(34)-第5.1章直接凝集試驗(yàn)

第5.1章直接凝集試驗(yàn)大家好！本節(jié)課我要跟大家一起學(xué)習(xí)的內(nèi)容是直接凝集試驗(yàn)。在介紹直接凝集試驗(yàn)之前，先讓我們一起來學(xué)習(xí)一下什么是凝集試驗(yàn)。凝集試驗(yàn)誕生于100多年前，早在1896年，Widal發(fā)現(xiàn)在一定濃度的傷寒桿菌中加入傷寒患者的血清可致傷寒桿菌發(fā)生特異的凝集現(xiàn)象，這就是著名的肥達(dá)試驗(yàn)，是最早的用于診斷病原微生物感染的免疫凝集試驗(yàn)。1900年，Landsteiner通過對特異性血凝現(xiàn)象的研究發(fā)現(xiàn)了人類的ABO血型，并因此獲得了1930年的諾貝爾醫(yī)學(xué)獎。那么，究竟什么是凝集試驗(yàn)？凝集試驗(yàn)是指細(xì)菌、螺旋體和紅細(xì)胞等顆粒性抗原或表面包被可溶性抗原（或抗體）的顆粒性載體，在適當(dāng)條件下與相應(yīng)抗體（或顆粒性抗原）特異性結(jié)合，形成肉眼可見的凝集現(xiàn)象，稱為凝集反應(yīng)(agglutination)。反應(yīng)中的抗原稱為凝集原（agglutinogen），抗體稱為凝集素（agglutinin）。（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的圖片）參與凝集反應(yīng)的抗體有IgM和IgG,IgM的凝集作用比IgG大數(shù)百倍。因此IgG類抗體常出現(xiàn)不完全(不可見)的反應(yīng)。IgG類抗體屬于不完全抗體。不完全抗體是指分子量小，雖能與抗原牢固結(jié)合，但不能起橋聯(lián)作用引起可見凝集現(xiàn)象的抗體。凝集試驗(yàn)可用于定性或半定量檢測。那么，為什么顆粒性抗原能發(fā)生凝集反應(yīng)？這是因?yàn)轭w粒性抗原在懸液中帶負(fù)電荷，周圍吸附一層與之牢固結(jié)合的正離子，外面排列了一層松散的負(fù)離子層，構(gòu)成雙層粒子云。在粒子云內(nèi)界和外界之間的電位差形成Z電位。（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的圖片）因?yàn)槟磻?yīng)只有在一定的pH和適量電解質(zhì)存在下才能發(fā)生，溶液中負(fù)離子強(qiáng)度越大，Z電位也就越大。Z電位使得各顆粒相互排斥。當(dāng)特異性抗體與相應(yīng)抗原顆粒結(jié)合時(shí)，抗體的橋聯(lián)作用克服了顆粒表面的Z電位而使顆粒聚集在一起。（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的圖片）凝集反應(yīng)中加入適量電解質(zhì)是為了破壞顆粒性抗原的雙電子層，促使凝集現(xiàn)象出現(xiàn)，也可通過酶處理改變細(xì)胞表面的化學(xué)結(jié)構(gòu)，以離心改變排斥力。反應(yīng)系統(tǒng)中顆粒濃度要適中，過大過小對凝集不利，因此通常在凝集反應(yīng)中是固定顆粒相，稀釋被檢的抗體或抗原，靈敏度高于沉淀反應(yīng)。根據(jù)顆粒性抗原的性質(zhì)，凝集試驗(yàn)分為直接凝集試驗(yàn)和間接凝集試驗(yàn)。本次課我們重點(diǎn)介紹直接凝集試驗(yàn)。（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的圖片）細(xì)菌、螺旋體、紅細(xì)胞這些本來就是顆粒性抗原，它們在適當(dāng)電解質(zhì)參與下直接與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象，稱為直接凝集試驗(yàn)。常用的直接凝集試驗(yàn)有玻片法和試管法兩種。（顯示內(nèi)容：類型：玻片法和試管法）（一）玻片凝集試驗(yàn)為定性試驗(yàn)方法。一般用已知抗體檢測菌液、紅細(xì)胞懸液等未知抗原，或者用已知顆粒性抗原測定病人血清中有無相應(yīng)抗體。（插入下圖，一直持續(xù)到介紹完下面標(biāo)紅的內(nèi)容）以紅細(xì)胞ABO血型鑒定為例：將已知抗體作為診斷血清，與受檢的紅細(xì)胞顆粒性抗原，在玻片上混合，如果抗原抗體相對應(yīng)，幾分鐘后即可用肉眼或低倍顯微鏡觀察凝集結(jié)果，看到細(xì)沙狀的顆粒出現(xiàn)，說明凝集試驗(yàn)為陽性。來看這張血型測定的圖片，在第一張反應(yīng)卡上在患者紅細(xì)胞中加入抗A抗體和抗B抗體后，均有凝集現(xiàn)象出現(xiàn)，說明該患者紅細(xì)胞表面同時(shí)表達(dá)A抗原和B抗原，故該患者的血型為AB型；在第二張反應(yīng)卡上，只有與抗B抗體反應(yīng)的紅細(xì)胞發(fā)生了凝集反應(yīng)，所以該患者的紅細(xì)胞表面表達(dá)B抗原，該患者的血型為B型。對于A型血患者而言，紅細(xì)胞表面表達(dá)A抗原，故其能與抗A抗體發(fā)生凝集反應(yīng)，而抗B抗體組不凝集。而O型血患者的紅細(xì)胞表面既不表達(dá)A抗原，也不帶表達(dá)B抗原，故不會跟兩種抗體發(fā)生凝集反應(yīng)。再看一個(gè)用玻片凝集試驗(yàn)檢測傷寒感染的例子：（插入下面的動畫，一直持續(xù)到介紹完下面標(biāo)紅的內(nèi)容）在玻片的第1個(gè)孔中加入生理鹽水作為陰性對照，在第2個(gè)孔和第3個(gè)孔中加入患者血清，在第2個(gè)孔中加入傷寒桿菌，第3個(gè)孔中加入大腸桿菌，混勻，靜置一段時(shí)間后觀察結(jié)果。如果該患者為傷寒感染患者，那么其血清中就會含有針對傷寒桿菌的抗體，那么只有第2個(gè)孔中會有凝集現(xiàn)象出現(xiàn)。此檢測方法操作簡便、快速，不僅可用于紅細(xì)胞ABO血型鑒定,也適用于從病人標(biāo)本中分離得到的菌種的診斷與分型鑒定，也可檢測病人血清中相應(yīng)的抗體。（二）試管凝集試驗(yàn)試管凝集試驗(yàn)為半定量試驗(yàn)方法，常用于抗體效價(jià)的半定量檢測。細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原與一系列稀釋的受檢血清反應(yīng)，在一定條件下會出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。通常以產(chǎn)生明顯凝集現(xiàn)象的血清最高稀釋度作為血清中抗體的效價(jià)，也稱為滴度。下面我們來看如何應(yīng)用試管凝集試驗(yàn)進(jìn)行抗體效價(jià)的半定量檢測：（插入下面的動畫，一直持續(xù)到介紹完下面標(biāo)紅的內(nèi)容）取6支試管，在其中分別加入1ml生理鹽水，然后在第一支試管中加入1ml抗體，混勻后，吸出1ml加入到第2支試管中，混勻后，再吸出1ml加入到第3支試管中，重復(fù)前面的操作，直到加到第5支試管中，混勻，吸出1ml液體，棄掉。這時(shí)候，從第一管到第五官的抗體稀釋度依次為1：2、1：4、1：8、1：16、1：32。緊接著，在6支試管中均加入1ml抗原，混勻，這個(gè)時(shí)候抗體的稀釋度應(yīng)該為1:4、1：8、1：16、1：32、1：64。（插入下面的動畫，一直持續(xù)到介紹完下面標(biāo)紅的內(nèi)容）靜置一定的時(shí)間，觀察試管中是否有凝集現(xiàn)象出現(xiàn)。在該試驗(yàn)中，產(chǎn)生明顯凝集現(xiàn)象的血清最高稀釋度為1：16，故該抗體的效價(jià)為1：16。在試管凝集試驗(yàn)中，由于電解質(zhì)濃度和pH不適當(dāng)?shù)仍?，可引起抗原發(fā)生非特異性凝集，出現(xiàn)假陽性，因此實(shí)驗(yàn)時(shí)必須設(shè)不加抗體的稀釋液作為對照。（介紹下面標(biāo)紅的的內(nèi)容時(shí)插入下面的文字）臨床上常用的直接試管凝集試驗(yàn)為肥達(dá)(widal)試驗(yàn)和外一斐(weil—FeliX)試驗(yàn)，可用于診斷傷寒、斑疹傷寒、恙蟲病等立克次體感染，了解抗體及其含量。在輸血時(shí)也常用于受體和供體之間的紅細(xì)胞和血清的交叉配血試驗(yàn)。此外，基于方法建立的瑞特試驗(yàn)還被用于布魯氏菌的診斷。（插入下面的圖片，一直持續(xù)到介紹完下面標(biāo)紅的內(nèi)容）精子抗體的測定也可