基因工程基本操作技術(shù)

基因工程基本操作技術(shù)第1頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)離心技術(shù)離心技術(shù)基本原理離心機主要構(gòu)造和類型離心技術(shù)應(yīng)用第2頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四生物樣品懸浮液在高速旋轉(zhuǎn)下，由于巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒(細(xì)胞器、生物大分子的沉淀等)以一定的速度沉降，從而與溶液得以分離。

沉降速度取決于顆粒的質(zhì)量、大小和密度。離心技術(shù)主要用于各種生物樣品的分離和制備。離心技術(shù)在生物科學(xué)，特別是在生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究領(lǐng)域，己得到十分廣泛的應(yīng)用，每個生物化學(xué)和分子生物學(xué)實驗室都要配置各種類型的離心機。第3頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四一、基本原理當(dāng)一個粒子(生物大分子或細(xì)胞器)在高速旋轉(zhuǎn)下受到離心力作用時，此離心力“F”由下式定義，即：a----粒子旋轉(zhuǎn)的加速度m----沉降粒子的有效質(zhì)量ω---粒子旋轉(zhuǎn)的角速度r----粒子的旋轉(zhuǎn)半徑(cm)第4頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四

∴RCF=1.119×10-5×(rpm)2rrpm---revolutionsperminute為每分鐘轉(zhuǎn)數(shù),r/min低速離心時常以轉(zhuǎn)速“rpm”來表示高速離心時則以“g”表示第5頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四將離心機轉(zhuǎn)數(shù)換算為相對離心力時，首先，在r標(biāo)尺上取已知的半徑和在N標(biāo)尺上取已知的離心機轉(zhuǎn)數(shù)。然后，將這兩點間劃一條直線，在圖中間RCF標(biāo)尺上的交叉點極為相應(yīng)的相對離心力數(shù)值。注意，若已知的轉(zhuǎn)數(shù)值處于N標(biāo)尺的右邊，則應(yīng)讀取RCF標(biāo)尺右邊的數(shù)值；同樣，轉(zhuǎn)數(shù)值處于N標(biāo)尺的左邊，則讀取RCF標(biāo)尺左邊的數(shù)值．第6頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四二、離心機的主要構(gòu)造和類型

實驗用離心機

制備性離心機分析性離心機

工業(yè)用離心機離心機第7頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四1、制備性離心機可分為三類離心機一般有離心主機，轉(zhuǎn)頭和離心管三部分組成。（1）普通離心機：最大轉(zhuǎn)速6000rpm左右（2）高速冷凍離心機：最大轉(zhuǎn)速為20000～25000rpm（r/min）（3）超速離心機：轉(zhuǎn)速可達(dá)50000～80000rpm，裝有真空系統(tǒng)，這是它與高速離心機的主要區(qū)別。第8頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四第9頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四分析性離心機

分析性離心機使用了特殊設(shè)計的轉(zhuǎn)頭和光學(xué)檢測系統(tǒng)，以便連續(xù)地監(jiān)測物質(zhì)在一個離心場中的沉降過程，從而確定其物理性質(zhì)。

第10頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四2、轉(zhuǎn)頭(1)角式轉(zhuǎn)頭

第11頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四角式轉(zhuǎn)子的特點：

（1）重心低,轉(zhuǎn)速可較高

（2）樣品粒子穿過溶劑層的距離略大于離心管的直徑;

（3）“管壁效應(yīng)”：

有一定的角度,在離心過程中撞到離心管外壁的粒子沿著管壁滑到管底形成沉淀,此效應(yīng)使最后在管底聚成的沉淀較緊密。

第12頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四(2)水平轉(zhuǎn)子（1）轉(zhuǎn)子靜止時,處在轉(zhuǎn)子中的離心管中

心線與旋轉(zhuǎn)軸平行,

（2）轉(zhuǎn)子旋轉(zhuǎn)加速時,離心管中心線由

行位置逐漸過渡到垂直位置,即與旋

轉(zhuǎn)軸成90°角,

（3）粒子的沉淀方向同旋轉(zhuǎn)半徑方向基本一致有少量的“管壁效應(yīng)”水平轉(zhuǎn)子的特點：

（1）轉(zhuǎn)子的重心位置較高

（2）樣品粒子沉降穿過溶劑層的距離大于直徑

（3）對于多種成分樣品分離特別有效

（4）常用于速率區(qū)帶離心和等密度離心第13頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四第14頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四第15頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四

(3)區(qū)帶轉(zhuǎn)頭：

區(qū)帶轉(zhuǎn)頭無離心管，主要由一個轉(zhuǎn)子桶和可旋開的頂蓋組成。

(4)垂直轉(zhuǎn)頭：其離心管是垂直放置的。

(5)連續(xù)流動轉(zhuǎn)頭：

轉(zhuǎn)頭與區(qū)帶轉(zhuǎn)頭類似，由轉(zhuǎn)子桶和有入口和出口的轉(zhuǎn)頭蓋及附屬裝置組成。第16頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四3、離心管

塑料離心管常用材料有聚乙烯(PE)，聚碳酸酯(PC)，聚丙烯(PP)等，其中PP管性能較好。塑料離心管的優(yōu)點是透明(或半透明)，硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺點是易變形，抗有機溶劑腐蝕性差，使用壽命短。不銹鋼管強度大，不變形，能抗熱，抗凍，抗化學(xué)腐蝕。但用時也應(yīng)避免接觸強腐蝕性的化學(xué)藥品，如強酸、強堿等。第17頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四第18頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四離心操作的注意事項使用各種離心機時，必須事先在天平上精確

平衡離心管和其內(nèi)容物，轉(zhuǎn)頭中絕對不能裝

載單數(shù)的管子。當(dāng)轉(zhuǎn)頭只是部分裝載時，管子必須互相對稱地放在轉(zhuǎn)頭中，以便使負(fù)載均勻地分布在轉(zhuǎn)頭的周圍。離心過程中不得隨意離開。第19頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四裝載溶液時，根據(jù)待離心液體的性質(zhì)及體積選用適合的離心管。液體不得裝得過多，以防離心時甩出，造成轉(zhuǎn)頭不平衡、生銹或被腐蝕。若要在低于室溫的溫度下離心時。轉(zhuǎn)頭在使用前應(yīng)放置在冰箱或置于離心機的轉(zhuǎn)頭室內(nèi)預(yù)冷。每個轉(zhuǎn)頭各有其最高允許轉(zhuǎn)速和使用累計期限，使用轉(zhuǎn)頭時要查閱說明書，不得過速使用。第20頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四第21頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四

根據(jù)離心原理,按照實際工作的需要，目前已有可設(shè)計出各種離心方法綜合起來大致可分為：三、離心分離方法沉降速度法：根據(jù)粒子大小、形狀不同進(jìn)行分離。差速離心法

速率區(qū)帶離心法沉降平衡法

等密度離心法：又稱等比重離心法,依粒子密度差進(jìn)行分離,等密度離心法和上述速率區(qū)帶離心法合稱為密度梯度離心法。經(jīng)典式沉降法：用于對生物大分子分子量的測定、純度估計、構(gòu)象變化。

第22頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四用差速離心法分離已破碎的細(xì)胞各組份500g,10分鐘上清液沉淀(細(xì)胞核）已破碎的細(xì)胞

10,000g,10分鐘沉淀(細(xì)胞膜碎片,線粒體,溶酶體)100,000g,3小時上清液沉淀(核糖核蛋白體）

上清液(可溶性成份)

第23頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四常用的梯度材料：

1.糖類:蔗糖、甘油、聚蔗糖(Ficoll)、右旋糖酐、糖原

2.無機鹽類:CsCl(氯化銫)、RbCl(氯化銣)、NaCl、KBr等

3.有機碘化物:三碘苯甲酰匍萄糖胺等

4.硅溶膠:如Percoll。

5.蛋白質(zhì):如牛血清白蛋白

6.重水

7.非水溶性有機物:如氟代碳等

等密度離心法第24頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四1.測定生物大分子的相對分子重量

沉降速度

沉降平衡

接近沉降平衡

2.生物大分子的純度估計

3.分析生物大分子中的構(gòu)象變化

分析性超速離心的應(yīng)用第25頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四第26頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四第二節(jié)核酸的提取、純化與含量測定第27頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四就基因工程而言，核酸分子是其研究所涉及的主要對象，所以核酸的分離與提取是研究中很重要的基本技術(shù)。核酸樣品的質(zhì)量將直接關(guān)系到實驗的成敗。第28頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四核酸的分類DNA:主要存在于細(xì)胞核的染色體中。核外也有少量DNA，如線粒體DNA（mtDNA），葉綠體DNA（cpDNA），質(zhì)粒DNA。RNA:存在于細(xì)胞質(zhì)中，如mRNA,rRNA,tRNA等。除上述DNA，RNA外，還有非細(xì)胞形式存在的病毒和噬菌體，其或只含DNA，或只含有RNA。第29頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四一、核酸提取的基本原理1、提取的含義:

提取是指在一定的條件下用一定的溶劑處理樣品，使欲分離的物質(zhì)充分釋放到溶劑中的過程,又稱為抽提。常用的溶劑有水、稀鹽、稀酸、稀堿或甘油等較緩和的試劑。2、影響提取的主要因素:(1)提取物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)(與其溶解度有關(guān))如:極性物質(zhì)易溶于極性溶劑，非極性物質(zhì)易溶于非極性溶劑，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑，堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑，兩性電解質(zhì)在pI時，溶解度最少。

(2)溫度:一般溫度升高溶解度增大

(3)溶液的粘度；

(4)擴散速度；

(5)擴散面積。第30頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四二、核酸提取的原理

在生物體內(nèi)核酸多以核蛋白的形式存在于組織中，根據(jù)核糖核蛋白(RNP)和脫氧核糖核蛋白(DNP)在不同濃度電解質(zhì)溶液中溶解度明顯差別進(jìn)行分離。故用0.14mol/LNaCl溶解提取核糖核蛋白。核蛋白0.14mol/LNaCl1.0mol/LNaClRNP溶解度大溶解度小DNP溶解度?。▋H為水中1%）溶解度大(比在水中大2倍)第31頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四1.核酸制備的一般原則(1)分離純化核酸總的原則：①應(yīng)保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性②排除其它分子的污染。第32頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四(2)核酸純化應(yīng)達(dá)到的要求：核酸的純化根據(jù)所需核酸的性質(zhì)和特點除去其它核酸污染,并除去提取過程中的系列試劑(鹽、有機溶劑等）雜質(zhì)，最后得到均一的核酸樣品。①核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；②其它生物大分子的污染應(yīng)降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染第33頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四2.核酸制備時應(yīng)注意的事項:

①盡量簡化操作步驟，縮短提取過程。②減少化學(xué)因素對核酸的降解。PH4-10③減少物理因素對核酸的降解。機械剪切力和高溫④防止核酸的生物降解。第34頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四3.核酸制備的一般方法和原理(1)核酸酶的抑制和抑制劑劑降低溫度，改變pH及鹽的濃度，都利于對核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制劑更有利，當(dāng)然，幾個條件并用更好。對于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止機械張力拉斷則更重要。對于RNA，因分子較小，不易被機械張力拉斷，但抑制RNase活力較難，故在RNA提取中設(shè)法抑制RNase更重要。第35頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四DNase抑制①加入少量金屬離子螯合劑，如0.01mol/LEDTA或檸檬酸鈉，DNase基本可以全部失活。②去垢劑、蛋白變性劑及DNase抑制劑也可使DNase失活。第36頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四RNase抑制①操作要帶手套。②所有器皿要嚴(yán)格消毒，③試劑處理④低溫操作⑤在分離過程中要加入一定的RNase抑制劑。

(TRZOL,DEPC,蛋白酶K)第37頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四（2）核酸制備中常用的去垢劑核酸本身帶負(fù)電荷，結(jié)合帶正電荷的蛋白質(zhì)。用于核酸提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑，去垢劑的作用：①溶解膜蛋白及脂肪，使細(xì)胞膜破裂；②溶解核糖體上面的蛋白質(zhì)，使其解聚，將核酸釋放出來；③對RNase、DNase有一定的抑制作用。如：SDS、脫氧膽酸鈉、4-氨基水楊酸鈉、萘-1.5-二磺酸鈉、三異丙基萘磺酸鈉第38頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四（3）核酸制備中常用的蛋白質(zhì)變性劑蛋白質(zhì)變性劑的作用：

①使蛋白質(zhì)變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以防造成蛋白污染。②使蛋白質(zhì)變性，故可使核糖體解聚釋放出核酸。③某些蛋白質(zhì)變性劑也有抑制RNase活性和破裂細(xì)胞的作用。苯酚、氯仿、鹽酸胍、DEPC（4）核酸制備中常用的酶制劑DNase、RNase、蛋白酶K、溶菌酶第39頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四4、核酸提取的一般過程破碎細(xì)胞—提取--純化（1）破碎細(xì)胞（防止核酸酶的作用）微生物：溶菌酶、SDS裂解。高等植物：搗碎器破碎、液氮研磨。酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，冰凍法：反復(fù)凍融或液氮凍后組織搗碎。動物：液氮處理后用勻漿器破碎。細(xì)胞器DNA，首先純化細(xì)胞器。以上處理時均要同時加入核酸酶抑制劑第40頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四（2）破碎抽提核酸除去雜質(zhì)

①首先使脫氧核糖核蛋白、核糖體、病毒的核蛋白與其它成分分離

②使核酸與蛋白質(zhì)分離③除去脂類

④多糖的除去第41頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四5、核酸樣品的保存

核酸保存的主要條件是溫度和介質(zhì)溫度：4℃（5℃）最佳和最簡單

-70℃是長期保存的良好溫度，為一次性保存

-20℃保存（冰箱的自動化霜裝置）保存介質(zhì)：

TE緩沖溶液(最常用)10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0第42頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四三、DNA/RNA提取實例第43頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四細(xì)胞破碎抽提去蛋白質(zhì)沉淀核酸1、植物DNA提取基本過程第44頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四2、質(zhì)粒DNA的提取方法方法：堿裂解法；煮沸裂解；羥基磷灰石柱層析法，質(zhì)粒DNA釋放法；酸酚法等。概括起來主要是用非離子型或離子型去污劑、有機溶劑或堿進(jìn)行處理及用加熱處理所有分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴增；收集和裂解細(xì)菌；分離質(zhì)粒DNA(有時還要求純化質(zhì)粒DNA，根據(jù)實驗所需)第45頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四質(zhì)粒DNA－堿裂解法堿裂解法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子；當(dāng)用堿處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。第46頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四溶液I：50mM葡萄糖

10mMEDTApH8.025mMTris-HClpH8.010μg/mlRNaseA溶液II：0.2NNaOH1.0%SDS

以0.4NNaOH和2%SDS貯備液現(xiàn)用現(xiàn)配溶液III：5MKAc60ml

冰醋酸11.5ml

水28.5ml第47頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四對數(shù)期菌體溶液III中和溶液I充分重懸溶液II裂解上清液抽提離心洗滌酒精沉淀干燥溶解沉淀質(zhì)粒DNA溶液堿裂解法流程圖第48頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四3、細(xì)胞器DNA－差速離心法差速離心法原理是利用物質(zhì)比重的不同分離混合物的一種方法。將待分離物質(zhì)置于均勻介質(zhì)（蔗糖）中，以一定的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心，比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層，從而得以分離。線粒體和葉綠體是生物體內(nèi)半自主性細(xì)胞器，自身可編碼蛋白，它們的比重和大小一定，因而在同一離心場內(nèi)的沉降速度也一定，根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細(xì)胞內(nèi)各種組分分級分離出來。第49頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四總結(jié)：DNA提取的基本步驟I.材料準(zhǔn)備II.破碎細(xì)胞或包膜－內(nèi)容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中第50頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四材料準(zhǔn)備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融提取血液基因組DNA時，要選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞）組培細(xì)胞培養(yǎng)時間不能過長，否則會造成DNA降解含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取使用處于對數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導(dǎo)致開環(huán)質(zhì)粒增加）培養(yǎng)時應(yīng)加入篩選壓力，否則菌體易污染，質(zhì)粒易丟失盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌體用量菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）第51頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四細(xì)胞裂解材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低針對不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：植物材料－－液氮研磨動物組織－－勻漿或液氮研磨組培細(xì)胞－－蛋白酶K細(xì)菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時，定時輕柔振蕩基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取菌體量適當(dāng)培養(yǎng)基去除干凈，同時保證菌體在懸浮液中充分懸浮變性的時間不要過長（5分鐘），否則質(zhì)粒易被打斷復(fù)性時間也不宜過長，否則會有基因組DNA的污染G＋菌、酵母質(zhì)粒的提取，應(yīng)先用酶法或機械法處理，以破壁第52頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系采用有機（酚/氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻，但動作要輕柔離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取核酸分離、純化第53頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四蛋白質(zhì)的去除：酚/氯仿抽提使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等）高鹽洗滌蛋白酶處理核酸分離、純化第54頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四多糖的去除：高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入1/2體積的5MNaCl，高鹽可溶解多糖。用多糖水解酶將多糖降解。在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。核酸分離、純化第55頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四多酚的去除：在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：β-巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它們與酚類有較強的親和力，可防止酚類與DNA的結(jié)合鹽離子的去除：70％的乙醇洗滌核酸分離、純化第56頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四當(dāng)沉淀時間有限時，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分沉淀時加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后應(yīng)用70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取核酸沉淀、溶解第57頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四1.DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)2.DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)3.DNA中殘留有金屬離子1.重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)2.重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)3.增加70％乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）4、DNA提取常見問題問題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)。

原因?qū)Σ叩?8頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四1.材料不新鮮或反復(fù)凍融2.未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性3.提取過程操作過于劇烈，DNA被機械打斷4.外源核酸酶污染1.盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融2.液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液3.在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時，可增加裂解液中螯合劑的含量4.細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔5.所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌6.將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融DNA提取常見問題問題二：DNA降解

原因?qū)Σ叩?9頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四實驗材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗滌時DNA丟失盡量選用新鮮（幼嫩）的材料動植物要勻漿研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或機械方式破壁高溫裂解時，時間適當(dāng)延長（對于動物細(xì)胞、細(xì)菌可增加PK的用量）低溫沉淀，延長沉淀時間加輔助物，促進(jìn)沉淀洗滌時，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒問題三：DNA提取量少DNA提取常見問題

原因?qū)Σ叩?0頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四gDNA電泳圖第61頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四第62頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四四、RNA提取第63頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四RNA提取的通用方法異硫氰酸胍/苯酚法原理：細(xì)胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，同時核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放；釋放出來的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分別位于整個體系中的中間相和水相，從而得以分離；有機溶劑抽提，沉淀，得到純凈RNA。第64頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四材料準(zhǔn)備：盡量新鮮。裂解變性：異硫氰酸胍（亞硫氫胍，巰基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。使細(xì)胞及核蛋白復(fù)合物變性，釋放RNA，有效抑制核酸酶。純化分離：苯酚，氯仿，異戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除雜物。洗滌：70％乙醇。沉淀：異丙醇、無水乙醇。乙酸鈉（pH4.0）：維持變性的細(xì)胞裂解液的pH值，沉淀RNA。此外還常用氯化鋰選擇沉淀RNA。RNA提取的通用方法

步驟:第65頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四影響RNA提取的因素材料：新鮮，切忌使用反復(fù)凍融的材料如若材料來源困難，且實驗需要一定的時間間隔。可以先將材料貯存在TRIzol或樣品貯存液中，于－70℃或－20℃保存如要多次提取，請分成多份保存液氮長期保存，－70℃短期保存第66頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四影響RNA提取的因素根據(jù)不同材料選擇不同的處理方法：培養(yǎng)細(xì)胞：通常可直接加裂解液裂解酵母和細(xì)菌：一般TRIzol可直接裂解，對于一些特殊的材料可先用酶或者機械方法破壁動植物組織：先液氮研磨和勻漿，后加裂解液裂解。期間動作快速，樣品保持冷凍樣品量適當(dāng)，保證充分裂解為減少DNA污染，可適當(dāng)加大裂解液的用量

樣品破碎及裂解：第67頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四純化：在使用氯仿抽提純化時，一定要充分混勻，且動作快速；經(jīng)典的純化方法，如LiCl沉淀等，雖然經(jīng)濟，但操作時間長，易造成RNA降解；柱離心式純化方法：抽提速度快，能有效去除影響RNA后續(xù)酶反應(yīng)的雜質(zhì)，是目前較為理想的選擇。影響RNA提取的因素第68頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四RNA提取常見問題RNA的降解

OD260/OD280比值偏低電泳帶型異常下游實驗效果不佳第69頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四RNA降解

新鮮細(xì)胞或組織：裂解液的質(zhì)量外源RNase的污染裂解液的用量不足組織裂解不充分另外某些富含內(nèi)源酶的樣品(如脾臟，胸腺等)，很難避免RNA的降解。建議在液氮條件下將組織碾碎，并且勻漿時使用更多裂解液。28S18S5S第70頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四RNA降解冷凍樣品：樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后可以移至-70℃冰箱保存。樣品要相對小一點；先用液氮研磨，再加裂解液勻漿；樣品與裂解液充分接觸前避免融化，研磨用具必須預(yù)冷，碾磨過程中及時補充液氮。第71頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四OD260/OD280比值偏低

蛋白質(zhì)污染：不要吸入中間層及有機相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時間要足夠。減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底解決辦法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。苯酚殘留：不要吸入中間層及有機相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時間要足夠。解決辦法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。第72頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四OD260/OD280比值偏低抽提試劑殘留：確保洗滌時要徹底懸浮RNA，