DB32T 3681-2019小麥產(chǎn)毒鐮刀菌種群分子分型技術(shù)規(guī)范

江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布ICS65.020.01B16江蘇省地DB32方標(biāo)準(zhǔn)DBT3681—2019Technicalspecificationformoleculartypingoftoxinproducingfusariumspeciesinwheat前言GBT草。草單位：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。小麥產(chǎn)毒鐮刀菌種群分子分型技術(shù)規(guī)范本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了小麥產(chǎn)毒鐮刀菌種群以及產(chǎn)毒素化學(xué)型區(qū)分中鐮刀菌DNA的提取、PCR擴(kuò)增、電泳果判定方法和操作規(guī)范。用于產(chǎn)毒鐮刀菌種群及產(chǎn)毒化學(xué)類(lèi)型的定性PCR檢測(cè)。范性引用文件凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB9.15食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)GBT分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法原理4試劑和材料4.3CTAB緩沖液:55mmol/LCTAB、1400mmol/L氯化鈉(NaCl)、20mmol/LEDTA、100mmol/LTrisHClpH8.0)，121℃高壓滅菌20min，儲(chǔ)存于2℃~8℃。4.5RNA酶溶液(5μg/μL)。4.6蛋白酶K(20mg/mL)。4.8酚：三氯甲烷：異丙醇(25：24：1)；三氯甲烷：異戊醇(24：1)。9異丙醇。4.10區(qū)分禾谷鐮刀菌和亞洲鐮刀菌引物FgF5′-CTCCGGATATGTTGCGTCAA-3′FgR5′-GGTAGGTATCCGACATGGCAA-3′TriCON′-GACTGCTCATGGAGACGCTG-3′Tri3ADON:5′-TCCTCATGCTCGGTGGACTCG-3′TriNIV′-GTAGGTTCCATTGCTTGTTC-3′.12無(wú)水乙醇。13DNALadder：可以清楚區(qū)分100bp~1000bp的DNA片段。容至2L。分裝后高壓滅菌備用。使用時(shí)用水稀釋成1×TAE電泳緩沖液(工作液)。17加樣緩沖液。18瓊脂糖。.19溴化乙錠。主要儀器和設(shè)備PCR擴(kuò)增儀：升降溫速度>1.5℃/s，孔間溫度差異<1.0℃。泳槽、電泳儀等電泳裝置。箱。檢測(cè)樣品制備與培養(yǎng)nmL°C保存)1區(qū)分禾谷鐮刀菌和亞洲鐮刀菌檢測(cè)1PCR反應(yīng)體系水—1×2.5μLmmolL氯化鎂溶液1.5μLdNTPs混合溶液(各2.5mmol/L)2.0μLmolL0.75μLmolL0.75μL0.025U/μL—DNAL2.0μL25.0μL2PCR反應(yīng)程序3PCR結(jié)果檢測(cè)用電泳緩沖液(1×TAE)制備2%瓊脂糖凝膠(55℃~60℃時(shí)加入溴化乙錠至終濃度為0.5μg/ml，6.3.2.1PCR反應(yīng)體系水—1×2.5μLmmolL氯化鎂溶液1.5μLdNTPs混合溶液(各2.5mmol/L)2.0μLmolL0.75μLmolL0.75μLmolL0.75μLmolL0.75μL0.025U/μL—DNAL2.0μL25.0μLPCR溶液，根據(jù)TaqDNA聚合酶的濃度6.3.2.2PCR反應(yīng)程序PCR結(jié)果檢測(cè)用電泳緩沖液(1×TAE)制備2%瓊脂糖凝膠(55℃~60℃時(shí)加入溴化乙