DB32T 4234-2022水產(chǎn)品中副溶血性弧菌檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增法

ICS7.120.30SB江DB32蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)DB/T4234—2022時(shí)熒光重組DetectionmethodforVibrioparahaemolyticusinaquaticbyreal-timefluorescencerecombinaseaidamplification江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布前言督檢驗(yàn)研究院、廣東省科學(xué)院微生物研究所、杭州傲敏生物科技有限公司。趙凱穎、張正榮。性弧菌檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增法本文件規(guī)定了水產(chǎn)品中副溶血性弧菌檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增(recombinase-aidAmplification，RAA)法的試劑材料、儀器設(shè)備、檢測(cè)程序、操作步驟、結(jié)果判定和報(bào)告、檢出限及防止污染措施。于水產(chǎn)品中副溶血性弧菌檢測(cè)。用于水產(chǎn)品副溶血性弧菌的快檢初篩。2規(guī)范性引用文件，GB4789.7食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)副溶血性弧菌檢驗(yàn)GBT分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB9489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GBT03實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)3術(shù)語(yǔ)和定義酸擴(kuò)增recombinase-aidAmplification,RAA一種利用重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA聚合酶代替了傳統(tǒng)PCR的熱循環(huán)解鏈過(guò)程，在恒溫下(一般為37℃~42℃)，進(jìn)行核酸擴(kuò)增的技術(shù)。原理RAA法利用重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA聚合酶代替了傳統(tǒng)PCR的熱循環(huán)解鏈過(guò)程。根據(jù)副溶血性弧試劑為分析純或生化試劑，實(shí)驗(yàn)用水符合GB/T6682的要求。所有試劑均用無(wú)DNAa)探針和引物血性弧菌的特異性基因序列設(shè)計(jì)探針和引物?；【结樅鸵镄蛄?5'-3')lhFTTTGGCGAACGAGAACGCAGACATTACGGATGTTGCCTGTATCAGACAAGCTGTCACCGAotlhPTTACGTTCTTCGCCGCTGACAATCGCTTCFAMdTTHFQdTACAACCACACGATSpacerCb劑1)RAA反應(yīng)緩沖液：20%PEG，280mmol/L醋酸鎂(MgAc2)。也可采用等效的商品試劑盒。6儀器和設(shè)備a)熒光檢測(cè)儀：帶有恒溫(39℃±1℃)擴(kuò)增功能的熒光檢測(cè)儀。b)微量移液器：0.1μL~2.5μL，1μL~10μL，2μL~20μL，10μL~100μL，20μL~200μL，100μL~1000μL，并配備與移液器匹配的吸頭。c式離心機(jī)：離心力≥12000g。d)恒溫水浴鍋或金屬?。?00℃±1℃。7檢測(cè)程序副溶血性弧菌實(shí)時(shí)熒光RAA檢測(cè)程序見(jiàn)圖1。8操作步驟樣品處理和增菌.1試劑盒法DNA提取試劑盒，吸取適量獲得的增菌液，按其說(shuō)明提取制備模板DNA。8.2.2煮沸法加入100μL無(wú)菌水混勻后沸水浴(或95℃金屬浴)10min，置冰上冷卻；體積(hT)S0\bEGD列V模板(S0n8\hT)qqHSOn8VcS(S80mmoI\T)hT注：(J)D列V模板量可根據(jù)不同樣品，具體情況進(jìn)行調(diào)整。(S)將除n8VcS和模板D列V以外的所有成分渦旋混勻，分裝混合液至含有凍干酶制劑的S00hT反應(yīng)管中，輕LMgAc(?)可使用等效的商品化熒光KVV試劑盒按照其說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)過(guò)程中分別設(shè)陰性對(duì)照、空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照?？瞻讓?duì)照以無(wú)菌水替代模板D列V；陰性對(duì)照以非副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株D列V作為模板D列V；陽(yáng)性對(duì)照以副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株VlCCJ\80SD列V作為模板D列V。9結(jié)果判定和報(bào)告9.1質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)9.2結(jié)果判定o確證后報(bào)告結(jié)果。1