生在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯水平上的表型變化。特點：a.幾乎整個群體中的每一個個體都發(fā)生同樣的變化；b.性狀變化的幅度?。籧.因遺傳物質(zhì)不變，故飾變是不遺傳的。引起飾變的因素消失后，表型即可恢復(fù)。

第6頁/共189頁一、3個經(jīng)典實驗（一）經(jīng)典轉(zhuǎn)化實驗（二）噬菌體感染實驗（三）植物病毒重建實驗第7頁/共189頁（一）經(jīng)典轉(zhuǎn)化實驗1928年

F.Griffith肺炎鏈球菌使小鼠患敗血癥死亡S型菌株---菌株形成莢膜、菌落表面光滑、致病R型菌株---菌株不形成莢膜、菌落表面粗糙、不致病

第8頁/共189頁第9頁/共189頁平板培養(yǎng)實驗

熱死S菌——不生長

活R菌—長出RII菌

熱死S菌+活R菌—長出大量R菌和10-菌

第10頁/共189頁活R菌+S菌無細胞抽提液

——長出大量R菌和少量S菌

第11頁/共189頁1944年

O.T.Avery活R菌+①加S菌DNA②加S菌DNA及DNA酶以外的酶③加S菌的DNA和DNA酶④加S菌的RNA⑤加S菌的蛋白質(zhì)⑥加S菌的莢膜多糖

長出S菌只長R菌第12頁/共189頁10分鐘后用搗碎器使空殼脫離吸附離心沉淀細胞進一步培養(yǎng)后，可產(chǎn)生大量完整的子代噬菌體（二）噬菌體感染實驗含32P-DNA的一組：放射性85%在沉淀中第13頁/共189頁第14頁/共189頁

（三）植物病毒的重建實驗第15頁/共189頁第16頁/共189頁二、遺傳物質(zhì)在細胞內(nèi)的存在部位和方式（一）核酸存在的七個水平及質(zhì)粒細胞水平：存在于細胞核或核質(zhì)體，單核或多核細胞核水平:原與真核生物的細胞核結(jié)構(gòu)不同，核外DNA染色體水平:倍性(真核)和染色體數(shù)核酸水平：在原核中同染色體水平、存在部分二倍體 DNA或RNA，復(fù)合或裸露，雙鏈或單鏈基因水平：具自主復(fù)制能力的遺傳功能單位，長度與信息量，轉(zhuǎn)錄——翻譯密碼子水平： 信息單位,起始和終止,核苷酸水平： 突變或交換單位，四種堿基第17頁/共189頁DNA的三種存在形式

第18頁/共189頁第二節(jié)

基因突變和誘變育種一、基因突變第19頁/共189頁一、基因突變突變：指生物體的表型發(fā)生的可遺傳的變化。狹義突變：基因突變—點突變廣義突變：基因突變和染色體畸變突變的幾率：10-6---10-9

野生菌株

------突變-------突變株第20頁/共189頁（一）基因突變類型（表型分類）營養(yǎng)缺陷型（株）抗性突變型（株）條件致死突變（株）形態(tài)突變型（株）抗原突變型（株）產(chǎn)量突變型（株）第21頁/共189頁營養(yǎng)缺陷型——因突變而喪失合成某種物質(zhì)的能力，因此必須在培養(yǎng)基中添加某種物質(zhì)才能生長的突變類型?？剐酝蛔冃汀蛲蛔兌a(chǎn)生了對某種化學(xué)藥物或致死物理因子的抗性的突變株。

第22頁/共189頁條件致死突變型——突變后在某種條件下可正常生長繁殖，而在另一條件下卻無法生長繁殖的突變型

抗原突變型——因突變而引起的抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生改變第23頁/共189頁（二）突變率每一細胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率。突變率為10–8是指該細胞在一億次細胞分裂中，會發(fā)生一次突變。突變率也可以用每一單位群體在每一世代中產(chǎn)生突變株（mutant，即突變型）的數(shù)目來表示。突變率=突變細胞數(shù)/分裂前群體細胞數(shù)

第24頁/共189頁突變是獨立的。某一基因發(fā)生突變不會影響其它基因的突變率。第25頁/共189頁（三）基因突變的特點以細菌的抗藥性為例。不對應(yīng)性：突變的性狀與突變原因之間無直接的對應(yīng)關(guān)系。自發(fā)性：突變可以在沒有人為誘變因素處理下自發(fā)地產(chǎn)生。稀有性：突變率低且穩(wěn)定。

第26頁/共189頁（三）基因突變的特點獨立性：各種突變獨立發(fā)生，不會互相影響?？烧T發(fā)性：誘變劑可提高突變率。穩(wěn)定性：變異性狀穩(wěn)定可遺傳。第27頁/共189頁（三）基因突變的特點可逆性：從原始的野生型基因到變異株的突變稱為正向突變，從突變株回到野生型的過程則稱為回復(fù)突變

第28頁/共189頁（四）基因突變的自發(fā)性和不對應(yīng)性變量試驗又稱波動試驗或彷徨試驗。1943年，S.E.Luria和M.Delbrück根據(jù)統(tǒng)計學(xué)原理，設(shè)計了的實驗。大腸桿菌大腸桿菌的T1噬菌體（烈性噬菌體）觀察統(tǒng)計抗噬菌體的抗性菌株數(shù)量

第29頁/共189頁第30頁/共189頁第31頁/共189頁2、涂布實驗原理與變量試驗相同，方法更為簡便，且可計算突變率。

第32頁/共189頁（五）基因突變劑機制自發(fā)突變誘發(fā)突變第33頁/共189頁第34頁/共189頁1、

染色體數(shù)目的變化

n----2n-----3n-----4n整倍變化n----n+1、n-1，

2n---2n+1、2n-1、2n-2非整倍變化原核生物只有一條染色體，但可成為部分二倍體。

第35頁/共189頁2、

染色體結(jié)構(gòu)的變化

染色體結(jié)構(gòu)的變化也稱為染色體畸變，包括：缺失、重復(fù)、倒位、易位、轉(zhuǎn)座。一般認為這是由于染色體單體發(fā)生斷裂后，錯誤性愈合而造成的。

可造成隱性基因的表達、顯形基因的拷貝數(shù)增多、某一性狀的缺失、基因間連鎖程度的變化、不同染色體基因的連鎖等變化。第36頁/共189頁重復(fù)、缺失、倒位、易位第37頁/共189頁轉(zhuǎn)座因子（可移動基因、跳躍基因）插入序列

IS轉(zhuǎn)座子

Tn轉(zhuǎn)座噬菌體

Mn轉(zhuǎn)座頻率：10-5—10-7

轉(zhuǎn)座因子---復(fù)制---非同源重組正向重復(fù)序列-----轉(zhuǎn)座酶基因-----反向重復(fù)序列

第38頁/共189頁3、基因突變（點突變）的誘變機制誘變劑（mutagen）：凡能提高突變率的任何理化因子，就稱為誘變劑種類：誘變劑的種類很多代表性的誘變劑的作用機制。

第39頁/共189頁（1）堿基置換（substitution）一對堿基被另一對堿基所置換。轉(zhuǎn)換（transition），即DNA鏈中的一個嘌呤被另一個嘌呤或是一個嘧啶被另一個嘧啶所置換；顛換（transversion），即一個嘌呤被一個嘧啶,或是一個嘧啶被一個嘌呤所置換。

第40頁/共189頁堿基的置換（實線代表轉(zhuǎn)換；虛線代表顛換）

第41頁/共189頁堿基置換后會出現(xiàn)下列幾種情況(1)

錯義突變

一種氨基酸，變成另一種氨基酸；(2)

無義突變

氨基酸的堿基置換后變成UAG（琥珀突變）、UAA（赫石突變）UGA（乳石突變）等終止密碼子；

第42頁/共189頁配對原則

嘌呤

------嘧啶

6位上是氨基的嘌呤------4位上是酮基的嘧啶

6位上是酮基的嘌呤------4位上是氨基的嘧啶

第43頁/共189頁*烷化劑(alkylatingagent)帶有一個或多個活性烷基，誘變作用是其與DNA中的堿基或磷酸作用。常見的烷化劑有硫酸二乙酯（EDS）、甲基磺酸乙酯（EMS）、N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍（NTG）、亞硝基甲基脲(NMU)、氮芥、乙烯亞胺和環(huán)氧乙酸等。第44頁/共189頁第45頁/共189頁（2）移碼突變移碼突變是指由一種誘變劑引起DNA分子中的一個或少數(shù)幾個核苷酸的插入或缺失，從而使該部位后面的全部遺傳密碼發(fā)生轉(zhuǎn)錄和翻譯錯誤的一類突變。

第46頁/共189頁移碼突變誘變劑

吖啶類染料（原黃素、吖啶黃、吖啶橙等）和一系列稱為ICR類的化合物（美國的腫瘤研究所合成而得名），都是移碼突變的有效誘變劑

第47頁/共189頁4、自發(fā)突變的機理大多數(shù)自發(fā)突變本質(zhì)上也是誘發(fā)的，只不過它不是人為的，而是自然環(huán)境或細胞內(nèi)環(huán)境誘發(fā)的。細胞外因素、細胞內(nèi)因素DNA分子內(nèi)部因素

第48頁/共189頁（1）細胞外的誘發(fā)因素

自然環(huán)境或人工條件下的物理和化學(xué)因素自然環(huán)境中，宇宙間的短波輻射、宇宙線和紫外線等，多因素低劑量長期輻射的綜合效應(yīng)，將會引起生物的自發(fā)突變。自然環(huán)境中存在低劑量的金屬離子、高分子化合物、生物堿藥物、染料等都能成為引起生物突變的化學(xué)因素

第49頁/共189頁（2）細胞內(nèi)的誘發(fā)因素

細胞的代謝活動會產(chǎn)生一些誘變物質(zhì)，如過氧化氫、咖啡堿和重氮絲氨酸等，它們是引起自發(fā)突變的內(nèi)源誘變劑。許多微生物的陳舊培養(yǎng)物中易出現(xiàn)自發(fā)突變株，可能就是這類原因。

第50頁/共189頁（3）

DNA分子內(nèi)部因素

DNA分子中的堿基存在著互變異構(gòu)效應(yīng)。

A、T、G、C四種堿基，存在酮基結(jié)構(gòu)（T，G）或氨基結(jié)構(gòu)（A，C），酮式與烯醇式存在互變異構(gòu)，氨基式與亞氨基式存在互變狀態(tài)第51頁/共189頁（3）

DNA分子內(nèi)部因素

一般生理條件下，堿基互變平衡反應(yīng)傾向于酮式或氨基式，DNA兩條互補鏈之間總是以A:T和CG堿基配對。但T偶爾也會以稀有的烯醇式形式出現(xiàn)，這樣在DNA復(fù)制到達這一位置的瞬間，新合成鏈中T對應(yīng)的不再是A，而是G；第52頁/共189頁（3）

DNA分子內(nèi)部因素

同理，若堿基C以稀有的亞氨基形式出現(xiàn)，在DNA復(fù)制到達這一位置的瞬間，則它對應(yīng)的不是G據(jù)統(tǒng)計，堿基對發(fā)生自發(fā)突變的幾率約為10–8~10–9。

第53頁/共189頁第54頁/共189頁環(huán)出效應(yīng)環(huán)狀突出效應(yīng)。有人提出，在DNA的復(fù)制過程中，如果其中某一單鏈上偶然產(chǎn)生一個小環(huán)，則會因其上的基因越過復(fù)制而發(fā)生遺傳缺失第55頁/共189頁（六）紫外線對DNA的損傷及其修復(fù)嘧啶對紫外線的敏感性要比嘌呤強得多。嘧啶的光化產(chǎn)物主要是二聚體和水合物。其中了解較清楚的是胸腺嘧啶二聚體的形成和消除。紫外線的主要作用是使同鏈DNA的相鄰嘧啶間形成共價結(jié)合的胸腺嘧啶二聚體。第56頁/共189頁1、光復(fù)活作用（photoreactivation）經(jīng)紫外線照射后的微生物立即暴露于可見光下時，可明顯降低其死亡率的現(xiàn)象，稱為光復(fù)活作用。對照：8×106個/mlE.coliU.V.100個/ml試驗：8×106個/mlE.coliU.V.360~490nm2×106個/mlE.coli

可見光，30分

第57頁/共189頁1、光復(fù)活作用（photoreactivation）經(jīng)紫外線照射后形成的帶有胸腺嘧啶二聚體的DNA分子，在黑暗下會被一種光激活酶即光裂合酶（photolyase）結(jié)合，當形成的復(fù)合物暴露在可見光（300~500nm）下時，此酶會因獲得光能而發(fā)生解離，從而使二聚體重新分解成單體。光激活酶也從復(fù)合物中釋放出來。每一E.coli細胞中約含有25個光激活酶分子。第58頁/共189頁1、光復(fù)活作用（photoreactivation）

由于一般的微生物中都存在著光復(fù)活作用，所以進行紫外線誘變育種時，只能在紅光下照射及處理照射后的菌液。

第59頁/共189頁第60頁/共189頁2、暗修復(fù)作用（darkrepair）又稱切除修復(fù)（excisionrepair）。是活細胞內(nèi)一種用于修復(fù)被紫外線等誘變劑（包括烷化劑、X射線和γ射線等）損傷后的DNA的機制。這種修復(fù)作用與光無關(guān)。第61頁/共189頁有四種酶參與①內(nèi)切核酸酶：切開

②外切核酸酶：擴大③DNA聚合酶：復(fù)制④通過連接酶：連接

完成了修復(fù)作用。

第62頁/共189頁第63頁/共189頁3、紫外誘變方法:設(shè)備：紫外燈、磁力攪拌器、暗室等，紫外燈：波長為253、7nm,功率是15W處理時的照射距離：20cm—30cm樣品：要直接暴露在紫外燈下，厚度不能超過3mm照射時，要用磁力攪拌器攪拌。處理劑量：常用照射時間或死亡率作為相對劑量第64頁/共189頁在實際應(yīng)用中，用死亡率表示照射劑量更可靠。

通常先繪制照射時間與死亡率的關(guān)系曲線，然后選擇合適的劑量。

生產(chǎn)上經(jīng)常采用的劑量：

死亡率為70%——80%左右。

第65頁/共189頁二、突變與育種（一）自發(fā)突變與育種1、生產(chǎn)中育種10-6突變率

-----尋找正向突變菌株2、定向培育優(yōu)良菌種牛型結(jié)核桿菌------13年----230代----卡介苗（減毒活菌疫苗）第66頁/共189頁（二）誘變育種

誘變

+篩選誘變是隨機的；篩選是定向的目前發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)菌株都是經(jīng)過突變改造過的。第67頁/共189頁1、誘變育種的基本規(guī)律第68頁/共189頁2、誘變育種中的幾個原則

誘變劑的選擇

1誘變劑作用的普遍性：選擇那些在其它菌種選育中誘變效果好的誘變劑。如：UV，亞硝基胍（NTG），快中子等。2．誘變劑的特異性：經(jīng)驗之談。

如，四環(huán)素族抗生素用亞硝酸、羥胺，

青霉素用氮芥、乙烯亞胺、亞硝基胍．第69頁/共189頁3*菌株的差異：（即使是同一菌）

A：遺傳性不穩(wěn)定的菌株------用緩和誘變劑

B：遺傳性穩(wěn)定的菌株---------首用強，后用緩。*考慮誘變機制：UV嘧啶，

亞硝酸

嘌呤，因此復(fù)合用為好

第70頁/共189頁2、誘變育種中的幾個原則

誘變基本過程

第71頁/共189頁選擇合適的出發(fā)菌株↓制備待處理的菌懸液↓誘變處理↓篩選↓保藏和擴大試驗第72頁/共189頁第73頁/共189頁（4）.制備單細胞或單孢子懸液

要求①菌體處于對數(shù)生長期，

②細胞分散且為單細胞，

方法：①玻璃珠打散10-15min;

②加０.3%吐溫80

③用無菌脫脂棉過濾。

制備：物理誘變劑——生理鹽水

化學(xué)誘變劑——緩沖液

濃度：細菌、放線菌108個/ml

霉菌、酵母菌106個/ml第74頁/共189頁（5）誘變劑劑量的選擇用90-99%殺菌劑量用50—85%的殺菌劑量，此時正突變率高，特別是出發(fā)菌株已是高產(chǎn)菌株。

第75頁/共189頁（6）誘變劑的處理方法

誘變劑使用方式

單一處理

復(fù)合處理：

誘變處理條件：溫度（生長溫度）

PH（緩沖劑）

處理時間誘變作用的終止：用解毒劑、用水稀釋

第76頁/共189頁第77頁/共189頁（7）突變株的篩選

篩選條件：基因型+環(huán)境

表型

表型遲延

充分表達分離性遲延現(xiàn)象生理性遲延現(xiàn)象

第78頁/共189頁（7）突變株的篩選

合適的篩選方法

：

平皿快速檢測法變色圈法

透明圈法

生長圈法抑菌圈法

梯度平板法搖瓶培養(yǎng)法第79頁/共189頁第80頁/共189頁第一輪：一個出發(fā)菌株→→→

選出200個菌株→→→

選出50株→→→選出5株誘變處理初篩

（每瓶一株）復(fù)篩（每瓶四株）

第二輪：5個出發(fā)菌株→→→

→→

→

選出50株

→→

→選出5株40株40株40株40株40株誘變處理初篩復(fù)篩（每瓶一株）（每瓶四株）第81頁/共189頁3、三類突變株的篩選產(chǎn)量突變株篩選

抗藥性突變株的篩選（梯度平板法）

營養(yǎng)缺陷型(auxotroph)的篩選

第82頁/共189頁

產(chǎn)量突變株篩選瓊脂塊培養(yǎng)法（春日霉素）孢子懸液------誘變----適當培養(yǎng)（表型遲延）-----

涂布平板----打孔取菌落-----瓊脂塊培養(yǎng)----4-5天—

測定瓊脂塊所含的抗生素的抑菌圈----效價高菌

第83頁/共189頁第84頁/共189頁

抗藥性突變株的篩選（梯度平板法）

第85頁/共189頁第86頁/共189頁第87頁/共189頁第88頁/共189頁第89頁/共189頁篩選步驟

野生型菌株

C-1：誘變處理（同前講述）

C-2：淘汰野生型（濃縮缺陷型）

C-3：檢出缺陷型

C-4：鑒定缺陷型第90頁/共189頁C-2：淘汰野生型（濃縮缺陷型）

誘變后，仍存在大量的野生型，不利于分離（1）抗生素法野生型菌株在MM上生長+青霉素—殺死Ｇ＋

缺陷型菌株在MM上不生長＋青霉素—-不殺死注意：使環(huán)境的滲透壓提高，避免細胞破裂。抗生素處理完后，離心收集細胞，并轉(zhuǎn)入低滲溶液制霉菌素法則適合于真菌（例如：酵母、霉菌），可與真菌細胞膜上的甾醇作用，從而引起溶菌

第91頁/共189頁第92頁/共189頁第93頁/共189頁第94頁/共189頁檢出缺陷型逐個檢出法影印檢出法夾層培養(yǎng)法限量補給法第95頁/共189頁逐個檢出法

第96頁/共189頁影印檢出法

第97頁/共189頁第98頁/共189頁限量補給法

在含少量的（0.01%）蛋白胨的MM上培養(yǎng),大菌落為野生型小菌落的為缺陷型。

第99頁/共189頁第100頁/共189頁生長譜法

斜面菌種-----生理鹽水洗下細胞------洗滌-----涂布（105個/皿）

第101頁/共189頁紙片1:氨基酸混合液;紙片2:維生素混合液;紙片3:核酸水解液;紙片4:酵母水解液

第102頁/共189頁第103頁/共189頁第104頁/共189頁組合補充培養(yǎng)基法如是多個缺陷型菌株，則制成各營養(yǎng)組合平板，將帶測菌株依次點接到這一組平板的對應(yīng)位置上，根據(jù)在各平板上的生長情況逐個分析各菌株的缺陷型

MM+A+B+C+A+B+A+C

第105頁/共189頁第106頁/共189頁第107頁/共189頁第三節(jié)

基因重組和雜交育種一、原核生物的基因重組第108頁/共189頁原核生物的基因重組凡把兩個不同性狀個體內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)過遺傳分子間的重新組合，形成新遺傳型個體的方式，稱為基因重組（generecombination）或遺傳重組。作用：重組可使生物體在未發(fā)生突變的情況下，也能產(chǎn)生新遺傳型的個體。

第109頁/共189頁重組與雜交的關(guān)系重組是分子水平上的一個概念，可以理解成是遺傳物質(zhì)分子水平上的雜交而一般所說的雜交（hybridization）則是細胞水平上的一個概念。雜交中必然包含著重組，而重組則不限于雜交這一形式。第110頁/共189頁一、原核微生物的基因重組特點：片段性：僅一小段DNA單向性：共體

受體轉(zhuǎn)移機制多樣性：

轉(zhuǎn)化、

轉(zhuǎn)導(dǎo)、

接合、

原生質(zhì)體融合第111頁/共189頁（一）轉(zhuǎn)化受體菌直接吸收來自供體菌的游離DNA片段，并把它整合到自己的基因組中，而獲得部分新的遺傳性狀的基因轉(zhuǎn)移過程，稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的的受體菌稱為轉(zhuǎn)化子（transformant）。來自供體菌的DNA片段稱為轉(zhuǎn)化因子第112頁/共189頁1、轉(zhuǎn)化發(fā)生的條件（1）兩個菌株間的親緣關(guān)系密切（2）受體細胞要處于感受態(tài).（3）供體DNA片段（轉(zhuǎn)化因子）大小適宜，分子量一般為1×106

D

左右，15個基因

感受態(tài)：受體細胞能從環(huán)境吸取外源DNA片段并實現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)

第113頁/共189頁（4）單鏈供體DNA進入受體菌，發(fā)生同源重組；

（在受體菌表面，一條鏈被水解）（5）DNA復(fù)制，受體細胞分裂，帶有新形狀的個體為轉(zhuǎn)化子第114頁/共189頁第115頁/共189頁第116頁/共189頁

轉(zhuǎn)染把噬菌體或其它病毒的DNA（或RNA）抽提出來，讓它去感染感受態(tài)的宿主細胞，并進而產(chǎn)生正常的噬菌體或病毒的后代，這種現(xiàn)象稱為轉(zhuǎn)染（transfection）。

第117頁/共189頁（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)（Transduction）借助缺陷噬菌體為媒介，把供體細胞中DNA片段攜帶到受體細胞中，從而使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱轉(zhuǎn)導(dǎo)。獲得新遺傳性狀的受體細胞稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子（transductant）。轉(zhuǎn)導(dǎo)過程不需要細胞接觸，而是以噬菌體為載體

第118頁/共189頁轉(zhuǎn)導(dǎo)主要分為：

完全普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)

流產(chǎn)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)

低頻局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)兩種類型

高頻局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)第119頁/共189頁（1)

普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)（Generalizedtransduction）

由于完全缺陷型噬菌體攜帶了供體菌染色體片段，當它去感染受體菌時，使后者獲得這部分遺傳性狀的現(xiàn)象稱為普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)

第120頁/共189頁完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)條件

供體菌----野生型（鼠傷寒沙門氏菌

）受體菌-----各種營養(yǎng)缺陷型完全缺陷型噬菌體----P22，感染復(fù)數(shù)<1特點：供體的任何基因都有可能進入受體細胞第121頁/共189頁第122頁/共189頁（2）局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)

Restrictedtransduction是指通過部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中并獲得表達的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。

第123頁/共189頁（2）局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)

Restrictedtransduction條件：

供體菌----大腸桿菌K12（λ）溶源菌（野生型）

受體菌-----營養(yǎng)缺陷型（Bio-，gal-）

部分缺陷溫和性噬菌體----λd特點：

只傳遞供體菌的少數(shù)特定基因第124頁/共189頁正常噬菌體和轉(zhuǎn)導(dǎo)半乳糖（gal）的缺陷型噬菌體(dg)的形成過程

第125頁/共189頁發(fā)生誤切頻率10–4~10–6因此

形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子的頻率低條件：感染復(fù)數(shù)m.o.i<1低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)第126頁/共189頁高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)條件：當感染復(fù)數(shù)m.o.I>1

受體菌變?yōu)樾纬呻p溶源菌

E.coliK12(/dg)UV

①轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體（

dg）50%+②輔助噬菌體（

）50%再次侵染其他受體細胞

，m.o.I<1

侵染的50%受體菌變?yōu)檗D(zhuǎn)導(dǎo)子第127頁/共189頁第128頁/共189頁第129頁/共189頁第130頁/共189頁（3）、溶源轉(zhuǎn)變當溫和噬菌體感染宿主而使其發(fā)生溶源化時，因噬菌體的基因整合到宿主的核基因組上，而使后者獲得了除免疫性以外的新性狀的現(xiàn)象，稱為溶源轉(zhuǎn)變。性質(zhì)：表面上與轉(zhuǎn)導(dǎo)相似，而本質(zhì)上不同于轉(zhuǎn)導(dǎo)。

第131頁/共189頁（3）、溶源轉(zhuǎn)變區(qū)別：當宿主喪失其原噬菌體時，通過溶源轉(zhuǎn)變而獲得的新性狀也隨之消失溫和噬菌體不攜帶來自供體菌的外源基因，是噬菌體自身基因使宿主獲得新性狀溫和噬菌體使完整的，不是缺陷的獲得新性狀的是溶源化的宿主細胞，不是轉(zhuǎn)導(dǎo)子

第132頁/共189頁白喉棒桿菌：白喉毒素/溫和噬菌體肉毒梭菌：C型或D型肉毒毒素紅霉素鏈霉菌：合霉素合成和氣生菌絲形成/P4溫和噬菌體

第133頁/共189頁第134頁/共189頁第135頁/共189頁第136頁/共189頁1946年J.Lederberg等采用E.coli的兩株營養(yǎng)缺陷型進行實驗第137頁/共189頁第138頁/共189頁大腸桿菌“接合”涉及到的菌株

F+（雄性）菌株：

含游離的F因子1~4個

，有

性菌毛1~4根

Hfr（高頻重組）菌株：

含整合的F因子，有性菌毛，

Fˊ菌株

介于F+菌株與Hfr菌株之間，細胞中有游

離的、帶小段染色體基因的環(huán)狀F因子

F–（雌性）菌株

：沒有F因子，無性菌毛

第139頁/共189頁接合：雌性菌

X雄性

F+菌株

Hfr菌株

Fˊ菌株

從自然界分離到的2000株E.coli中約有30%是F–菌株。F–（雌性）菌株接合第140頁/共189頁第141頁/共189頁

（1）F+×F–F++F+

（2）Hfr×F–Hfr+F–

（在大多數(shù)情況下）

Hfr×F–Hfr+Hfr（或

F+）

（極少數(shù)情況下）

（3）F×F–F′+F′注意：接合實驗所用到的F-菌株是一系列營養(yǎng)缺陷型菌株，當發(fā)生重組時，變成原養(yǎng)型

第142頁/共189頁接合的結(jié)果轉(zhuǎn)性率高，染色體基因重組率低第143頁/共189頁Hfr菌株中F因子的整合、斷裂和轉(zhuǎn)移

第144頁/共189頁第145頁/共189頁Hfr的接合中斷實驗接合的結(jié)果轉(zhuǎn)性低，染色體基因重組率高第146頁/共189頁Hfr的中斷雜交實驗第147頁/共189頁第148頁/共189頁F因子在Hfr菌株中的染色體上：插入位點有幾個可以正向，可以反向插入構(gòu)成了Hfr1菌株、

Hfr2菌株、

Hfr3……一系列菌株，相對穩(wěn)定通過中斷實驗，劃出了環(huán)狀染色體圖

第149頁/共189頁F’轉(zhuǎn)導(dǎo)1初生F’菌株第150頁/共189頁F’轉(zhuǎn)導(dǎo)2次生F’菌株第151頁/共189頁（四）原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合是通過人工方法，使遺傳性狀不同的兩個細胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并產(chǎn)生重組子的過程。應(yīng)用原生質(zhì)體融合技術(shù)后，細胞間基因重組的頻率大大提高了，在某些例子中，原生質(zhì)體的重組頻率已大于10-1

第152頁/共189頁主要步驟選擇親株、制備原生質(zhì)體、原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體再生篩選優(yōu)良性狀的融合子。

第153頁/共189頁第154頁/共189頁選擇親株

選擇遺傳性狀穩(wěn)定且具有優(yōu)勢互補的兩個親株。參與融合的親株一般都需要帶有可以識別的遺傳標記，如營養(yǎng)缺陷型或抗藥性等。誘變劑對原種進行處理來獲得這些遺傳標記。應(yīng)先測定菌株各遺傳標記的穩(wěn)定性，自發(fā)回復(fù)突變的頻率低第155頁/共189頁原生質(zhì)體制備

一般都采用酶解法去壁。根據(jù)微生物細胞壁的不同，需分別采用不同的酶，如溶菌酶，纖維素酶，蝸牛酶等。有時需結(jié)合其它一些措施，如在生長培養(yǎng)基中添加甘氨酸、蔗糖或抗生素等，以提高細胞壁對酶解的敏感性。

第156頁/共189頁原生質(zhì)體融合聚乙二醇（PEG）能有效地促進原生質(zhì)體融合一般PEG的使用濃度范圍在25-40%。原生質(zhì)體只需要與PEG接觸一分鐘，紫外線照射或脈沖電場等物理因素處理也能促進原生質(zhì)體融合。

第157頁/共189頁原生質(zhì)體再生就是使原生質(zhì)體重新長出細胞壁

，恢復(fù)完整的細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。不同微生物的原生質(zhì)體的最適再生條件不同。但最重要的一個共同點是都需要高滲透壓。細菌一般再生率為3-10%。

第158頁/共189頁篩選優(yōu)良性狀融合重組子

直接法將融合液涂布高滲再生選擇培養(yǎng)基平板上，直接篩選出原養(yǎng)型重組子；間接法把融合液涂布在營養(yǎng)豐富的高滲再生平板上，表型延遲后，再涂布高滲再生選擇培養(yǎng)基。第159頁/共189頁原生質(zhì)體融合的優(yōu)點：

可以提高重組率

可進行多親本融合

有利于不同種間、屬間微生物的雜交

通過原生質(zhì)體融合提高產(chǎn)量

第160頁/共189頁二、真核微生物的基因重組有性雜交準性雜交原生質(zhì)體融合遺傳轉(zhuǎn)化第161頁/共189頁（一）有性雜交

一般指性細胞間的接合和隨之發(fā)生的染色體重組，并產(chǎn)生新遺傳型后代的過程。凡是能產(chǎn)生有性孢子的酵母菌或霉菌，原則上都能采用與高等動、植物雜交育種相似的有性雜交方法進行育種。

第162頁/共189頁親本的單倍化↓有性雜交↓雜交后代的檢出↓篩選優(yōu)良性狀個體第163頁/共189頁工業(yè)上應(yīng)用的釀酒酵母通常是雙倍體酵母菌，并且只進入無性世代。要使這些酵母菌發(fā)生基因重組，應(yīng)先誘使其產(chǎn)生子囊孢子，再使兩個不同性狀的親本發(fā)生接合，形成二倍體的雜交后代。

第164頁/共189頁酒精酵母

面包發(fā)酵產(chǎn)酒率高

對糖的利用能力強

子囊孢子

子囊孢子

雜交二倍體

第165頁/共189頁（二）準性雜交育種（parasexualhybridization）準性生殖是一種類似于有性生殖，但比它更原始的生殖方式，

準性生殖可發(fā)生在同一生物的二個不同來源的體細胞之間，經(jīng)細胞融合但不發(fā)生減數(shù)分裂，導(dǎo)致低頻率的基因重組

第166頁/共189頁第167頁/共189頁第168頁/共189頁第169頁/共189頁第170頁/共189頁第171頁/共189頁第172頁/共189頁第173頁/共189頁第174頁/共189頁第四節(jié)

基因工程基因工程是用人為的方法將所需的某一供體生物的遺傳物質(zhì)DNA分子提取出來，在離體條件下切割后，把它與作為載體的DNA分子連接起來，然后導(dǎo)入某一受體細胞中，讓外來的遺傳物質(zhì)在其中進行正