授課31菊花組織培養(yǎng)

現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三植物的組織培養(yǎng)現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三

菊花是菊科菊屬的多年生宿根草本植物,是我國(guó)的傳統(tǒng)名花和世界四大切花之一。長(zhǎng)期以來(lái)菊花采用分株、扦插等無(wú)性繁殖方法進(jìn)行繁殖。但是傳統(tǒng)的繁殖方法易受環(huán)境影響,繁殖周期長(zhǎng),隨著市場(chǎng)需求的急劇增加,已經(jīng)不能滿足市場(chǎng)日益發(fā)展的需要。

植物組織培養(yǎng)屬于無(wú)性生殖中營(yíng)養(yǎng)生殖營(yíng)養(yǎng)生殖包括：現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三扦插現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三嫁接現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三壓條

現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三一、基礎(chǔ)知識(shí)1、細(xì)胞分化（1）概念：在生物個(gè)體發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能上產(chǎn)生穩(wěn)定性差異的過(guò)程。（2）特點(diǎn)：持久性：發(fā)生在整個(gè)生活活動(dòng)過(guò)程中，胚胎期分化程度達(dá)到最大。不可逆性：穩(wěn)定性：分化過(guò)程，遺傳物質(zhì)是不變的，穩(wěn)定的。（3）原因：（4）結(jié)果：基因選擇性表達(dá)的結(jié)果產(chǎn)生不同的組織和器官現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三2、植物細(xì)胞的全能性（1）概念：（2）比較：（3）原因：（４）表達(dá)的條件：高度分化的植物細(xì)胞，仍具有發(fā)育成完整植株的潛能。體細(xì)胞中：分生區(qū)細(xì)胞＞成熟區(qū)細(xì)胞高度分化的動(dòng)物體細(xì)胞全能性受到限制，但體細(xì)胞核仍具有全能性。受精卵＞生殖細(xì)胞＞體細(xì)胞體細(xì)胞都是通過(guò)有絲分裂由同一個(gè)受精卵增殖形成的，遺傳物質(zhì)（染色體）相同，攜帶有本物種的全部遺傳信息。離體、在一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、激素和其它外界條件(適宜的溫度、PH值、光照等)才能表達(dá)?，F(xiàn)在是9頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三3、植物組織培養(yǎng)（1）概念：（2）過(guò)程：人工種子植株外植體愈傷組織胚狀體脫分化再分化加上人工種皮是指離體的植物器官、組織或細(xì)胞，在無(wú)菌條件下，通過(guò)脫分化和再分化形成完成植株的過(guò)程?，F(xiàn)在是10頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三（3）植物組織培養(yǎng)細(xì)胞離體①必要條件：一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件②原理:細(xì)胞的全能性A.外植體：從活植物體上切下進(jìn)行培養(yǎng)的那部分細(xì)胞、組織或器官.③相關(guān)概念:現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三B愈傷組織：離體的植物器官、組織或細(xì)胞通過(guò)脫分化形成的疏松而無(wú)規(guī)則的，高度液泡化的呈無(wú)定形狀態(tài)的,未分化的薄壁細(xì)胞2-3周，愈傷組織開(kāi)始形成。現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三菠蘿的愈傷組織現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三C脫分化（去分化）：已經(jīng)分化的植物器官、組織或細(xì)胞產(chǎn)生愈傷組織的過(guò)程。

(已經(jīng)分化的植物器官、組織或細(xì)胞，當(dāng)受到創(chuàng)傷或進(jìn)行離體（也受到創(chuàng)傷）培養(yǎng)時(shí)，已停止分裂的細(xì)胞，又重新恢復(fù)分裂，細(xì)胞改變?cè)械姆只癄顟B(tài)，失去原有結(jié)構(gòu)和功能，成為具有未分化特性的細(xì)胞。)現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三D再分化：愈傷組織繼續(xù)培養(yǎng)，重新分化成根和芽等器官的過(guò)程。

3-5周之后，誘導(dǎo)出的新葉片和芽?，F(xiàn)在是15頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三E胚狀體：具有胚根和胚芽的結(jié)構(gòu)胚狀體包裹著人工胚乳和人工種皮可以制成人工種子?，F(xiàn)在是16頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三二、影響植物組織培養(yǎng)的因素環(huán)境條件：適宜光照、溫度、PH外因內(nèi)因：植物種類，同一種植物材料的年齡、保存時(shí)間的長(zhǎng)短

，營(yíng)養(yǎng)：礦質(zhì)元素：大量元素，微量元素植物激素：細(xì)胞分裂素，生長(zhǎng)素

有機(jī)物：蔗糖、氨基酸等環(huán)境條件：適宜光照、溫度、PH營(yíng)養(yǎng)：礦質(zhì)元素：大量元素，微量元素植物激素：細(xì)胞分裂素，生長(zhǎng)素

有機(jī)物：蔗糖、氨基酸等環(huán)境條件：適宜光照、溫度、PH營(yíng)養(yǎng)：礦質(zhì)元素：大量元素，微量元素植物激素：細(xì)胞分裂素，生長(zhǎng)素

有機(jī)物：蔗糖、氨基酸等環(huán)境條件：適宜光照、溫度、PH營(yíng)養(yǎng)：礦質(zhì)元素：大量元素，微量元素植物激素：細(xì)胞分裂素，生長(zhǎng)素

有機(jī)物：蔗糖、氨基酸等環(huán)境條件：適宜光照、溫度、PH營(yíng)養(yǎng)：礦質(zhì)元素：大量元素，微量元素植物激素：細(xì)胞分裂素，生長(zhǎng)素

有機(jī)物：蔗糖、氨基酸等環(huán)境條件：適宜光照、溫度、PH營(yíng)養(yǎng)：礦質(zhì)元素：大量元素，微量元素植物激素：細(xì)胞分裂素，生長(zhǎng)素

有機(jī)物：蔗糖、氨基酸等現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三2、影響植物組織培養(yǎng)的因素（1）植物材料的選擇煙草和胡蘿卜的組織培養(yǎng)較為容易枸杞愈傷組織的芽誘導(dǎo)比較難同一植物材料的年齡、保存時(shí)間的長(zhǎng)短會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果菊花的組織培養(yǎng)一般選擇未開(kāi)花植株的莖上部新萌生的側(cè)枝現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三（2）離體的植物組織和細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境等條件的要求相對(duì)特殊，需配置不同的培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基主要成分包括：A、大量元素:N、P、S、K、Ca、Mg等B、微量元素:B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co等C、有機(jī)物現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三討論：你能說(shuō)出各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的作用嗎？同專題2中微生物培養(yǎng)基的配方相比，MS培養(yǎng)基的配方有哪些明顯的不同？答：微生物培養(yǎng)基以有機(jī)營(yíng)養(yǎng)為主。與微生物的培養(yǎng)不同，MS培養(yǎng)基則需提供大量無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)，無(wú)機(jī)鹽混合物包括植物生長(zhǎng)必須的大量元素和微量元素兩大類。

現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三2、高等植物是光能自養(yǎng)型生物，為什么在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中還需要提供有機(jī)物培養(yǎng)基？？此時(shí)的組織或細(xì)胞為離體的，細(xì)胞所生活的環(huán)境為液體有機(jī)物營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，而不能體現(xiàn)其整個(gè)植物體的光能自養(yǎng)。思考現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三①常用的植物激素：生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素和赤霉素生長(zhǎng)素類：2，4－二氯苯氧乙酸（2，4－D）、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）細(xì)胞分裂素類：激動(dòng)素（KT）、6－芐基嘌呤（6－BA）、玉米素（ZT）赤霉素類：赤霉酸（GA3）（3）植物激素的影響現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三②生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素作用植物中生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素是啟動(dòng)細(xì)胞分裂、脫分化和再分化的關(guān)鍵性激素。在生長(zhǎng)素存在的情況下，細(xì)胞分裂素的作用呈現(xiàn)加強(qiáng)的趨勢(shì)使用順序?qū)嶒?yàn)結(jié)果先使用生長(zhǎng)素，后使用細(xì)胞分裂素有利于細(xì)胞分裂，但不利分化先使用細(xì)胞分裂素后使用生長(zhǎng)素細(xì)胞既分裂也分化同時(shí)使用分化頻率高現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三生長(zhǎng)素細(xì)胞分裂素：>有利于根的分化生長(zhǎng)素細(xì)胞分裂素：<有利于芽的分化，抑制根的分化生長(zhǎng)素細(xì)胞分裂素：＝促進(jìn)愈傷組織生長(zhǎng)③生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素同時(shí)使用，用量的比例對(duì)植物細(xì)胞發(fā)育方向的影響（4）pH、溫度、光照pH控制在5.8左右，溫度控制在18－22。C,每日用日光燈照射12h.現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三3、植物組織培養(yǎng)過(guò)程:離體組織或細(xì)胞植物體脫分化細(xì)胞分裂素≈生長(zhǎng)素愈傷組織芽根細(xì)胞分裂素>生長(zhǎng)素細(xì)胞分裂素<生長(zhǎng)素再分化植物細(xì)胞培養(yǎng)不需要光?需要光現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三同常規(guī)的無(wú)性繁殖方法相比，組織培養(yǎng)快速繁殖法主要具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）快速。采用常規(guī)的方法如分株法，一棵花卉一年一般只能生產(chǎn)幾株或幾十株，但用組織培養(yǎng)的方法則每年可以繁殖出幾萬(wàn)甚至數(shù)百萬(wàn)的小植株。（2）周年生產(chǎn)?；ɑ芙M織培養(yǎng)快速繁殖是在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，因條件可控，所以不受季節(jié)限制，可以全年進(jìn)行連續(xù)生產(chǎn)。而常規(guī)的無(wú)性繁殖則受季節(jié)限制，只能在花卉生長(zhǎng)季節(jié)進(jìn)行繁殖。（3）經(jīng)濟(jì)效益高。花卉組織培養(yǎng)快速繁殖所需要的空間小，在一個(gè)200平方米的培養(yǎng)室內(nèi)一年可生產(chǎn)試管苗上百萬(wàn)株。如按每株1元計(jì)算，每年產(chǎn)值上百萬(wàn)元。（4）以組織培養(yǎng)繁殖的種苗與母株有著相同的遺傳基因。所以使用這項(xiàng)技術(shù)可讓優(yōu)良的品種不斷地延續(xù)。組織培養(yǎng)與常規(guī)繁殖相比優(yōu)點(diǎn)眾多現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三二、實(shí)驗(yàn)操作（一）制備MS固體培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基包括20多種營(yíng)養(yǎng)成分，實(shí)驗(yàn)室一般使用4。C保存配制好的培養(yǎng)基母液來(lái)制備.1、配置各種母液現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三①無(wú)機(jī)物中大量元素濃縮10倍，微量元素濃縮100倍，常溫保存.②激素類、維生素類以及用量較小的有機(jī)物一般可按1mg/ml的質(zhì)量濃度單獨(dú)配制成母液.③用母液配制培養(yǎng)基時(shí)，需要根據(jù)各種母液的濃縮倍數(shù)，計(jì)算用量.現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三2、配置培養(yǎng)基分裝到錐形瓶中，每瓶分裝50ml或100ml.①配制培養(yǎng)液②調(diào)PH③培養(yǎng)基的分裝由于菊花的莖段的組織培養(yǎng)比較容易，因此不必添加植物激素.現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三3、滅菌分裝好的培養(yǎng)基連同其他器械一起進(jìn)行高壓蒸汽滅菌.1、選材：菊花莖段，取生長(zhǎng)旺盛的嫩枝.（二）外植體消毒2、消毒①流水沖洗菊花莖段用流水沖洗后可少許洗衣粉，用軟刷輕輕刷洗，刷洗后在流水下沖洗20min左右.現(xiàn)在是33頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三②酒精處理用無(wú)菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入體積分?jǐn)?shù)為70％的酒精中搖動(dòng)2－3次，持續(xù)6－7s，立即將外植體取出，在無(wú)菌水中清洗.③消毒液處理取出后用無(wú)菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的氯化汞溶液中1－2min，取出后在無(wú)菌水中至少清洗3次，漂凈消毒液.現(xiàn)在是34頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三（三）接種污染的主要來(lái)源是空氣中的細(xì)菌和孢子，接種室消毒是至關(guān)重要的。用70％的酒精噴霧使空氣消毒，酒精或新潔爾滅搽洗工作臺(tái)并用紫外線照射20分鐘1、接種室消毒2、無(wú)菌操作要求操作要在酒精燈火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼燒滅菌，接種后立即蓋好瓶蓋。3、材料的切取和接種現(xiàn)在是35頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是36頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三4、接種注意事項(xiàng)①每接種一塊外植體前，鑷子需放入體積分?jǐn)?shù)為75％的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精燈火焰上燒一遍，冷卻后再接種.②外植體在培養(yǎng)基中要分布均勻，放置外植體數(shù)量根據(jù)錐形瓶的大小確定，一般胡蘿卜3－4塊，菊的莖或葉6－8塊，也不要太少，以充分利用培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分和光照條件.③插入時(shí)應(yīng)注意方向，不要倒插。莖段、莖尖基部插入培養(yǎng)基利于吸收水分和養(yǎng)分.現(xiàn)在是37頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三1、培養(yǎng)基的滅菌（高壓蒸汽滅菌）2、外植體的消毒（酒精、氯化汞）3、接種的無(wú)菌操作（酒精、酒精燈——灼燒）4、無(wú)菌箱中的培養(yǎng)；5、移栽到消過(guò)毒的環(huán)境中生存一段時(shí)間。在整個(gè)操作過(guò)程中，是如何來(lái)實(shí)現(xiàn)無(wú)菌環(huán)境的？現(xiàn)在是38頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三思考：你打算做幾組重復(fù)？你打算設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)嗎？答：每種材料或配方至少要做一組以上的重復(fù)。設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)可以取用一個(gè)經(jīng)過(guò)滅菌的裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，與接種操作后的錐形瓶一同培養(yǎng)，用以說(shuō)明培養(yǎng)基制作合格，沒(méi)有被雜菌污染。現(xiàn)在是39頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三（四）培養(yǎng)1、愈傷組織的培養(yǎng)從接種外植體到出現(xiàn)愈傷組織需經(jīng)過(guò)2周時(shí)間。2周之內(nèi)可以看到外植體上逐漸長(zhǎng)出乳白色或黃白色的瘤狀愈傷組織。首次培養(yǎng)愈傷組織時(shí)，恒溫箱的門應(yīng)該關(guān)閉不必見(jiàn)光，因?yàn)樵跓o(wú)光條件下愈傷組織長(zhǎng)的更快。2周后，培養(yǎng)基成分接近耗盡，必須更換培養(yǎng)基，進(jìn)行繼代培養(yǎng).現(xiàn)在是40頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三繼代培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)愈傷組織的相同，在嚴(yán)格的無(wú)菌條件下，將愈傷組織連同原來(lái)的外植體一起移到新培養(yǎng)基上。愈傷組織的繼代培養(yǎng)一代為20d。如果延長(zhǎng)時(shí)間，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少，外植體會(huì)分泌有毒物質(zhì)，造成自身中毒。如果愈傷組織長(zhǎng)到直徑為1－1.5cm時(shí)，就可以進(jìn)行試管苗培養(yǎng)，否則還需進(jìn)行第二代繼代培養(yǎng).2、愈傷組織的繼代培養(yǎng)在愈傷組織繼代培養(yǎng)期間，將恒溫箱的門打開(kāi)，讓愈傷組織見(jiàn)光，愈傷組織見(jiàn)光后顏色可以轉(zhuǎn)為綠色.現(xiàn)在是41頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三3、試管苗的培養(yǎng)當(dāng)愈傷組織長(zhǎng)到一定大小后，可以更換培養(yǎng)基，進(jìn)行試管苗的見(jiàn)光培養(yǎng).（五）移栽移栽生根的菊花試管苗之前，應(yīng)先打開(kāi)培養(yǎng)瓶的封口膜，讓試管苗在培養(yǎng)間生長(zhǎng)幾日.1、打開(kāi)封口膜2、清洗轉(zhuǎn)移用流水清洗根部的培養(yǎng)基，將幼苗移植到消過(guò)毒的蛭石或珍珠巖等環(huán)境下生活一段時(shí)間.現(xiàn)在是42頁(yè)\一共有49頁(yè)\編輯于星期三（六）栽培3、移栽珍珠巖：固體基質(zhì)型，含水量高、蓄水性強(qiáng)、透性好，適合栽培.幼苗長(zhǎng)壯后，移栽到土壤中.幼苗移栽后，每天觀察并記錄幼苗的生長(zhǎng)情況，適時(shí)澆水、施肥，直